【毕业学位论文】（Word原稿）猪c-fos和MyoG基因与肌纤维性状的关联性研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 猪 因与肌纤维性状的 关联性研究 I 摘 要 随着我国经济的迅速发展， 人们 生活水平的 不断 提高， 猪的 肉 质问题 愈来愈受到世人的 关注 。猪 肌肉组织学 作为 与肉质性状 紧密相关的性状， 是影响猪肉品质的决定性因素 。 而遗憾的是， 肌纤维性状 虽 主要受遗传控制 ， 但 其 活体测定 比较 困难 。 因此 ，寻找与肌纤维 性状密切相关的主效基因 或分子标记，进行标记辅助选择 ， 是改善肉质的重要途径 。 本研究 以 引进品种大白猪 （ 180 头 ） 和培育品种北京黑猪 （ 170 头） 两个肉质差异比较大的品种作为试验动物， 利用冰冻切片 、 色 等 技术 对其 进行了 肌纤维性状 的 测定 ， 并 比较了品种间肌纤维性状的差异 ， 分析了肌纤维 性状 不同指标 间的相关性 ； 采 用 术 对与肌纤维发育密切相关的 肌细胞生成素 （ 基因 与 因 的外显子 进行了 析，对不同基因型个体的 物进行 了克隆 测序和 序列 比较 ， 并分析了标记基因型与不同猪种肌纤维性状的 关联 及其与猪肌纤维 指标间的相关 。 结果表明： （ 1） 北京黑猪背膘厚、肌纤维密度、红肌纤维及中间型肌纤维比例的平均值 比 大白猪 ， 而 眼肌面积、肌纤维直径、肌纤维面积及白肌纤维比例 的平均值 却比 大白 猪 分别 低 。 （ 2） 肌纤维直径与肌纤维面积、白肌纤维比例及眼肌面积呈极显著正相关（ P 肌纤维密度与红肌纤维、中间型肌纤维比例及背膘厚呈极显著正相关（ P 。 （ 3） 因 外显子 1 上 发现一个多态位 点 （ ，检测到三种基因型（ B）； 因 外显子 4 上 发现 2 个多态 位点 （ ， 并 分别检测到 3 种基因型（ 克隆 、 测序 发现 ，在 显子 1 有 AG（ 2 512），在 因 GA（ 2 650），在 AG（ 2 910） 突变 ，其中 前两个 碱基突变 为 沉默突变； 而 2 910 处的碱基突变引起了所编码氨基酸的改变 （ ， 为 错义突变 。 （ 4） 在 位， 北京黑猪以 居多（ 58 ） ，而大白猪则以 居多（ 46 ），但 不同品种间基因型频率的分布差异 不 显著 （ P ； 在 因 位，北京黑猪中频率最高（ 40 ），大白猪中 频率最高（ 44 ），而 两品种在 位 的分布 正好与 其 相反，但在这 两个座位，不同品种间基因型频率的分布差异 都 极显著（ P 。 （ 5） 对屠宰体重、 品种、性别 和基因型效应进行最小二乘分析 表明 ， 屠宰体重 与 品种对肌纤维性状及部分胴体性状的影响均达到极显著水平（ P ； 基因型 除对中间型肌纤维比例及背膘厚影响不显著外（ P ， 对其它性状的影响 均达到 极显著水平 （ P ；性别对各性状的影响均 未 达到显著水平 （ P 。 （ 6） 对 个位点进行 的 最小二乘分析 表明 ，在 两品种 中， 提高 位 上等位基因 A 的频率 可 减小肌纤维面积与直径 ,增加肌纤维密度 ， 提高 位 上等位基因 B 的频率 可 增加肌纤维密度与红肌纤维比例 ；而 位的 等位基因 A 和 B 则分别具有 增加 肌纤维面积 与 肌纤维密度 的效应 。 以上 数据 都 显示 ： 因 因 个位点的多态性 与肌纤维组织学性状间存在一定相关， 因此可以将 其 作为对猪肌纤维性状进行选择的分子标记。 