【毕业学位论文】（Word原稿）产激活蛋白极细链格孢菌发酵工艺优化和中试生产技术生物化学与分子生物学硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 中国农业科学院 学位论文 产 激活蛋白 极 细链格孢菌发酵工艺 优化 和 中试 生产 技术 I 摘 要 极细 链格孢 (株能产生诱导多种植物产生系统抗性的 植物激活蛋白 ， 该 蛋白 粗提液对黄瓜、番茄、水稻、烟草和白菜均有理想的促进生长和诱抗效果 , 并且 对环境安全、不会引起植物的抗性，是一种具有广泛开发前景的新型生物农药。为了进一步提高 极细 链格孢菌 植物激活蛋白 产量，本文根据 极细 链格孢 营养需求，通过不同营养组合和多因子试验分析，对该菌的培养基和培养条件进行了改进和优化，并进行了 100 L 和 6 吨发酵罐的逐级放大试验，获得了理想的激活蛋白产量，该研究为今后激发子农药的规模化生产奠定了基础，主要研究结果如下： 1、通过 极细 链格孢菌发酵生长曲线试验，孢子形态、萌发以及菌丝体生长形态的观察，了解了供试菌的生长周期和形态特征，为以后发酵试验奠定了生物学基础。 2、研究了不同培养基和发酵时间激活蛋白和菌丝干重的相互关系，确定了以菌丝干重作为发酵评价标准。 3、通过摇瓶试验，应用正交试验对培养基组成和培养条件进行了优化，确定了最佳发酵培养基配方为： 15 g/L 蔗糖， 5 g/L 葡萄糖， 5 g/L 玉米淀粉， 20 g/L 土豆淀粉， 10 g/L 谷氨酸， 5 g/10 g/L 黄豆粉， 5 g/L 硫酸铵；在优化过程中分别考察了接种龄、接种量、发酵培养基初始 、摇瓶装液量和温度等对发酵的影响，确定了 极细 链格孢菌最适培养条件为：培养基起始 500 瓶装液量 75 龄 18 h，接种量 10%，培养 28 1，摇床转速为 180 r/化后菌丝产量从 养产量的 9 g/L 增加到 39 g/L，提高近 4 倍。 4、以摇瓶发酵实验结果为基础，进行了 15 L,100 L 发酵罐的放大试验，考察了搅拌转速、通气量、溶氧值，温度、发酵过程中的 参数，对发酵过程中的代谢曲线进行了分析，并在100L 罐尝试补料发酵方式，使菌丝产量达到 50.6 g/L，比摇瓶培养的菌丝最高产量 39 g/L 提高32%，比 15 L 罐发酵最高产量 41.4 g/L 提高 22%，说明补 料发酵有利于菌丝产量的提高。 5、根据 15 L、 100 L 的逐级放大发酵参数，进行了 6 吨工业罐的三级发酵试验，菌丝产量与小 试菌丝产量相当，为今后大规模生产奠定了基础 。 关键词 ： 极细 链格孢菌， 发酵 条件 in is to It a in of in of 000L of in as 1. of of in It of in 2. of in It of be as of 3. in is up 5 g/L 5 g/L 5 g/L 20 g/L 10 g/L 5 g/L 10 g/L g/L pH .5,of 5 mL 00mL 8h, 0%, 81C, 80 r/of .9 g/100 mL of 4. on in 5 L 00 L as in of 00 L 0.6 g/L 2% 2%, of 5 L 5. on 5 L, 100 L 000 L 00 L in 录 第一章 绪论 . 1 白激发子研究概要 . 1 白激发子种类及其在国内外研究进展 . 2 敏蛋白 . 2 发素 . 2 毒蛋白 . 3 毒激发子 . 4 活蛋白 . 4 菌源生物农药的发酵 . 4 体真菌生物农药的发酵研究进展 . 4 菌代谢产物的发酵工艺 . 