【毕业学位论文】（Word原稿）免疫应激对肉仔鸡内源氨基酸损失和苏氨酸需要量的影响动物营养与饲料科学博士论文

密 级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 免疫应激对肉仔鸡内源氨基酸损失和 苏氨酸需要量的影响 h. D. i 摘要 本论文通过五个试验研究了免疫应激对肉仔鸡内源氨基酸损失和日粮氨基酸消化率的影响，以及免疫应激下不同日粮苏氨酸 /赖氨酸比例对肉仔鸡生长性能、胴体性状、蛋白质和脂质代谢及免疫功能的影响。 试验一选用 400只 16 日龄的 公鸡，随机分配到 4 个试验组中，每组 100 只鸡， 3 个处理组 试鸡腹腔注射不同剂量（ 500、 1000 和 1500 g/W）的细菌脂多糖（ 对照组试鸡注射生理盐水， 18 和 20 日龄按首次剂量重复注射。在第 3 次注射后不同时间采集血液和脾脏样品，测定激素水平和免疫功能。结果表明：（ 1） 活应激轴而抑制生长轴，在注射后 2、 4和 8 h，血清皮质酮水平显著提高（ 在注射后 2 h 和 4 h， 但 24 h 时又呈现出与 2 （ 2） 强细胞免疫功能，处理组试鸡血液和肝脏中的淋巴细胞受刀豆蛋白 A（ ）刺激及血液中淋巴细胞受植物血凝素（ 激的转化率显著提高（ （ 3） 试验三选用 750 只 1 日龄 公鸡，按 2 5（ 2种免疫状态 5 个苏氨酸 /赖氨酸比例）因子设计，随机分配到 10 个处理中，每处理 5个重复，每个重复 15 只鸡。免疫应激组鸡只分别于16、 18 和 20 日龄，按 500 g/照组鸡只同日注射生理盐水。日粮可消化苏氨酸 /赖氨酸比例分别为 54/100、 61/100、 67/100、 70/100和 73/100。21日龄试验结束，测定生长性能、血清激素水平和 胴体品质。结果表明：（ 1）免疫应激降低肉仔鸡采食量和增重，提高了耗料 /增重比（ （ 2）升高日粮苏氨酸 /赖氨酸比例促进体蛋白增长（ 试验五选用 300 只 1 日龄 公雏，按 2 5 因子设计要求，随机分配到 10 个处理中，每个处理 30只鸡。免疫应激组分别于 16、 18和 20日龄，按 500 g/照组同日注射生理盐水。 5 种日粮可消化苏氨酸 /赖氨酸比例分别为 54/100、 61/100、 67/100、70/100和 73/100。试验至 26日龄结束。试验期间称量免疫器官重量并计算器官指数，试验结束时测定血清总蛋白和白蛋白浓度及两种抗原（ 抗体效价，并分离外周血淋巴细胞，测 定淋巴细胞培养液中 浓度。结果表明：（ 1）免疫应激提高了肉仔鸡法氏囊和脾脏指数及淋巴细胞培养液中 度（ 3 4/T3 h 4 h 3 4/T3 h ( (2) of in in (3) in a , 750 A 0 of to 4/100, 61/100, 67/100, 70/100 3/100 On of 00 g/W PS in in On of as (1) of (2) of 在注射后 2 h 和 4 h， 但 24 h 时又呈现出与 2 h 或4 h 时相反的变化（ （ 2） 激组试鸡血液和脾脏中的淋巴细胞受刀豆蛋白 A（ ）刺激及血液中淋巴细胞受植物血凝素（ 激的转化 率显著提高（ （ 3） 进了试鸡脾脏中 表达（ 可见机体发生了从应激到适应的变化， 24 600700800900100011001200130014002 4 8 24注 射 后 时 间 （ h ）PS h)前列腺素pg/ L P S （ 5 0 0 ）+ L P S （ 1 0 0 0 ） + L P S （ 1 5 0 0 ）2 3 脂多糖刺激对肉仔鸡生长轴激 素的影响 肉仔鸡血清 4/图 11应激轴激素相反， 4向 对照组相比，注射 2 h 和 4 h，血清 但在注射后 24 理组的 1994）报道，皮下注射 100 g/W 或 10 g/W 的 绝食鼠血浆 平在注射后 30 分钟就降低， 1 4 0 90%， 24 变化程度和持续时间与 H 是腺 垂 体激素中极 其 重要的免疫调节因子 ，免疫系统的单核细胞和淋巴细胞中均存在 c bc a b c bc a b a b ac c 图 1脂多糖刺激对肉仔鸡血清 平的影响 PS on 3 of 1脂多糖刺激对肉仔鸡血清 3比值的影响 PS on 4/T3 in 脂多糖刺激对肉仔鸡血清 4 3 比值 的影响PS on 3 of a b ac bc a b c bd b a b b 中国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 21 可由 的介导而间接作用于免疫细胞 。 