【毕业学位论文】（Word原稿）水稻转化酶基因家族的进化及其在干旱胁迫下的表达调控作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 水稻转化酶基因家族的进化及其 在干旱胁迫下的表达调控 i 摘 要 转化酶（ 蔗糖代谢中的关键酶，它催化蔗糖不可逆水解成葡萄糖和果糖。在高等 植物中有两个不相关的基因家族参与合成转化酶的所有同功酶 :酸性转化酶基因家族（位于细胞壁和液泡）和中性 /碱性转化酶基因家族（被认为在细胞质中）。这里，以水稻品种 一个细胞壁组 ( 一个液泡组 (和两个古老的中性 /碱性组 ( 组 , 组 并在基因序列分析的基础上推测出编码蛋白的亚细胞位置，同时在内元 因复制与丢失以及转录表达等多个方面系统研究了酸性转化酶和中性 /碱性转化酶基因家族 的进化。不同于结构相对保守的中性 /碱性转化酶家族，酸性转化酶家族在进化过程中经历了多次内含子丢失，而且在转录上也显示了较大的时空表达的多样性。 本研究重点分析了酸性转化酶基因家族多样性的可能原因。合成果聚糖的酶被认为是由液泡转化酶进化而来，那么水稻的 此我们首先研究了这两个液泡转化酶基因。水稻不能积累果聚糖，然而果聚糖在一些相近的谷类作物（例如大麦和小麦）应对干旱胁迫的过程中发挥重要作用。因此，本研究对它们的酶学特 性、蛋白序列的相关关系以及它们在干旱胁迫下的表达调控作了逐步的分析。在酵母 果糖水解酶活性， 1， 1果糖水解酶活性。相反的， 果糖水解酶活性，这一特性使得果聚糖积累成为可能。 一点进一步支持了上述观点。但 是 果聚糖果糖基转移酶 1是受干旱和 此可以得出结论：在 稻没有果聚糖是因为这些改变大都发生于 稻的原始祖先中分离出来之后。 细胞壁转化酶在高等植物碳水化合物的转运中发挥重要作用。在抽穗期我们对相关基因8在剑叶、 主穗、花药和穗颈中都有程度不同的表达。没有一个基因在剑叶中表现对干旱的敏感性，然而所有基因的表达在花药和穗颈中都显著地受干旱胁迫抑制，并且受到复水诱导。这一点充分显示了转化酶基因，作为一类基因，在库组织中表达时，对干旱胁迫的反应具有很大的保守性。这里，通过 果显示在所有受干旱胁迫抑制的细胞壁转化酶基因中，只有 一在穗颈伸长的过程中最早被关闭的一个转化酶基因，和穗颈伸长紧密相关。因此可以 得出结论：干旱胁迫和细胞壁转化酶基因表达下调所引起的同化物向花药以及穗颈等组织的分配受阻密切相关。 关键词：水稻，细胞壁，液泡，细胞质，原位杂交 of to of in to be in ( ( of to be of of as of of of I on of of to I or a of in as an in of I in of of in to in mM 10mM of 1,1 By a a is by my of in by of is to be by I of in of in of of of of an in to I of at to in of in by by in or as a to a to in I in in to be as is to I is of to of in 目 录 摘 要 I . . 第一章 绪论 1 . 1 化酶的生化特性及分布 . 1 码转化酶的基因：酸性 转化酶基因家族和中性 /碱性转化酶基因家族 . 3 . 6 化酶在植物糖代谢中的作用 . 9 语 . 10 . 11 稻对干旱胁迫的高度敏感性：抽穗延迟 . 11 . 11 稻转化酶：穗颈伸长及其调控的分子剖析 . 12 的意义 . 12 第二章 水稻两个基因家族的结构、进化以及表达分析 . 14 料与方法 . 14 料 . 14 法 . 14 果 . 15 9个水稻转化酶基因的发现 . 15 稻转化酶基因的确定和分类 . 15 稻转化酶进化分析：蛋白序列 . 16 稻转化酶进化分析：外元 . 19 稻转化酶基因的表达 . 24 论 . 26 稻和拟南芥转化酶的进化比较 . 26 胞壁转化酶亚细胞定位的预测 . 27 泡转化酶的亚细胞定位机理研究 . 30 性 /碱性转化酶的亚细胞定位 . 31 种转化酶基因的表达和功能研究 . 33 性和中性 /碱性转化酶空间结构预测 . 