5 料发酵工艺 . 5 究目的和意义 . 7 第二章 极细 链格孢培养特性及发酵评价参数的建立 . 8 料和方法 . 8 验材料 . 8 验方法 . 9 果与分析 . 11 细 链格孢菌生长曲线的测定 . 11 细 链格孢孢子萌发和菌丝生长状态观察 . 11 孢培养基和条件的比较 . 14 活蛋白与菌丝产量的关系 . 15 章小结 . 16 第三章 极细 链格孢产激活蛋白的摇瓶发酵 . 17 料和方法 . 17 验材料 . 17 验方法 . 19 果与分析 . 19 养基碳、氮源和无机盐的筛选和优化 . 19 种量对菌丝产量的影响 . 21 龄对菌丝产量的影响 . 21 瓶通气量对菌丝产量的影响 . 21 液量对菌丝产量的影响 . 22 养温度对菌丝产量的影响 . 22 养基起始 菌丝产量的影响 . 23 发酵代谢参数动态 分析 . 24 章结论与讨论 . 24 第四章 极细 链格孢产激活蛋白中试发酵技术研究 . 26 料和方法 . 26 验材料 . 26 验方法 . 28 果与分析 . 29 5 L 罐发酵条件的确定及发酵参数的优化 . 29 00 L 罐中试发酵 . 30 章小结 . 31 第五章 极细 链格孢产激活蛋白工业化三级发酵技术研究 . 32 料和方法 . 32 验材料 . 32 验方法 . 32 果与分析 . 32 级发酵条件的确定 . 32 业化发酵后处理技术流程的建立 . 33 章小结 . 34 第六章 全文结论 . 35 参考文 献 . 36 附录 . 40 附录一 培养基中葡萄糖含量的测定 . 40 附录二 甲醛滴定氨基氮法 . 42 附录三 还原糖的测定 . 43 附录四 双缩脲蛋白质测定方法 . 44 致谢 . 45 作者简历 . 46 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 白激发子研究 概要 植物与病原菌的相互作用包括两种类型：一种是亲和性互作（ ；另一种为非亲和性互作（ 植物与病原菌之间的非亲和性互作常会引发植物体一系列的生理生化反应，这些反应会进一步诱发植物的抗性。非亲和性互作的分子机制假设是 1）植物体识别病原菌分子 2） 细胞传导途径的激活 3）植物体发生一系列的生理生化反应以诱导抗性 ( A& J 1990,& 1990, J 989)。 在植物与病原菌非亲和性互作过程中，能够诱导引发防御反应的某种特 定的微生物或植物分子即称为激发子 ( J 1989, G& 1984, D& J 1988)。 激发子有多种类型，非特异性激发子，如 1,3蛋 白，壳聚糖 和花生四烯酸等这类激发子对易感病植物及抗性植物均能引发防御反应 ( . 1988)。另一类非特异性激发子是源于植物体本身的，如多聚半乳糖苷，它由植物细胞壁分泌，是一种可降解微生物的酶 ( . 1988)。尽管非特异性激发子可能参与了植物与微生物互作的信号传导过程，但这类激发子是否引发植物体抗性还有待研究。相对于非特异性激发子，特异性激发子只引发对病原菌激发子有抗性的植物体的防御反应。特异性激发子被认为可引发无毒基因的表达 ， 无毒基因是与寄主抗病基因互作，其产物是与寄主抗病基因 产物互补的基因 ( T 1986, T 1990)。从植物病原细菌 ，真菌和病毒中都发现存在 相应的寄主植物抗病基因互作的无毒基因。 如 基因 表达出一种低分子量的蛋白激发了抗性大豆的过敏性反应，这就表明 因编码了一种参与合成激发子的酶 ( T 病原真菌中也同样存在无毒基因如产生一种富含甘露糖和半乳糖的胞外糖蛋白，这种糖蛋白可造成抗性大豆的植物抗毒素积 累，但易感大豆没有此现象，这表明，该糖蛋白很可能就是无毒基因的产物 ( S& J 1986, S 1989)。 