【毕业学位论文】（Word原稿）大白菜游离小孢子培养及其胚胎发生和加倍机理的研究蔬菜学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 大白菜游离小孢子培养及其胚胎发生 和加倍机理的研究 F N . F N . 要 游离小孢子培养技术在植物育种以及相关的基础研究中具有广阔的应用前景，近年来这 一技术在芸薹属植物中得到迅速发展。为了进一步完善大白菜游离小孢子培养体系，本试验以不同胚诱导能力的基因型大白菜为试材，针对培养体系中的预处理方法、胚胎移植成苗培养方法等进行了新的尝试与改良；通过细致的显微观察，对大白菜小孢子离体培养过程中的胚胎发生和自然加倍机理进行研究与探讨。 大白菜小孢子提取过程中进行短期的预处理，增加 取培养基的蔗糖浓度、添加适当浓度的甘露醇不会影响小孢子的活力，却潜在影响了后期小孢子培养的脱分化，明显提高了离体小孢子培养的胚胎诱导率。 取培养基两组处理中，蔗糖浓度为 17%和甘 露醇浓度 8%的处理效果最好，各材料每皿平均出胚量与对照相比都达到极显著水平。参试的 9 份材料显示两组处理都有效的提高了大白菜小孢子的出胚量，但大白菜基因型仍然是影响小孢子胚胎发生的主要因素。 大白菜小孢子子叶期胚移植成苗实验表明，子叶期胚直接转入 体培养基进行 25 /16h 光照培养，大多数胚状体子叶变肥厚，愈伤化，往往要通过二次分化才能发育为正常植株。对 5 份参试材料培养的子叶期胚进行 4低温前处理，低温处理虽然不能完全克服大白菜不同基因型子叶期胚向植株移植培养的差异，但能有效降低培养过程胚的死亡率，与对照 相比都不同程度提高了胚状体的成苗率，同时大部分子叶期胚能不经过二次分化而快速的生长为正常植株。比较各处理 8周的培养结果， 4低温 10 天处理与对照相比在子叶期胚的成苗率和死亡率上都达到最佳效果。 通过显微观察，诱导适期的大白菜小孢子是成功获得胚状体的前提，单核靠边期小孢子经热激诱导启动的标志是圆球型小孢子体积明显膨大，同时观察到细胞核发生自然加倍，单核小孢子变为二倍体的单细胞。说明大白菜小孢子在培养初期就可能完成胚胎的自然加倍。显微观察发现热激诱导启动下，大白菜小孢子的胚胎发育途径是几种方式并存的，但以 B 途径 为主要发育途径，此外还存在少量的 A 途径发育和不对称分裂的细胞团。启动后以 B 途径为主要发育途径的大白菜小孢子离体培养 48 小时发生第一次细胞分裂，形成两个对称的子细胞，离体培养 72 小时发生第二次细胞分裂，形成对称的四细胞团，之后细胞团继续对称分裂最终形成胚状体。 键词： 大白菜，小孢子培养，自然加倍， B 途径，蔗糖，甘露醇，低温预处理 is to A to In of to of of to n to . of of 5 of a on of In to of at 5 so 5 6h of to to to 5 an of )5 in In of of 0d. of be to up of to be is be of 8 of 2 of to is A be , V 目 录 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 . 1 1 1 发展进程 . 1 1 2 研究现状 . 2 1 2 1 供体植株对小孢子胚胎发生的影响 . 2 1 2 2 小孢子的诱导时期 . 3 1 2 3 小孢子胚胎发育途径 . 3 1 2 4 培养技术 . 4 1 2 5 小孢子胚诱导再生植株的研究 . 6 1 3 游离小孢子培养技术的应用前景 . 7 1 3 1 在育种上的应用 . 7 1 3 2 在基础研究上的应用 . 7 1 3 3 应用于种子生理研究和种质保存 . 8 1 4 存在的问题及展望 . 8 1 5 本研究的目的和意义 . 9 第二章 蔗糖、甘露醇预处理对大白菜小孢子培养 胚胎发生的影响 . 10 2 1 引言 . 10 2 2 试验材料与方法 . 10 2 2 1 试验材料 . 10 2 2 2 主要试剂 . 