34 性和中性 /碱性转化酶的进化对比 . 35 第三章 水稻液泡转化酶的特性、调控及其引发的果聚糖进化 . 36 料与方法 . 36 料 . 36 法 . 36 果 . 38 分泌和确认 . 38 组蛋白 酶学特性 . 38 子叶植物的液泡转化酶和果聚糖果糖基转移酶的进化分析 . 44 . 44 论 . 49 泡转化酶基因家族内催化性质 的变化 . 49 子叶植物液泡转化酶家族的 析 . 49 除果聚糖合成与分解所形成的无效循环 . 51 泡转化酶基因家族表达调控的进化 . 51 第四章 水稻细胞壁转化酶基因的表达和干旱下的转录调控 . 52 料和方法 . 52 物生长和取样 . 52 法 . 52 果 . 54 胞壁转化酶基因在剑叶、主穗、花药和穗颈的表达分析 . 54 旱胁迫使穗颈伸长停止，引起抽穗延迟 . 57 胞分裂和细胞膨大发生在穗颈基部 . 58 胞壁转化酶基因表达分布 . 60 A 促进离体状态下的穗颈伸长及 表达分析 . 61 细胞学定位： . 63 论 . 65 达于源和库组织中的多个细胞壁转化酶基因 . 65 穗颈伸长 . 66 颈伸长控制机理探讨 . 67 种策略思索 . 67 第五章 结论 . 69 9个水稻转化酶基因的发现及其 克隆 . 69 个 转化酶基因家族的进化分析 . 69 个液泡转化酶基因的确认及其在干旱下的表达调控 . 70 胞壁转化酶在水稻应对干旱中的作用 . 70 参考文献 . 72 致谢 . 88 作者简历 . 89 第一章 绪论 物转化酶基因家族研究进展 转化酶（ ,又称蔗糖酶或 催化如下反应：蔗糖 +糖 +葡萄糖。自从一百多年前 860)分离到第一个转化酶后，转化酶的研究在生理、生化以及分子生物学水平上已经取得了重 大的研究进展。 化酶的生化特性及分布 糖及其代谢相关的酶类 蔗糖及其组成成分果糖和葡萄糖在植物的运输、储藏和碳水化合物代谢中发挥主要作用（ 1996; , 1996; 1997; , 1998; , 1992），并在渗透调节、抗逆性、生长繁殖以及信号传导方面也发挥着重要的作用（ 1980; 2000; 2000; 2001）。蔗糖磷酸合成酶（ 磷酸蔗糖磷酸化酶（ 化蔗糖由 糖合成酶（ 催化由蔗糖和 转化酶（ 催化蔗糖的不可逆水解。（ , 2003）。在拟南芥中， 是由小基因家族编码而来，而编码位于细胞壁或液泡的酸性 转化酶（ , 1997; , 2003）以及位于细胞质的中性 /碱性转化酶（ , 2003）则分别是两个较大的基因家族。 化酶的同工酶及分布 转化酶不可逆催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。随着植物转化酶研究的深入，人们发现转化酶不仅存在于光合的源组织中（例如成熟叶片），而且也广泛存在于非光合的库组织中（例如果实、根、花药等）（ ， 1991； 1997； , 1996）。 在高等植物组织中存在着许多同工酶形式，可根据它们的亚细胞定位、溶解性、最适 等电点（ 分开来（ ， 1990）。其中，根据在细胞所处的位置可以分为三类：细胞壁转化酶、液泡转化酶和细胞质转化酶；根据 性转化酶和中性 /碱性转化酶。液泡转化酶是可溶的，而细胞壁转化酶一般被认为通过离子作用和细胞壁紧密结合 ( 1990; , 1994) 。但最近的研究表明细胞壁转化酶也有游离于细胞外的（ ， 2000）。细胞壁转化酶和 液泡转化酶由于 偏向酸性，因此合在一起归于酸性转化酶类。所有酸性转化 酶都是糖基化的，它们不仅可以催化蔗糖的水解，而且可以催化一些寡聚糖（例如棉籽糖和水苏糖）的水解 ( , 1992; 1994)，而中性 /碱性转化酶只能以蔗糖为底物，具有蔗糖水解的特异性（ 1992; 1999）。由此可见，虽然酸性转化酶和中性 /碱性转化酶均催化蔗糖水解 , 但它们具有不同的氨基酸序列和显著不同的生化特性，暗示了两组转化酶具有不同的催 化位点以及作用机制。表 1 图 1糖从韧皮部卸载后可以在细胞外、细胞质以及液泡等不同位置被相对应的同工酶水解。 