因编码一种含有 28 个氨基酸的肽段 ， 它可以诱导 基因番茄的特异性过敏反应 M J& J G M 1988, A L 1991)。近期研究表明，对于不含有因同源序列的 植株， 其表现为毒性，而对于 基因植株则是无毒的，这就进一步验证了激发子对专一性寄主的作用 ( F J M 植物的抗性基因与病原物的无毒基因的产物相互识别后，植物才能产生非亲和反应。在非亲和反应中，植物会诱发一些特征性的防御反应，感染处的细胞 会发生过敏反应，这部分的细胞死亡可以延缓或抑制病菌的生长和扩散 。同时来源于感染处的信号分子诱导植物的其余部分产生局部获得抗性或系统获得抗性，以防止病菌的扩散和植株第二次受病菌感染。病原菌接 触寄主或非寄主植物时产生过敏反应，在这两种互作反应中均涉及到寄主与病原菌之间的信号交换，其结果导致植物感病或抗病。 蛋白激发子（ 病原菌 激发子诱导后，相关的植中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 物基因可迅速地得到表达，蛋白激发子与寄主的受体蛋白结合，经过一系列反应过程诱导抗性。由于蛋白激发子能在植株体内诱导多种防御反应，因此在过去的 10 多年中，许多的研究工作都致力于它的作用机制上。但是蛋白激发子在体外不表现杀菌作用，仅通过启动植物体内的防御机制而在抗病性中发挥作用，因此在当前化学防治造成严重 生态恶化、抗病育种无法解决抗性不稳定等难题的情况下，蛋白激发子可能将成为农业生态系统中病害控制的新思路。 白激发子种类及其在国内外研究进展 目前发现的植物蛋白激发子按照来源与特性，分为过敏蛋白 发素 毒蛋白，病毒蛋白及激活蛋白 。 敏蛋白 1992 年韦忠民 (992)等研究表明 白是由梨火疫病细菌 (基因编码的蛋白， 大小为 44 992)。 突变分析表明 植物病原细菌诱导非寄主过敏性和在寄主上致病所必需的蛋白因子，可在烟草上单独诱导产生过敏反应。 因虽然是来自于病原菌，但是作为一种非特异性的激发子却能够引起非寄主抗病性的增加以及促进植物的生长。 来自梨火疫病的病原菌 而在转 梨上， 表现出了非常强的抗病。 有以下分子特征 (1)亲 水性； (2)403 个氨基残基长度，分子量 44(3)对热稳定：100 处理 10 会使其失活； (4)对蛋白酶 K 和紫外线敏感； (5)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(6)水溶性酸性蛋白； (7)无四级结构。 发素 疫霉属 (很多病原菌能向培养基分泌诱导非寄主产生过敏反应的蛋白质，此类蛋白可诱导茄科的烟草、十字花科的油菜和萝卜产生过敏性坏死和诱导抗性等防御反应，称为1989)。这种激发子被认为是 烟草互作过程中无毒基因的产物。其在合成过程中首先是合成带有信号肽的前体蛋 白，在翻译的同时，信号肽被切割掉了，然后分泌到培养基中，不存在翻译后修饰现象。 根据结构特性及生物活性， 分为 种类型 ( 989), 由 泌的酸性蛋白，包括 ；而 泌的碱 性蛋白( 1992, 1985)，包括 。 十三个氨基酸残基为缬氨酸，而 同部位为赖氨酸，因此 更高的亲水性，更易溶解。 CD 示0以上是 螺旋，一共有三个。 诱导局部的过敏反应， 能诱导系统的过敏反应。 容易在细胞间转移，在烟草中诱导相同程度的过敏反应所需蛋白中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 量比 低得多。一般 性是 50。