关键 词 ： 猪；肌纤维； 因 ； 因； of of s on by by or in to it to in up 0 to 10 m ） on a by -E of of of of of in on (1) of of of , , , of of of , , , (2) to of to of (3) of of to in of G（ 2 512） ， A（ 2 650） , G（ 2 910） . of a in no of of by of a in by of of a in of . (4) of No of in P , of in of P 5） of of by P ; of on of of at no on of P . （ 6） of be be of in of be of in of in of be as 录 第一章 文献综述 . 1 究背景 . 1 京黑猪介绍 . 2 京黑猪的遗传背景： . 2 京黑猪的肉质特点： . 2 子遗传标记与标记辅助选择 . 3 子遗传标记及其分类 . 3 记辅助选择的优势 . 4 记辅助选择在动物育种中的应用 . 4 术 . 5 术的基本原理 . 5 术的建立与发展 . 6 法的特点 . 6 术在动物育种中的应用 . 7 术的应用前景 . 7 纤维的研究现状 . 7 纤维与肉质的关系 . 8 纤维的分类 . 8 纤维的生长发育规律 . 9 响肌纤维特性的因素 . 10 纤维相关基因的研究进展 . 11 因家族 . 11 癌基因研究现状 . 13 研究目标 . 16 第二章 材料和方法 . 17 验材料 . 17 验猪种来源 . 17 样的采集与保存 . 17 织样的采集与保存 . 17 品和酶 . 17 要仪器 . 18 析工具软件及网址 . 18 液的配制 . 19 验方法 . 21 因组 提取 . 21 V 程 . 22 冻切片制作与染色过程 . 26 膘厚及眼肌面积的测定 . 28 计分析方法 . 28 位基因频率和基因型频率 . 28 传多态性分析 . 29 体 衡状态的检验 . 30 种之间基因基因型分布的差异显著性检验 . 30 同标记基因型对肌纤维性状影响的分析 . 30 第三章 结果与分析 . 31 因组 提取及 . 31 因组 提取 . 31 增结果 . 31 测结果 . 33 因及 因测序结果分析 . 35 因测序结果分析 . 35 因测序结果分析 . 35 基酸序列分析 . 35 计分析结果 . 36 状表型值及性状间的相关性 . 36 因频率和基因型频率分析 . 37 个位点基因型频率的 衡检测 . 38 个位点的遗传多态性分析 . 38 同品种三个位点基因型分布的差异显著性检验 . 39 变因对肌纤维组织学性状及部分胴体性状的影响 . 39 点多态性与肌纤维性状及部分胴体性状间的关联性分析 . 39 个位点的基因型联合效应 . 43 论 . 44 响切片效果的因素 . 44 计分析结果讨论 . 45 第四章 全文结论 . 49 参考文献 . 51 作者简历 . 57 致 谢 . 58 附 图 . 59 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片断长度多态性 膘厚 种值 褐色、坚硬、干燥肉 甲基亚砜 乙二胺四乙酸二钠 ye 肌面积 维面积 维直径 记辅助选择 纤维密度 细胞生成素 球蛋白重链 酸盐缓冲溶液 聚合酶链 式 反应 - 单链构象多态性 随机扩增多态性 限制性片段长度多态性 of 中间型肌纤维比例 of 红肌纤维比例 应激综合症 of 白肌纤维比例 数量性状基因座 琥珀酸脱氢酶 二烷基磺酸钠 核苷酸多态性 单序列重复 三羟甲基氨基甲烷 四硝基蓝四唑 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 究 背景 近年来，随着我国经济的迅速发展，人们的肉类产品消费结构发生了很大变化，猪肉消费比例逐渐下降 而 牛羊与禽类肉产品的消费却不断升高，但是，猪肉仍是我国人民的主体肉食，约占肉类总消费量的 65左右。 并且， 随着国民经济水平的不断提高，人们对猪肉的消费已由量的需要转变为质的需求，我国的传统饮食文化和烹饪习惯对猪肉“原味”口感有着更高的要求，风味品质俱佳的猪肉正越来越成为高收入 一族 的首要选择 。