表 1种植物转化酶的同工酶的特性 of 转化酶类型 适 围 解性 物 否糖基化 胞壁类型 (酸性 ,细胞外 ) 溶或可溶 蔗糖 / 棉子糖 是 液泡类型 (酸性 ) 溶 蔗糖 / 棉子糖 是 细胞质类型 (中性 /碱性 ) 溶 蔗糖 否 图 1植物转化酶的三种同工酶在源和库细胞中的作用位置 1of of 淀粉 液泡 细胞质 蔗糖 质外体 葡萄糖 果糖 蔗糖 葡萄糖 果糖 细胞质 转化酶 葡萄糖 蔗糖 果糖 液泡 液泡转化酶 蔗糖 细胞壁 转化酶 库细胞 液泡转化酶 叶绿体 环 丙糖 蔗糖 葡萄糖 果糖 葡萄糖 果糖 细胞质转化酶 源细胞 细胞质 码转化酶的基因：酸性转化酶基因家族和中性 /碱性转化酶基因家族 性 转化酶基因家族 目前在拟南芥 (胡萝卜（ 茄 (马铃薯 (烟草 (蚕豆 (水稻 (玉米 (燕麦 (一些高等植物中都已有被分离、测序并命名的转化酶基因。 (见表 1表 1物转化酶基因列表 of 种名 因 转录 工酶类型 录号 sI 胞壁类型 细胞壁类型 液泡类型 液泡类型 细胞壁类型细胞壁类型 细胞壁类型细胞 壁类型 细胞壁类型 液泡类型 液泡类型 液泡类型 细胞壁类型 细胞壁类型 液泡类型 细胞壁类型 细胞壁类型 细胞壁类型 液泡类型 细胞壁类型 细胞壁类型 液泡类型 液泡类型 99111(69321(78423 67163 37047 29099 35162 35164 胞壁类型 细胞壁类型 细胞壁类型 细胞壁类型 液泡类型 液泡类型 细胞壁类型 16123 73601 (1) 酸性转化酶基因的分子结构 对酸性转化酶基因的 们已经发现了一些与以前报道的基 因相类似的调控元件（ ,1993; ,1996）。对所有 5端序列已知的转化酶基因序列分析显示这些序列和生长素可诱导元件（ ,1990; ,1994）、乙烯反应元件（ , 1989; 1995）、创伤反应元件（ , 1989）、胁迫反应元件（ 989）以及 992）具有很 高的相似性。然而这些结果都需要进一步的功能验证。其常用途径是：通过小片段敲除法，利用转基因植物表达或原生质体瞬时表达系统来确定这些作用元件的功能。在胡萝卜和拟南芥中都曾有利用此途径来研究转化酶的启动子的成功例子。（ 1993）利用原生质体瞬时表达揭示了在 且利用转基因烟草作为表达体系验证了此启动子的时期特异性调控作用；（ 1996）曾利用瞬时表达 动子 示了包括创伤反应元件在内的多个顺式作用元件。 外元结构 根据从高等植物中已经分离出的 18个酸性转化酶基因（包括 13个细胞壁转化酶基因和 5个液泡转化酶基因 ,见表 1酸性转化酶的内元 种类型（见图 1 属于类型的基因有： 的基因有 的基因有 的基因有 的基 因有 的基因有 的基因有 比较上述结果和表 1基因类型可以看出，虽然酸性转化酶基因的内元 大多数基因都有一个保守的 7个的内元 /6个内元的结构。除个别基因（例如 ，绝大多数酸性转化酶基因在第一和第二外元之间均有一个 9图 1 ，这是植物界中已知的最小的功能外元，这个外元编码三个氨基酸（ 这三个氨基酸是在所有 植物转化酶基因中保守的 的一部分（ ,1997; , 1995; , 1995），这个基元和另一催化位点 一起对酶的催化活性起着关键作用 (1999)。 图 1性转化酶基因的内元 of :外元和内元分别以方框和实线表示 as 性 /碱性转化酶基因家族 中性 /碱性转化酶基因研究远远落后于酸性转化酶基因，至今还没有一个完整的中性 /碱性转化酶基因被克隆。不过许多全长的中性 /碱性转化酶基因 水稻 (分离出来。拟南芥的 自 （ 2003）的报道，水稻的 ,2003）。得益于拟南芥 (水稻(全基因组序列在网上已公开发布，我们通过 碱性转化酶基因 9个拟南芥中性 /碱性转化酶基因和 3个水稻中性 /碱性转化酶基因）。所有的中性 /碱性转化酶基因根据它们的外元 图 1属于类型的基因有 的基因有 的基因有 （ ） （） （） （） （） （） （） 图 1性 /碱性转化酶基因的内元 of 注 :外元和内元分别以方框和实线表示 as 转化酶基因的进化 编码转化酶的两个基因家 族的出现为绿色藻类和高等植物通过内共生作用进化而来的假说提供了证据。植物中性 /碱性转化酶和光合细菌的转化酶密切相关（ , 2003），而植物酸性转化酶则和来自呼吸真菌（酵母）和需氧细菌的转化酶有着密切的关系（ 1990）。