【毕业学位论文】（Word原稿）马铃薯晚疫病菌遗传多样性及其小种特异无毒基因遗传定位和转录表达谱研究蔬菜学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 马铃薯晚疫病菌遗传多样性及其小种特异无毒基因遗传定位和转录表达谱研究 n P. . I 摘 要 我国是世界上马铃薯第一生产大国，到 2001 年马铃薯种植面积达 472 万公顷，占全球种植面积的 25%左右，亚洲种植面积的 60%左右。马铃薯在全国的 22 个省、市、自治区均有种植，其中 内蒙古自治区是我国重要的马铃薯种薯产地 和栽培面积最大的地区，目前马铃薯正在逐步成为内蒙古农业的重要支柱产业。 由致病疫霉（ 起的马铃薯晚疫病是 当前内蒙地区 马铃薯生产中最严重的病害 。本研究通过对从内蒙古不同马铃薯主栽区、不同年份采集的马铃薯晚疫病菌株进行病菌基因型和表现型多样性分析， 以期建立起我国马铃薯晚疫病菌的分子基因型研究和为防治内蒙马铃薯晚疫病提供理论依据。 近年来 ，世界 上 许多植物病理学家着手于 致病疫霉 病原菌，特别是病菌的 毒性 因子和 非毒性因子的研究，希望从病 原 的角度揭示其致病机制和寄主抗性机制， 为 马铃薯晚疫病 的防治提供理论基础 。病菌的无毒基因（ 因）是非 毒性 因子研究中的热点。 根据 “基因对基因”学说，马铃薯 于马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因的最新研究成果，本论文从基因组学和 转录组学方面对病菌无毒基因进行了进一步的研究，为马铃薯晚疫病无毒基因的克隆奠定基础。具体结果如下： 1对 国内 51个马铃薯晚疫病菌株（ 其中 40个来自内蒙）和 9个来自国外的参照菌株进行表现型和基因型多样性分析。表现型多样性从 供试 菌株的交配型和生理小种组成进行分析；利用粒体 因型多样性。除云南 菌株 2交配型外，所有供试菌株均为 在 38个内蒙被测菌株中，共发现 18个生理小种，其中以小种 3,4,7,10； 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11； 3,4,6,7,10发生频率较高，分别占被测菌株的 表明在内蒙已出现了优势生理小种。 所有来自中国北部地区的 48个病菌（ 线粒体 中包括内蒙古的 40个菌株；来自云南的 3个菌株具有 2种不同线粒体 由此推测 过对 国内 被测菌株的 发现 4种基因型 有内蒙菌株 无差异存在，说明它们属于同一无性系； 其他来自中国北部地区的 8个菌株也具有同样的 来自云南的 3个菌株的具有各自独特的基因型， 分别为 利用 有菌株可划分为 28个 均每 2个菌株为一特有的基因型，这 28个基因型分布于 4个组中。 交配型、生理小种、 线粒体 以马铃薯晚疫病菌 80029和 88133为亲本的杂交组合 1代群体为试材， 利用 荧光术构建了一个马铃薯晚疫病菌 P. 谱总图距 994含 167个 记间平均距离 3利用 荧光 合 分离群体分组分析法 (以 杂交组合 1代 50个菌株 群体为试材， 获得 5个与 进行菌株个体验证，分析表明 5个标记中有 2个标记 （ 23与 1代中共分离，无交换重组发生。将 . 上述两个目的片段回收纯化并克隆测序，通过 4通过计算机模拟分析和设计实验对马铃薯晚疫病菌 定限制性内切酶组合 个；利用 具有 6个无毒基因不同表现型 且处于萌发中 的静孢子时期的 马铃薯晚疫病菌构建 4个混合池 ，通过 共获得 99个与无毒基因 相 关的差异表达片段， 其中 与 关的为 28个 ， 5个 ，3个 ， 3个。 5 利用 9个 无毒基因相关片段进行序列比对分析，以 8条 38%) 与马铃薯晚疫病菌的 有显著同源性 ； 利用相似性分析， 46条 46%) 与已知蛋白具有相似性，以 值 ， 30条 有 45条 P. 列比对分析获得的相似蛋白主要具有以下功能：能量的产生、蛋白的合成、信号传导、转录调节等。 