最近，从 时分离出 白 ( C 992)。 究证明， 地蛋白 (一种由隐地疫霉 (分泌的蛋白类激发子，等电点 98 个氨基酸组成，在培养液中很丰富 ( 996)。因 极低浓度 (100 就能诱导烟草产生 使植株获得广谱抗病性，同时产生与防卫反应相关的物质如乙稀、植物保卫素、 白等，所以倍受植物病理学家和育种工作者的重视。为蛋白类激发子在国外得到了较为系统的研究，在氨基酸序列、空间结构、寄主与非寄主抗病性、作用机理、作用靶标、结构与生物活性的相关性以及抗病基因工程等方面取得了较大的进展。 从 离到的 10 右的蛋白，是 992)。该蛋白基本不被产生或很少产生，类似无毒基因的产物 。 从疫霉菌 培养滤液中分离出分子量为 张宏明 等 1999)。在对供试烟草 6 个品种均产生坏死效应，但是对烟草属以外的茄科植物马铃薯和矮牵牛以及十字花科的萝卜、小油菜、甘蓝和藜科的菠菜没有作用。可能是具有种属专一性的激发子，而从疫霉属其它种提取的 发子还可诱导十字花科的油菜和萝卜产生过敏性坏死反应，证明 其他 有更强的专一性。 外有种 90 白激发子从棉疫病菌（ 养滤液中提纯得到的 （ 张正光 等 2001） 。该激发子可诱导不同烟草品种产生过敏反应，但不能诱导辣椒和茄子等茄科作物及棉花发生过敏反应，该激发子诱导植物发生过敏反应具有一定的专化性。该激发子 可以诱导烟草产生抗性反应，其抗性以处理后立即接种烟草疫 霉 为最强，接种后 48 h 防效达 68%，以后随时间的延长逐渐减弱。 该激发子 对酸、碱和温度不敏感，但对蛋白酶 K 敏感。 通过水杨酸介导抗病信号途径，激发植物获得对真菌、细菌等病原物的系统抗性(同时产生活性氧自由基、脂过氧化物、植保素、 白等防御反应相关物质。近年来从一些腐霉菌中也发现有 活性蛋白存在，并能高效激发番茄的系统获得性抗性。 受到人们的广泛关注。 毒蛋白 包括了木聚糖酶、一些 因产物如 ， 病原无毒基因编码产物可以作为中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 激发子诱导单个显性抗病基因寄主植物的防卫反应。在番茄叶霉病菌（ 寄主的互作系统中已纯化了两种由病原菌无毒基因编码的专化性激发子，分别为 28 个氨基酸的和 106 个氨基酸的 白。病菌只有与寄主互作时才分泌这两种蛋白，在培养基中不产生。 毒激发子 病毒的外壳蛋白、复制酶以及移动蛋白等都可作为病毒激发子，但相关的研究报道不多。 活蛋白 类蛋白是本实验室目前的研究对象， 存在于真菌中。试验证明， 激活蛋白 对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫的控制效果在 75 %以上 ,并能 促生增产 （ 邱德文2004） 。前期的试验也已经显示，较低浓度的真菌激活蛋白能促进植物生长，并对其相关物质生长素、纤维素酶、根系脱氢酶进行了研究，发现处理植株根系脱氢酶、纤维素酶活性、生长素含量明显高于对照；较低浓度的真菌激活蛋白也具有抗病防虫作用，处理植株后，该植株的抗性明显增强，过氧化物酶活性，脯氨酸含量也明显高于对照。而高浓度的真菌激活蛋白具有较强的抑制作用。用真菌激活蛋白液浸黄瓜种子 （ 邱德 文 等 2005） ，观察后结果发现较低浓度的真菌激活蛋白处理的种子芽长要高于对照、二次根数也多于对照；而高浓度的真菌激活蛋白处理的种子芽长明显低于对照、二次根数也明显少于对照。 菌源生物农药 的发酵 发酵的发展历史悠久，其技术已相对成熟，但对于生物农药特别 是真菌源生物农药的发酵生产，其发酵工艺和产业化规模化还相对落后 。 这主要因为生物农药的批量生产往往通过工业发酵 ,或者是从生物体直接分离提取 ,故不利于产业化发展。 