在植物、藻类和光合细菌等这些仅有的能够合成蔗糖的组织中，中性 /碱性转化酶被认为是细胞质类型的（ 1992）。来自需氧细菌的酸性转化酶则是质膜类型的，可以催化细胞外的蔗糖以及别的包含果糖基的寡糖和果聚糖的水解反应（ 1996; , 2003; , 2002）。真菌类中的酸性转化酶，除已知的酵母的 ，均定位于细胞外。 两个不同的启动子，前者导致产生细胞外类型，后者则由于缺少 , 1982）。在进化过程中光合细菌通过内共生作用侵入一个非光合作用的呼吸真菌（ 2003）。来自光合细菌的中性 /碱性转化酶和来自呼吸真菌的酸性转化酶共同构成了绿色藻类和高等植物细胞 质类型的中性 /碱性转化酶和细胞壁类型的酸性转化酶。 植物不仅包括细胞外的酸性转化酶，而且包括由此进化而来的液泡类型的转化酶（ , 1994; 1999）。一般认为，液泡类型的转化酶源于细胞壁转化酶。进化过程中发生了突变很可能改变了它们在内质网中的亚细胞定位，核糖体原初蛋白被一段大约二十个氨基酸的疏水信号肽带入了内质网（ , 1997），其后发生的特异的指向液泡的信号肽的进化也许进一步增进了亚细胞定位的辨别效率（ , 1990）。这里 ，本研究将转化酶基因的进化的基本过程以图示的形式进行了概括（见图 1 （ ） （） （） 图 1化酶的进化历程 of 多植物可以通过蔗糖合成果聚糖（ 1999）。果聚糖是由 (22约有 15%的开花植物以及一些细菌 (例如杆状菌、链球菌、放线菌 )都可以合成果聚糖（ 1993）。它们作为一种储藏型的碳水化合物存在于各种谷物、蔬菜、观赏植物以及杂草中（ 1999），并在保护植物免受寒冷和干旱胁迫（ , 1995） 、保持有利于光合作用的蔗糖水平以及蔗糖运输等方面发挥作用（ , 2003）。果聚糖还和人类的健康和营养有关，它可以被用来作为前生物制剂（ 2002）以及治疗龋齿（ , 2002）。 细菌合成两类果聚糖：左聚糖和菊粉。 B. S. A. 都含有一个果糖基转移酶（ ,它催化合成由 (2为骨架 ,并在果糖 12001)。 S. 它催化合成 由 (2为骨架 ,并在果糖 61994）。 L. 含有的果聚糖转移酶（ 可以形成低分子的又可形成高分子的果聚糖（ , 2002）。 积累果聚糖的植物中，有单子叶的也有双子叶的。双子叶植物 , 1994）。而单子叶植物的果聚糖类型多样。洋葱（ 郁金香（ 以产生一种被称作菊粉新系列的特殊的果聚糖，这种糖中菊粉类型的链既可以在葡萄糖的 置也可在 1989）。大多数的草类（ 以合成既有 (2连又有 (2连的支链果聚糖（ , 1989）。当然也有一些草类 只含有一种类型的 果聚糖。例如 1986)只有左聚糖。 在植物中，当光和潜力超过了生长速度时积累果聚糖，而当生长潜力超过光和能力时则消耗果聚糖。例如，果聚糖会在光照充足而缺乏氮素的菊苣积累（ , 1999）。干旱胁迫和果聚糖积累的关系更复杂，也许是因为它既是膜保护 物质又是一种储藏性的碳水化合物的缘故。干旱胁迫下使菊苣幼苗中果聚糖和 1量增加（ , 2000），而使菊苣根中已经积累的果聚糖解聚（ , 1998），但共同的是两者都会积累聚合度（ 低的果聚糖。因此，这里可能存在着某种调控，即如果干旱胁迫前没有果聚糖的存在，合成低 果干旱前已经存在高 果聚糖，则在干旱后进行部分解聚。在单子叶植物中也有这种复杂的关系。在小麦中，干旱胁迫和 理都会诱导果聚糖外水解酶并且抑制 1促进果聚 糖的裂解（ , 2004）。相反的，在黑麦（ ，干旱胁迫使果聚糖在叶鞘和正在伸长叶的基部积累，并且主要增加的是 高的长链果聚糖（ , 2003）。冷胁迫和 别是那些抗寒的品种（ , 2004）。 不同果聚糖转移酶具有不同底物和联结方式，因此可以简略形式清楚区分。例如 1果糖基从一个蔗糖分子转移到另一个蔗糖分子 ,从而形成蔗果三糖 ( , 1998)。植物的 6C 类似细菌的 果糖基转移酶，然而不同的是它并不产生长的左聚糖，而是倾向于转移果糖基到蔗果三糖的中间一个果糖，产生一种短的支链果聚糖。 6转移果聚糖的末尾一个果糖基到蔗糖的 置，而起始菊粉新系列（ , 1997）。 1以转移果聚糖的末尾一个果糖基到不同的受体（蔗糖、果糖、蔗果三糖、