1996）、 1995）报道， 高抗感染能力。本试验 H 水平的影响不显著可能与 外，本试验胰岛素水平未见显著变化（ P这与 1997）在生长猪 上观察到的结果一致。 表 1多糖刺激对肉仔鸡血清生长激素和胰岛素水平的影响 PS on H of 理 长激素 ng/胰岛素 U/射 时间 PS 射 时间 PS 4 8 24 2 4 8 24 生理盐水 多糖 500g/ 多糖 1000g/ 多糖 1500g/ 值 P 多糖 间 作 1多糖刺激对肉仔鸡血清 平的影响 PS on H of 8 24注射 L P S 后 时 间 （ h ）PS h)生长激素GH(ng/00)+000) +500)中国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 22 8 24注 射 后 时 间 （ h ）PS h)胰岛素IU/ L P S （ 5 0 0 ）+ L P S （ 1 0 0 0 ） + L P S （ 1 5 0 0 ）2 4 脂多糖刺激对肉仔鸡细胞免疫功能的影响 由于机体免疫系统的复杂性，评价免疫功能应采用多指标联合检测的方法，在器官、细胞和分子等不同层次上进行。近年来，在动物营养免疫学研究中，主要采用淋巴细胞转化试验、 T 细胞亚群测定技术、迟发性超敏反应、细胞因子检测技术、 测定抗体 或急性期蛋白水平 等 对免疫状态作出定性评价 。 如 （ 2002）将血液异嗜细胞 对 淋巴细胞（ H/L） 的 比值 、 血浆铜蓝蛋白 和 酸 基糖蛋白）含量 提高 作为衡量 导的免疫 应激 的 标志。 （ 1997c） 通过比较血 清 全血 +来评价 不同饲养方式（隔离饲养和传统饲养） 下 仔猪 的 免疫激活程度 。 1991）通过 含量对鸡免疫机能影响。 细胞免疫技术 是衡量免疫功能 的重要 手段，包括免疫细胞及其亚群的计数和活性测定， 淋巴细胞增殖是免疫反应的起始阶段，增殖能力提高意味着免疫功能增强。 T 淋巴细胞是 机体免疫应答的核心细胞，正常的免疫应答是各种免疫细胞、尤其是 本试验通过测定淋巴细胞的体外增殖能力及 2 4 1 脂多糖刺激对肉仔鸡淋巴细胞转化率的影响 T 淋巴细胞的增殖和分化程度直接反映动物的细胞免疫机能状态。 能直接刺激体内 能通 过刺激单核巨噬细胞产生 者再刺激 T 淋巴细胞的增殖和分化。 （ 1994； 1996）报道，免疫应激提高仔猪 T 淋巴细胞转化率。本试验 、 B 淋巴细胞体外增殖能力的影响见表 1图 1以看出， 与对照组相比，注射 现在淋巴细胞在体外受丝裂原刀豆蛋白 A（ ， ）和植物血凝素（ 激后的刺激指数（ 高。具体结果是：当 量为 500 g/W 时，试鸡血液中淋巴细胞受丝裂原刺激后的 0%（丝裂原为 26%（丝裂原为 均达到显著水平（ 淋巴细胞在体外对刺激图 1多糖刺激对肉仔鸡血清胰岛素水平的影响 PS on NS of 国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 23 原的反应性与其在体内的增殖、分化程度呈正相关（杜念兴等， 1997）， 高意味着体内免疫机能的增强。 本试验结果同时表明：把 刺激剂量从 500 g/W 提高到 1000 g/500 g/W，试鸡血液和脾脏中淋巴细胞的体 外增殖能力没有明显变化（ P 表 1脂多糖刺激对肉仔鸡淋巴细胞转化率（刺激指数）的影响（ PS on I) of 理 液中 In 脾脏 In 豆素 A 植物血凝素 刀豆素 A 植物血凝素 理盐水 多糖 500g/ 多糖 1000g/ 多糖 1500g/ 值 P 素 A C o n A 植 物 血 凝 素 P H A 刀 豆 素 A C o n A 植 物 血 凝 素 P H L P S （ 5 0 0 ）+ L P S （ 1 0 0 0 ）+ L P S （ 1 5 0 0 ）注：柱状图表示的刺激指数左侧是血液中的淋巴细胞、右侧是脾脏中的淋巴细胞。 2 4 2 脂多糖刺激对肉仔鸡 淋巴细胞在分化过程中产生能被特异性抗体识别的表面分子，据此可以将其分为不同的亚群。