真菌发酵 过程中存在 发酵时间长：如中生菌素；易染菌：有些真菌本身不分泌抗生素，对外界细菌缺乏自 我保护的功能；罐发酵抗剪切力差；胞内 产物后处理难 ，大规模发酵后残余废物 污染 生态环境 等问题， 因此优化真菌发酵工程技术 对推进生物农药产业化具有 重大 意义。 体真菌生物农药的发酵研究进展 目前真菌源生物 农药多采用真菌产生的孢子作为有效成分，如绿僵菌、白僵菌等，近期研究报道， 一种淡紫拟青霉（ 89(产生的拟青霉杀线虫剂经发酵工程技术的优化，采用固液双相的发酵技术实现了真菌速生高产孢短周期发酵，采用开放式发酵，将发酵周期从 15d 减少到 10d，孢子 产量达 1 1012/g，突破了长期以来产孢量低、周期长的技术瓶颈。该发酵工艺是将真菌菌种于液体发酵培养基中培养 8 9 d，待菌丝生长成熟后再接到固体培养基上培养 3 5 d 产生芽生 孢子，分离孢子即得到发酵产物。经过 酵通气量、培养基中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 的改良，对这种真菌采用了开放式培养，开发出一种新型可固液共用的培养基，在通气条件下培养淡紫拟青霉产孢只需 10 d（ 000） 。 菌代谢产物的 发酵工艺 生物农药中以真菌代谢产物作为有效成份的有许多种，其中农用杀菌抗生素就是一种 传统的生物农药，我国已经研制的农用抗生素有春雷霉素，井冈霉素，庆丰霉素，多抗霉素，公主岭霉素，农抗 120，中生菌素等农用抗生素品种，我国现已大规模生产的农用杀菌抗生素品种有井冈霉素，年产量达 4 千吨 （朱昌雄等 2003） ，其主要的发酵方式为 发酵罐内液体搅拌培养。 植物激活蛋白的作用机理与上述真菌源生物农药不同， 农用抗生素多为真菌胞外分泌物，而植物激活蛋白 的作用成分是 极细 链格 孢菌 (生的一种胞内蛋白， 这种胞内蛋白是真菌生长的初级代谢产物，故而其发酵周期会比多为次级代 谢产物的农用抗生素 的发酵生产节省大量时间和成本，但其发酵产物的提取和制剂工艺又相对繁琐，针对这些特点 研究适合的发酵工艺和提取工艺是规模化生产的必要前提 。 随着发酵技术的发展进步，人们认识到菌体的增殖和蛋白产物的表达都集中在对数生长期内完成，因此发酵工艺的改进就集中在如何增加菌株对数生长期的生长时间、相对缩短衰亡时间上，从而形成了高密度发酵工艺。 高密度发酵多见于工程菌株的发酵，一般工程菌株生长迅速，在特定的时间点补加养料会使其发酵产物密度激增，对以菌体数量为目标的发酵无疑是一种有效提高产量的好方法。据报道， 其发酵产物量可达到菌体干重 100 g/L。 虽然在真菌发酵中还未有如此高的产物量，但 高密度发酵 的一些工艺特点是适合植物激活蛋白发酵的 。并且目前高密度发酵工艺已成为生物技术中中试生产的主要发酵工艺，该方法工艺稳定，发酵周期可缩短一半以上，而菌体产量和产物表达量是非高密度发酵的 10 50 倍， 有些发酵中目的产物的 活性 也有所提高 ，可见高密度发酵工艺比较适合真菌初级代谢产物的生产，时间短，见效快，有着无可比拟的优点。 料发酵工艺 进行高密度发酵的重要手段之一 就是补料发酵工艺 ， 补料发酵 (指在分批发酵过程中 ， 间歇或连续地补加含有限制性营养成分的新鲜培养基。早期的补料方式完全是凭经验进行的 ， 即发酵到一定时间 ， 经验性地添加一定量营养物。补料成分简单、补加的数量少 ，这种补料方式简单易行 ， 但往往无法有效控制发酵。在现代大规模发酵工业中 ， 补料方式已从简单一级补料发展到多级重复补料 ， 从简单地补加一种营养物发展到补 加几种营养物，