10 2 2 3 试验方法 . 10 2 3 结果与分析 . 11 2 3 1 提取培 养基成份对大白菜小孢子胚胎诱导的影响 . 11 2 3 2 高浓度蔗糖、甘露醇 取培养基对小孢子培养的影响 . 12 2 3 3 良培养基提取大白菜小孢子 25直接培养的胚胎诱 导 . 18 2 4 小结 . 19 第三章 低温预处理对提高大白菜小孢子胚状体成苗率 的研究 . 20 1 引言 . 20 3 2 材料与方法 . 20 3 2 1 材料 . 20 3 2 2 试剂 . 21 3 2 3 方法 . 21 3 3 结果与分析 . 21 3 3 1 低温处理对大白菜子叶期胚生长发育的影响 . 21 3 3 2 低温处理对大白菜子叶期胚成苗转化的影响 . 22 3 4 小结 . 26 第四章 大白菜游离小孢子培养的胚胎发生及发育途径 . 27 4 1 引言 . 27 4 2 材料与方法 . 27 4 2 1 材料 . 27 4 2 2 方法 . 27 4 3 结果与分析 . 27 4 3 1 大白菜离体培养的适期小孢子形态 . 27 4 3 2 经热激诱导启动的小孢子形态 . 28 4 3 3 大白菜小孢子启动后的细胞分裂 . 28 4 3 4 胚状体发育的不同步性 . 29 4 4 小结 . 30 第五章 大白菜游离小孢子培养胚胎发生的加倍机理 . 31 5 1 引言 . 31 5 2 材料与方法 . 31 5 2 1 材料 . 31 5 2 2 试剂 . 31 5 2 3 试验方法 . 31 5 3 结果与分析 . 32 5 3 1 大白菜小孢子的配子体发育 . 32 5 3 2 大白菜小孢子诱导启动后核的分裂 . 32 4 小结 . 35 第六章 讨论与结论 . 36 6 1 预处理对大白菜小孢子胚胎发生的影响 . 36 6 2 低温预处理对大白菜子叶期胚向植株移植培养的影响 . 37 6 3 大白菜游离小孢子培养的胚胎发生及发育途径 . 38 6 4 大白菜游离小孢子培养细胞分裂以及核加倍机理 . 39 6 5 结论 . 40 参考文献 . 42 附 录 . 48 致 谢 . 52 作者 简历 . 53 略词表 4， 6盐酸 4， 6二 脒基 2苯基吲哚 养基：蔗糖浓度为 13%的 养基 养基：无蔗糖的 养基 体再生培养基：蔗糖浓度为 琼脂浓度 养基 养基：蔗糖浓度为 13%的 养基 单核靠边期小孢子： 从四分体释放出来的小孢子随体积增大，小孢子 细胞质发生液泡化，逐渐形成一个中央大液泡，细胞核随着从中央移到细胞的一侧，此时的小孢子称为单核靠边期小孢子。 胚胎发育 A 途径 ： 小孢子诱导脱分化启动后，小孢子核由正常的有丝分裂形成一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞。以后营养细胞继续分裂，产生一个单倍体的球型胚状体，胚状体最终由于花粉外壁的破裂而被释放出来。 胚胎发育 B 途径 ： 小孢子诱导脱分化启动后有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞，这两个均等细胞再继续分裂，最终形成胚状体。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 1 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 芸薹属植物种 质资源十分丰富，在我国栽培的芸薹属植物中一部分是重要的叶菜类蔬菜，一部分是油料作物，二者在国民经济中都占有重要的地位。我国在芸薹属植物常规育种方面成绩显著，但随着育种目标的不断推进，仅仅依靠常规育种手段已经不能满足育种工作的需要。单倍体育种技术为缩短育种年限、提高育种效率提供了可能。游离小孢子培养是获得单倍体的主要途径之一，随着小孢子培养方法的日趋完善，这一技术开始被广泛应用于常规杂交育种，逐渐成为作物改良和新品种培育工作的一个重要手段。 