在过去的几十年中，提高胴体瘦肉率一直是育种工作的主要目标。该性状遗传力属中等，已获得了较 大的遗传进展。猪的生长速度、饲料转化率和瘦肉率等都有了很大的提高，但同时也产生了负面影响，即肉质差，不仅表现在风味和口感上，更重要的是表现 白、松软、渗水）和 黑、坚硬、干燥）劣质肉，这些劣质肉的出现给养猪业和肉类加工业造成 了 极大 的 损失。因此猪肉的质量问题逐渐引起人们更大的兴趣，而肉质问题也越来越引起了人们的普遍关注。所以，在大力增加猪肉生产的同时，还应重视猪肉 品质 的改善。 据国外研究报道，某些瘦肉率特别高的猪种（如长白猪、皮特兰猪）， 其 肉的质量较差，瘦肉产量与 猪肉 质性状间呈 一定的 相关 性 。由 于肌肉组织学特性与 肉质性状及 胴体的经济性状关系密切，所以国外 早在 1909 年 就 已 经 将肌纤维用于肉质上的研究 。 （ 1996） 对猪肌纤维 的 研究发现，随着肌纤维直径的增大，肌肉的细 、 嫩度相应降低。 1972）通过大量研究证实，猪的肌纤维直径与眼肌面积 呈 正相关，而与 肌内 脂肪 含量 呈负相关。肉质可以通过对一些生物物理与化学性状的测定来进行估计，比如，系水力、颜色、光泽、 内脂含量与剪切力等。肌纤维的粗细是影响肌肉理化性能的一个重要因素。我国地方 猪 种肉质鲜嫩的一个重要原因就是肌纤维直径小。 肌纤维直径和密度是影响嫩度和系水力的重要指标，通常单位面积内肌纤维越多，即纤维直径愈小，其肉质就 愈 细嫩，密度大的品种，其肌内脂肪（大理石纹）的沉积量要多于肌纤维粗而密度低的品种。而肌内脂肪含量低，则会出现肉质粗糙，嫩度和风味较差的现象。对 肌纤维的显微结构观察发现，肌纤维枝茎粗大，内部有破裂现象。王楚端等（ 1996）研究发现，肌纤维直径粗大，白肌纤维增多而红肌纤维相应减少是形成 的组织化学基础。许多研究结果均证实，肌纤维直径与系水力、 、肌肉干物质、肌内脂肪等几个主要肉质指标间都呈 一定的相关 性 。 目前，肉质改善主要从品种改良（遗传控制）和营养调控两方面进行研究，但品种是 决定性因素。许多研究表明，中国猪种具有良好的肉质，主要表现在： 终 较高，保水性好，肌内脂肪、胶原蛋白含量显著高于国外品种。同时，中国猪种肌肉的肌纤维较细，密度较大，多汁，风味好。近几十年来，有关肌肉组织学、组织化学方面的研究已有很多报道，但对生长猪肌纤维及其主效基因的研究尚不多见。最近几年，分子生物学技术的发展和较高密度猪基因图谱的构建，使人们可以在 平寻找控制肌纤维性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 中用 于标记辅助选择（ 以便在改善胴体和肌纤维性状的同时，改良肉质性状，满足人们的需要，同时获得较大的经济效益。 京黑猪介绍 京黑猪的遗传背景： 北京黑猪育种群的血统来源有三个分支：血统来源包括了亚、欧、美三大洲的诸多品种，有丰富的遗传背景。 （ 1） 有优良种质基因的中国猪种，主要是北京当地的华北型的民间 黑猪 品种。其特点 为 耐粗饲、抗应激、性早熟、母性强、肉质风味浓郁； （ 2） 有遗传基础广泛的国产培育猪种，是中国本地猪与西方品种杂交后形成的猪种。特别值得关注的是定县猪，它是 美国波中猪和河北定县本地猪杂交后固定的后代，含美洲猪种的 血统 ； （ 3） 有体大快长基因的欧洲猪种，如巴克夏猪、约克夏、苏联大白猪、高加索猪等国外优良培育品种。 北京黑猪是上个世纪 50 年代初利用外来猪种（巴克夏、约克夏、苏联大白猪和高加索猪等）与本地猪杂交，经 30 几年精心培育的优良地方品种， 1982 年通过农业部验收鉴定，正式命名为“北京黑猪”。北京黑猪，曾是北京地区的当家品种，也是 70、 80 年代北京地区规模化养猪企业杂交繁育体系中的配套母系品种，得到广泛应用，对当时的商品猪生产做出了重要贡献。 