通过对 25个 无毒基因相关 得了 条（ 无毒基因 条 ( 关键词： 马铃薯晚疫病菌；多样性分析；无毒基因；遗传定位；转录表达谱 t is is in Up 001, 5% of in 0% of 2 is of to a is In . of is to . to a on . on of to of . of is a In P. . a in vr by on of vr . in we at vr in as 1. A 1 . 40 997 003, of of on NA as as In to 12 2 1 In 8 8 ,4,7,10 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ,4,6,7,10 8 NA a Ib Ia 0 SR G1 to SR SR of 0 IV in a 8 so a NA or of 2. A . 07 F1 80029 X 88133). 2 a 94167 3. to in 1 . 1 to to 56 in 0 1 23of to in No or 4. a to . in in . 9 8 25 23 3 5. 38 9 38%) . DF . ST in a in 46 9 46%) to 17 6 DF 30 6 to 45 to ST or to in . V 目 录 第一章 文献综述 1 1 马铃薯晚疫病的重要性和危害性 1 2 马铃薯晚疫病病原 1 于卵菌 1 原生活史 2 3 马铃薯晚疫病菌表现型和基因型多样性 研究 4 铃薯晚疫病菌表现型结构的研究 4 铃薯晚疫病菌基因型多样性的研究 5 4 P. 马铃薯互作的分子基础研究 7 . 铃薯 “基因对基因 ”互作的基因组学 7 P. 9 第二章 论文设计 12 1 立题依据 12 蒙古马铃薯晚疫病菌表现型和基因型多样性分析 12 铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因的遗传定位及转录表达谱分析 12 2 研究目的 13 3 预期目标 14 4 总体设计 14 4 1 中国内蒙地区马铃薯晚疫病菌表现型和基因型多样性分析 14 4 2 马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因的遗传定位及基因表达分析 15 第三章 中国内蒙古地区马铃薯晚疫病菌表现型和基因型多样性分析 16 1 引言 16 2 材料与方法 17 验材料 17 法 17 3 结果和分析 19 菌交配型 19 菌生理小种鉴定结果 19 菌线粒体 倍型分析 19 菌 析 20 菌 析 21 4 讨论 22 小结 24 第四章 马铃薯晚疫病菌遗传图谱的构建与分析 28 1 引言 28 2 材料与方法 28 试菌株 28 铃薯晚疫病菌基因组 取 29 析 29 据处理 30 3. 结果与分析 30 记在亲本和 体间多态性分析 30 锁图谱的构建 31 4 讨论 34 5 小结 36 第五章 马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因 遗传定位 37 1 引言 37 2 材料与方法 37 试菌株 37 分析 38 铃薯晚疫病菌基因组 取 38 析 38 的标记片段的克隆测序 38 3 结果和分析 38 4 个池之间马铃薯无毒基因 选标记的筛选 38 与 锁的 记的验证 39 马铃薯晚疫病菌 定位 40 记的回收、克隆及测序 40 4 讨论 41 5 小结 41 第六章 利用 术鉴定无毒基因的候选表达序列 43 1 引言 43 2 材料与方法 44 试菌株 44 分析 45 取和双链 合成 45 异显示分析 45 异表达片段回收及克隆测序 46 析 46 毒基因相关片段在病菌个体上的验证 46 析 46 3 结果与分析 47 铃薯晚疫病菌 析引物组合及选择性碱基的选择 47 析 47 列分析 49 毒基因相关 个体上的验证 49 析 50 个 无毒 基因候选片段的序列分析及功能注释 51 4 讨论 52 5 小结 53 第七章 结论与综合讨论 57 1 主要结论 57 蒙马铃薯晚疫病菌表现型和基因型多样性分析 57 铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因定位研究 58 铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因的转录表达谱研究 58 2 综合讨论 59 国马铃薯晚疫病菌 配型与病害流行 59 离马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因的策略探讨 60 铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因的应用前景 62 后我国马铃薯晚疫病菌研究的几点看法 63 续工作 64 参考文献 65 致 谢 78 作者简历 80 中国农业科学院博士学 位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 1 马铃薯晚疫病的重要性和危害性 晚疫病是 马铃薯最严重的 病害，在全球范围内绝大多数栽培马铃薯的地区广泛传播。 1845年， 爱尔兰 马铃薯晚疫病大爆发并且大流行，造 成 全国 800 万人口 中 的 100 万饿死，另外 150 万人背井离乡。进入 20 世纪 80 年代，晚疫病在世界各地的频频发生，再次引起国际社会的极大关注 （ et 1993） 。早在 1992 年，国际马铃薯中心 (根据各国权威科学家的建议将晚疫病列为 先研究目标。联合国粮农组织 1996 年的年度报告认为，晚疫病的危害性、防治难度及对社会影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害。为加强对晚疫病的协作研究， 1996 年， 立 了国际马铃薯晚疫病研究协作网。中国是世界上生产 马铃薯 的第一大国， 现在全国种植面积 470 多万公顷，总产量 7000 多万吨（屈冬玉等， 2004） 。据估计，中国每年因晚疫病损失 近 10 亿美元 ， 全世界范围内由晚疫病造成的损失和为防治晚疫病所需要的花费大约每年 在 50 亿美元左右（ 999）。 2 马铃薯晚疫病病原 于卵 菌 P. 被 划分在 ， ， ， ， 。虽然卵菌有很多类似真菌的特性，但是它不再划分为真菌（ 983; 995）。根据细胞壁组成（ 983），新陈代谢（ et 1964; et 1990） ， 列研究表明，卵菌与金藻，硅藻，黄褐藻 的亲缘关系较近，而与真菌有较远的亲缘关系（图 1） 。同一般的植物真菌相比，卵菌具有不同于真菌的能够自主侵染植物的能力。这表 明卵菌具有与真菌截然不同的遗传和生化互作机制。更加有趣的是，同真正的真菌相比，许多卵菌的生物学特点是特有的（ 1983; et 1992）。卵菌的生活史主要以二倍体存在，而真菌却是以单倍体的形式存在。具有多核的 种基本上没有或 有 非常少的隔片。 的病菌的细胞壁由纤维素和葡聚糖组成，没有几丁质， 然 而几丁质是组成真菌细胞壁的共有成分（ 1983）。游动孢子具有双鞭毛，鞭毛 具有鞭绳和金色的鞭 鞘 （ 1983）。 种的病菌由于自己不能合成甾酮，所以它们必须从外界获得外源 1970; 1983）。同时， 的成员对多烯抗生素如匹马菌素和制霉菌素具有独特抗性（ 1962）。 另外一个有趣的特征是它有双核孢子囊和菌丝细胞，但是游动孢子是单核的中国农业科学院博士学 位论文 第一章 文献综述 2 （ 1996）。 病 菌小种每个细胞有两个或多个不同的核，称之为多核体。当具有两种不同基因型的菌株的菌丝融合后，接着它们的核混合在一起，这样就形成了多核体（ 1990）。是否这种通常称之为拟有性生殖的繁殖方式能够产生马铃薯晚疫病菌新的致病生理小种目前尚未可知。试图通过病菌在植株上生长过程中获得菌丝融合目前没有成功（ 1997; 1998）。然而，通过把两种不同生理小种的游动孢子混合在一起，就能够获得异核和多核的生理小种（ 1998）。 （ 1999）研究表明通过把具有不同抗生素抗性基因的病菌小种进行原生质体融合也能够产生具有独特表型特征的异核病菌小种。所有这些研究结果表明：拟有性生殖是马铃薯晚疫病菌产生遗传多样性的重要生殖方式。 图 1 根据生物 单位序列相似度划分的生物发展史 1 on ： 卵菌和属于真菌的担子菌和子囊菌被加粗，从系统树可 以看出，卵菌与真菌具有较远的亲缘关系。 in 原生活史 P. 于活体营养性（ 病卵菌（ 1991） ， 寄