游离小孢子培养是在花药培养基础上发展起来的单倍体诱导技术，由于小孢子 为单细胞，具有天然的分散性，数量巨大，易于获得，它克服了花药培养的诸多缺陷，同时它是一种在单细胞水平上获得纯系的培养方法，能直接利用高等植物的未成熟花粉即小孢子离体培养成单倍体植株，再经过人工或自然加倍而成为纯合的二倍体植株。在植物育种、基因工程以及生理研究等方面显示出广阔的应用前景，从而受到研究人员的广泛亲睐。 1 1 发展进程 1972 年 用看护培养法培养番茄的离体花粉，获得了单倍体无性繁殖系；之后 1973）首次成功应用游离小孢子培养技术获得了毛叶曼陀罗的小孢子胚与再生植株；二十 世纪 80 年代， 1985； 1986）在烟草上成功建立了有效的游离小孢子培养体系，并对小孢子的离体萌发和离体胚胎发生的调控进行了研究。 1982 年， 次报道了甘蓝型油菜小孢子培养成功获得了小孢子胚及其再生植株，使十字花科芸薹属作物游离小孢子培养技术进入快速发展阶段。在此后的二十年间，游离小孢子培养技术先后在芸薹属作物的结球甘蓝、大白菜、花椰菜、小白菜、黑芥、叶芥、青花菜等十余种蔬菜中获得成功，并在材料基因型、培养基、培养方法和培养条件、胚状体的植株再生和加倍等方面的研究取得了一 定进展（ 1989；1989；张凤兰等， 1994；王蒂等， 1996），使游离小孢子培养技术体系得到不断地完善。 表 1薹属作物游离小孢子培养获得再生植株一览表 of 号 称 丁名 表作者 表时间 甘蓝型油菜 982 2 埃塞俄比亚芥 982 3 黑芥 989 4 大白菜 989 5 羽衣甘蓝 989 6 结球甘 蓝 990 7 青花菜 991 8 芥蓝 991 9 小白菜 992 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 2 10 油用芜菁 992 11 花椰菜 992 12 白菜型油菜 992 13 根芥 岩 1992 14 抱子甘蓝 992 15 芜菁甘蓝 993 16 芜菁 994 17 紫菜薹 光涛 1996 18 菜薹 996 19 包心芥菜 玉萍 1998 20 球茎甘蓝 准 1999 1 2 研究现状 1 2 1 供体植株对小孢子胚胎发生的影响 1 2 1 1 基因型对胚胎诱导的影响 在芸薹属植物游离小孢子培养中，供体植株的基因型是影响小孢子胚胎发生的关键因素。这主要体现在两个方面。一方面，不同基因型决定供体植株是否能够诱导出胚，另一方面体现在不同基因型诱导出胚的产胚率的差异。余凤群等（ 1995）用 130 份甘蓝型油菜进行小孢子培养，有35 份获得胚状体；张德双等（ 1998）诱导 13 份青花菜材料，有 8 份材料有胚胎发生；严准等（ 1999）在同样条件下对 4 种甘蓝类材料进行游离小孢子培养，只有苤蓝有胚状体产生，青 花菜只诱导出大量愈伤组织，青苤蓝和结球甘蓝既无胚状体又无愈伤产生，都证明了基因型对小孢子胚胎发生能力的影响。在大白菜游离小孢子培养中，曹鸣庆等（ 1993）对 17 个不同基因型大白菜，包括了早熟到晚熟的各种类型进行培养。结果显示：供试的 17 份大白菜中有 16 个基因型获得了小孢子胚。栗根义（ 1993）对 13 份大白菜材料进行培养，有 12 份材料诱导出胚。说明在适宜的条件下，大白菜的大多数基因型都可以通过游离小孢子培养的方法获得小孢子胚。 此外，供体材料的不同基因型之间产胚率也存在较大差异。曹鸣庆等（ 1993）研 究发现：产胚率最高的大白菜材料其平均产胚率可达 350 个 /蕾，而大多数基因型的大白菜平均产胚量在 2 个/蕾以下。栗根义（ 1993）在大白菜游离小孢子培养不同基因型胚诱导效果中也得到相同结论。997)研究大白菜不同品种的小孢子培养的胚胎发生能力，发现热带品种有较高的胚胎发生能力，而日本当地品种则较差。刘凡（ 2001）调查大白菜小孢子胚胎发生能力与植株类型的关系时发现，小孢子胚胎发生能力与大白菜抱合类型、熟性有一定相关性，其中，叠抱类型产胚率高于合抱类型，早熟类型产胚率高于中、晚类型。