90 年代，由于引进品种的冲击和市场对瘦肉率的过渡追求，北京黑猪逐步退出杂交繁育体系，数量也逐渐减少，甚至到了灭绝的 危险 地步。 近几年，由于市场需求的变化，肉质越来越受到重视，市场上对优质肉的需求逐步增长，特别是北京这样的大城市，消费水平高，北京黑猪优质的猪肉品质越来越受到市场的重视和欢迎，北京黑猪瘦肉率 5658%，肌内脂肪 上，瘦肉率适中、适应性好、抗病力强，不需要复杂的杂交配套，能够直接生产优质肉，现已成为北京优质肉市场的主要品牌。作为北京地区现在唯一一个具有一定群体规模和开发价值的地方培育品种， 但最近十年，几乎没有科技投入，对其目前的种质特性不了解，选育工作进展不大，更谈不上一些育种新技术的应用。为了科学合理地开发利用北京黑猪这一优良地方品种资源优势，有必要对北京黑猪进行种质特性研究， 京黑猪的肉质特点： 北京黑猪被毛全黑、体形中等、结构匀称、四肢结实健壮，具有中国猪特有的优点：初产母猪 /胎，经产母猪 12 头 /胎， 龄可参加配种， 90 体瘦肉率 达 57 %以上，抗病力强，耐粗饲，抗应激，生长快，商品猪日增重 650 850 g，肉料比 1 具特色的是猪肉品质和 风味等指标 （谢蜀扬， 2005） ： 经测定： 北京黑猪肉的颜色为最佳鲜红色， 24 h 肉色评分 为 ，肌内脂肪含量为 ，肌肉嫩度为 剪切 力 值 ） 等肉质指标均优于长白猪和中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 大约克猪等外来瘦肉型猪种 ； 对肉的风味起关键作用的四种氨基酸：苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸和赖氨酸以及半胱氨酸的含量，北京黑猪明显高于长白猪等外来猪种 ； 和游离氨基酸一起构成肉质鲜美的核苷酸的含量，北京黑猪肉明显高于大约克猪，次黄嘌呤核苷酸的含量出现高峰在屠宰后的 1 4 天间，保证了北京黑 猪肉味鲜美，且保鲜时间长 ； 北京黑猪肌肉中总的不饱和脂肪酸明显高于长白猪，尤其含硫氨基酸 （ 胱氨酸 ） 含量较高，食后对人体有较高的营养和保健作用 ； 北京黑猪肌纤维数较外来品种多，纤维直径均比外来猪种的细，食后肉质细嫩、口感好。 子遗传标记 与标记辅助选择 子遗传标记 及其分 类 分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，作为分子遗传标记既 可以 是可表达的 段 （ 编码基因 ） ，也可以是无编码功能的 片段，或是一个酶切位点和一个突变位点，它们的遗传方式和普通基因一样遵循特定的遗传规律 ，而且多数与经济重要性状位点 （ 数量性状位点 （ 连锁，易于检测和识别，且有足够多态。目前所采用的分子标记方法就是基于这些标记位点的多态性而发展起来的 。 标记是 20 世纪 80 年代初发展起来的第一代分子标记技术 （ ， 1980） 所谓 指用限制性内切酶酶切不同个体基因组 ，含同源序列的酶切片在长度上的差异其差异 的检测可通过琼脂糖凝胶电泳技术来 实现 第一代分子标记技术，在遗传分析中得到了广泛应用，至今仍是一种常用的研究方法它能用于在 平上直接测定遗传变异 。 与传统的遗传标记相比， 记具有下列优点 ： 记无表型效应，其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响 ； 记等位基因间是共显性的，非等位基因间不存在上位效应，互不干扰 ； 源于基因组 自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，可以选取足够数量能代表整个基因组的 记 记也有其自身的不足， 内切酶的选用密切相关，只能选用一定的内切酶， 某个位点才可能表现出多态性；而且它不能检测出酶切后相同长度 段内的碱基变异 1990） 使用随机引物，经 增