芸薹属其他 植物如菜心、芥蓝等在胚状体的诱导率上也同样受到基因型的显著影响（朱允华等， 2003；何杭军等， 2004；王涛涛等， 2004）。 1 2 1 2 供体植株生长条件对胚胎诱导的影响 由于小孢子活力受供体植株影响，因此，供体植株生长的环境条件直接影响了游离小孢子培中国农业科学院硕士学位论文 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 3 养的胚状体诱导频率。一般从发育健壮、在适宜环境条件下生长的供体植株采集花蕾培养胚状体的效果较好，但不同品种适宜的环境条件不同。 为（ 1989）大白菜供体植株生长的最适条件是日照 1418 小时，温度 1520。张凤兰、钉贯靖久等（ 1994）利用人工 气候室研究了光照和温度对大白菜小孢子胚胎发生的影响，结果表明对胚状体发生能力较强的品种，在 14h 长日照和 15度条件下出胚率显著高于 12h 短日照、 25温度条件下生长的植株；对胚状体发生能力较弱的品种，环境条件对小孢子培养影响显著，供体植株生长在日照 1 4 小时、温度 15条件下小孢子诱导成胚率最高。花椰菜培养采自生长在春天 1020温室的供体植株效果最好（ 1992）。 为了获得活力较高的小孢子，供体植株的栽培季节也很重要。曹鸣庆（ 1993）认为大白菜的开花季节为 45 月，此时温度 一般较高，为了提高小孢子胚胎发生率应把供体植株花期安排在冬季和早春。花椰菜的花药培养也是冬、春季效果好于夏、秋季（ 1992）。除日照、温度外，供体植株营养状况也影响小孢子培养的胚胎发生； 1988）认为供体植株栽培过密会减少小孢子胚胎发生频率。因此为供体植株创造适宜的生长条件，使其不受逆境冲击，是提高小孢子培养出胚率的重要保证。 1 2 2 小孢子的诱导时期 小孢子的发育时期通常分为单核期、二核期和三核期。理论上每个小孢子都具有细胞全能性，但实际培养中并非任何时期的小孢子都适于培养，只有 那些处于一定发育时期的小孢子离体后才可能从原来配子体发育途径经诱导转换到孢子体发育途径形成胚状体，并进一步分化成植株。在植物花药和花粉培养中，小孢子最适于培养的时期通常为单核花粉期和二核花粉早期，芸薹属植物也是如此（ 1988； 1988），因而如何获得尽可能多的适合发育时期的小孢子群体就成了游离小孢子培养的关键因素。 984)在进行甘蓝型油菜花药培养时曾指出，花蕾的形态是判断小孢子发育阶段的可靠指标，但它也随着供体植株基因型、生长条件和年龄、花序等的变化而变化。 1989）显微观察结果表明：大白菜小孢子诱导胚胎发生的最佳时期为单核中期至单核晚期；曹鸣庆（ 1993）报道大白菜花蕾在 2小孢子处于单核中期至单核晚期的比例最大，小孢子胚的产率最高。当大白菜花蕾长度小于 大于 ，均不能诱导小孢子胚胎发生。 （ 1975）在进行白菜型油菜花药培养、 （ 1984； 1985）进行抱子甘蓝花药培养、 （ 1986）在进行甘蓝花药培养时都发现小孢子的发育阶段和花蕾中花瓣 /花药长度比密切相关。此外，也有以双核期小孢子比 例作为小孢子群体是否适宜培养的指标。张德双等认为双核期小孢子比例对青花菜游离小孢子培养影响较大，只有比例适宜，才能获得大量小孢子胚，因为青花菜同一花蕾中小孢子发育极不同步，依据花蕾或花瓣与花药长之比来确定最适合的小孢子培养时期都有较大的不确定性（ 1998）。因此在芸薹属植物的实际培养中要根据不同品种，依据不同的形态指标来获取最适宜诱导的小孢子群体。 1 2 3 小孢子胚胎发育途径 人们在研究禾本科作物的游离小孢子培养发现，小孢子形成花粉植株的发生过程存在雄核发育的多途径并存现象，芸薹属在这一领域的研究还未见详 细报道。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 4 目前，根据脱分化启动的小孢子第一次分裂情况将胚胎发育途径分为 A 途径（不均等分裂）和 等分裂）两大类，其中 A 途径又可以根据第二次分裂及其以后的情况作进一步的细分。在水稻、小麦、大麦、玉米的相关研究中都报道了小孢子胚胎发育的多途径现象，但产生的原因目前尚无公认的确切解释。朱至清等（ 1988）在研究小麦雄核发育时发现胚胎发育以 A 途径为主和 B 途径为主受基因型影响；郭向荣等（ 1997）研究大麦小孢子培养发现不同预处理方法改变离体小孢子的第一次有丝分裂方式，从而形成不同的主要发育途径。低温预处理胚胎发 育以 A 途径为主，直接游离培养以 B 途径为主；此外，还有不少研究者认为胚胎发育以 A 途径为主还是 B 途径为主与小孢子培养时所处的发育阶段密切相关（ 1980；何定纲， 1985）。 1 2 4 培养技术 1 2 4 1 预处理 在游离小孢子培养过程中，为了诱导小孢子的胚胎发生往往需要进行预处理。预处理的目的是通过外界的胁迫作用使小孢子发生一系列的生理生化变化，促使小孢子完成脱分化启动，从而改变小孢子的发育途径。目前见于报道的主要预处理方法包括：高温预处理、低温预处理、甘露醇预处理、秋水仙素预 处理和饥饿预处理。不同物种采用的预处理方法不同。预处理首先在曼佗罗和烟草上取得较好的试验结果，此后在茄科作物中， 1997）对辣椒的花药培养采用低温预处理获得明显的胚诱导效果； 1996）在茄子花药培养中进行蔗糖的饥饿预处理和 3天 35高温预处理获得很好的胚诱导效果。在禾本科的花药和小孢子培养中对小麦、玉米采取30温预处理，水稻进行 9温预处理，大麦进行甘露醇预处理都取得了明显效果（郭向荣等， 1999）；在十字花科芸薹属作物中， 1985）首次报道在油菜游离小孢子培养中将直接分离的小孢子群体在 32条件下高温预处理 3 天再转入 25培养，结果与 25培养效果有明显差异。此后 1988）和 1978）完善了高温预处理技术，使甘蓝型油菜小孢子培养胚诱导率明显提高。栗根义（ 1993）在大白菜游离小孢子培养中认为高温预处理对大白菜小孢子胚诱导是很必要的，它改变了细胞的发育途径，促进胚胎的形成。刘公社（ 1995）研究大白菜小孢子培养发现高温预处理可抑制小孢子的配子体发育途径，有效的提高单核小孢子核对称分裂的频率，同时实验结 果表明游离小孢子存在高温敏感期，即小孢子在 32培养 1 天便可达到最佳胚诱导效果，如果热激时间过长反而影响小孢子的活力。高温预处理在芸薹属其他植物如结球甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜等小孢子培养中都获得明显的胚诱导效果（ 1981；1989； 1990）。另外，在油菜的小孢子培养中还采取低温预处理。王亦菲（ 2002）报道油菜在 4低温预处理 1脱分化启动最为有利。余凤群（ 1995）报道甘蓝型油菜 6 理 1d 胚诱导效果最好。目前低温预处理的方法在油菜中被 普遍采用，但在其他芸薹属植物中还未见报道。此外， 996)在甘蓝型油菜的游离小孢子培养中用秋水仙素预处理对比高温预处理，获得的小孢子再生植株加倍率达 90%，明显高于高温预处理获得的小孢子植株 6%的二倍体比例。顾宏辉（ 2004）在白菜型油菜小孢子培养中进行秋水仙素预处理也显著提高了小孢子胚产率和再生植株的二倍体株率。因此，在游离小孢子培养中前期的预处理是非常必要的，它不仅提高了小孢子胚产率，同时采取不同的预处理方法也会影响小孢子再生植株的二倍体株率。 1 2 4 2 培养基 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 5 培养基是诱导 胚胎发生的基础，用于小孢子培养的培养基成分因植物材料的不同而差异较大，但其组成应尽可能确保维持小孢子活力，提供小孢子胚胎发生所必需的有机、无机成分，以达到高的胚诱导频率。一般来说，小孢子提取液多参考原生质体的分离液，而培养基则多借鉴同种植物花药培养的培养基（刘公社，朱自清等， 1993）。十字花科植物花药培养和游离小孢子培养中诱导胚状体生成的基本培养基见于报道的主要有 。 1982 年 用改良的 养基获得甘蓝型油菜胚状体，使 养基在芸薹属作物中被广泛应用。与 5 等培养基相比， 主要特点是大量元素含量较低。余凤群（ 1995）比较了 5、 1/2 1/2养基对甘蓝型油菜游离小孢子的影响，发现在 养基上未产生胚状体，在 1/2 1/2养基上形成少量胚状体，在 养基上获得大量胚状体，由此认为小孢子胚易于发生在离子浓度低的培养基中。其他添加物，如脯氨酸和谷氨酰胺对胚状体的诱导有促进作用。脯氨酸能加速小孢子分裂，促进胚状体发生，谷氨酰胺对胚状体正常发育有利，两者配合，能降低畸形胚的发生，从而提高再生植株率。 芸薹属 植物游离小孢子培养培养基中的糖类不仅提供了小孢子发育所需的碳源，同时也起到调节渗透压的作用。不同糖类具有不同的生理效应，在大白菜游离小孢子培养中，培养基使用的碳源主要为蔗糖， 1990)在对大白菜小孢子培养的研究中比较了蔗糖与麦芽糖的作用效果，设计了 7%、 10%、 13%三个浓度梯度，发现小孢子胚产率随糖浓度增高而提高，蔗糖的出胚率高于麦芽糖的，且培养基中麦芽糖浓度超过 10%反而抑制小孢子的胚胎发生。大白菜小孢子培养选择的最适蔗糖浓度为 10% 1991）认为蔗糖是诱导分 裂所必须的，它能有效提高小孢子的胚胎发生能力。也有学者认为高浓度的蔗糖可保持小孢子的活力，而低浓度蔗糖能促进小孢子分裂及进一步发育。在芜菁培养中，先用 16%的蔗糖培养基培养 2换成蔗糖为10%培养基，可使培养效率明显提高（陈军等， 1995）。 一般来说，培养基的外源激素是小孢子培养中必不可少的成分，但关于外源激素对小孢子胚胎发生和植株再生的影响还未取得一致认识。许艳辉（ 2001）报道 6大白菜小孢子胚胎发生有一定的促进作用，但对难成胚基因型作用不大。李岩（ 1993）发现培养基中加少量 激素（ A）有利于小白菜游离小孢子胚胎发生，其胚产量明显高于不加外源激素的对照。而 1989）认为不含激素的培养基与加有 6培养基对胚状体诱导效果相同。张德双（ 1999）在对花椰菜的研究中也认为外源激素不是诱导胚胎发生的必要因素，这在茄科作物的小孢子培养中也有体现。但目前仍不能排除外源激素在小孢子雄核发育过程中所起的作用。 此外铁盐也是培养基的一个重要组成部分，与胚状体的正常发育密切相关，缺铁将导致幼胚停止发育（ 1972）；但铁盐浓度过高也会抑制小孢子的胚胎发生 ， 992)认为低浓度铁盐有利于油菜小孢子的胚胎发生，而李光涛等（ 1996）诱导紫菜苔小孢子胚状体时认为培养初期较高浓度铁盐有利于小孢子的胚胎发生，因而在实际培养中要根据不同材料适当调整培养基中的铁盐浓度。 另外，大量试验研究表明培养基中添加适量活性炭也能明显促进小孢子的胚胎发生（刘凡，2001），这可能是活性炭在游离小孢子的培养过程中吸附了小孢子释放的有毒物质。申书兴（ 1999）研究大白菜小孢子培养认为添加适量活性炭不仅提高小孢子的产胚率，尤其对胚胎发生难诱导的基因型效果显著。此外， 992)认为培养基的 也会影响胚胎发生， 右有利于白菜胚的生成。 1998）等在培养基中加入硝酸银促进了青花菜的胚胎发生。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 芸薹属植物游离小孢子培养研究进展 6 1 2 4 3其他影响因素 游离小孢子培养中，小孢子由单细胞发育为胚状体受到诸多因素的影响。 1988）在研究甘蓝型油菜的游离小孢子培养认为小孢子在培养过程中会向培养基释放有毒物质，这些有毒物质大大降低了小孢子启动分裂的能力，故在培养期间更换新鲜的培养基或稀释培养基能促进小孢子胚胎的发生；顾宏辉（ 2004）研究白菜型油菜小孢子培养也获得 相同结论：小孢子培养中更换新鲜培养基比对照产胚量提高 。 早期的研究对小孢子培养的密度没有引起足够的重视， （ 1990）在油菜培养上进行了较为深入的研究表明小孢子密度高达 40000 个 /成的胚状体数量随密度的增加而增加，当密度超过 100000 个 /对小孢子的胚胎发生有害。一般在培养初期适当稀释小孢子浓度有利于已启动胚胎发生的小孢子更好的生长发育。 1991)研究甘蓝小孢子培养认为对胚胎发生能力强的基因型，适当降低小孢子浓度有利于胚的发育，此外， 1988）和 1988）认为对小孢子