不同亚群具有不同的功能且相互作用， 正常的免疫应答是各种免疫细胞，尤其是 T 细胞是 机体免疫应答的核心细胞， 具有 原的 T 细胞为成熟的 T 细胞、具有 原的 T 细胞为辅助性 T 细胞（ 具有 原的 T 细胞为细胞毒性 T 细胞（ 抑制性 细胞的功能是把 T 细胞抗原受体与外来结合的抗原信息传递到细胞内，启动细胞内的活化过程； 可促进 T、B 细胞的免疫应答，活化的 细胞具有杀伤靶细胞和抑制 B 细胞产生及其它 T 细胞分化增殖的功能。 T 细胞亚群的检测是研究机体免疫机制和评价免疫功能的重要内容（杨汉春， 2003）。淋巴细胞中 比例减少、 比例升高、 对 比值降低意味着免疫激活程度低（ ， 2000a， b；1993b； 1997c； 1996； 1985），反之则意味着免疫激活程度高 。 a b ab a b b b b a b a 1脂多糖刺激对肉仔鸡淋巴细胞转化率（刺激指数）的影响 PS on of 国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 24 试鸡血液和脾脏 11以看出， 著提高了血液中 和 的比例（ 和 的比例（ 这与 （ 1994）的试验结果一致。他发现，注射 淋巴细胞转化率无显著影响。分析原因有以下两个方面：（ 1） 分子大小还不足以影响体液免疫。杜念兴（ 1997）报道，免疫原的大小影响体液免疫水平，分子量小的免疫原可能只引起细胞免疫，不影响体液免疫水平。（ 2） 种应激在 24 h 内 即恢复正常，而病毒抗原的初次免疫应答有较长的潜伏期。因此认为本试验这种注射 图 1脂多糖刺激对 肉仔鸡血液和脾脏中 比例的影响 PS on +T in of a b c b 图 1脂多糖刺激对肉仔鸡脾脏 T 细胞亚群的影响 PS in of a b b a b b c c a b ac 国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 26 方式主要是诱导肉仔鸡发生以细胞免疫为主的应激反应。 表 1脂多糖对肉仔鸡血清新城疫病毒 体效价（ 影响 PS on I DV of 理 射疫苗后天数 7d 10d 生理盐水 多糖 500g/ 多糖 1000g/ 多糖 1500g/ 值 P 1免疫后天数I)00)+000) +500)2 6 脂多糖刺激对肉仔鸡脾脏中 达的影响 细胞因子（ 免疫细胞及其相关细胞产生的一类具有激素样活性的蛋白质多肽分子，免疫系统对抗原的应答始自细胞因子的分泌，细胞因子又激活细胞免疫作用和体液免疫作用。因此，细胞因子在免疫应答与免疫调节中发挥重要作用。另外，近年来研究发现，由免疫应答引起的代谢变化是由细胞因子（ 行调节的（ 1987；1998； 1997； 1997； 1988b）。细胞因子的检测在评价免疫状态、探讨免疫应激发生机制及 免疫的营养调控中都有重要意义。 细胞因子种类繁多，白细胞介素 干扰素 动物体内两种重要的细胞因子。 于细胞因子网络的中心位置，具有广泛的免疫增强活性，能促进 T、 B 淋巴细胞增殖，抑制 强 然杀伤细胞（ 胞）和淋巴因子激活的杀伤细胞（ 活性（ 1998）。 肿瘤作用，也是体内重要的免疫调节因子，它通过与效应细胞表面受体结合，能促进 表达，增强 持和增强 胞的杀伤活性和巨噬细胞功能。淋巴细胞内 疫功能将受到抑制。 检测细胞因子有生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法，本试验采用分子生物学的方法，图 1脂多糖对幼龄肉仔鸡血清新城疫抗体效价（ 影响 PS on I DV of 国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 27 借助于 术，来检测家禽重要的外周免疫器官 脾脏中 测结果见表 1图 1 表 1脂多糖刺激对肉仔鸡脾脏中 达量（灰度比值）的影响（ PS on in 理 胞因子 介素 干扰素 生理盐水 多糖 500g/ 多糖 1000g/ 多糖 1500g/ 值 P 细胞因子00)+000) +500)与对照组相比， 进了试鸡脾脏中 表达（ （ 关键词： 免疫应激，肉仔鸡，内源氨基酸损失，消化率 前言 营养素既是免疫功能的物质基础，合理的营养供给又是克服免疫应激最重要的手段。研究免疫应激与肉仔鸡营养代谢的关系，有助于通过营养调控措施保障动物健康、提高经济效益。近年来，国内外对在不同免疫应激条件下猪鸡氨基酸需要量进行过一些比较研究，涉及的氨基酸主要是赖氨酸和蛋氨酸，对其它氨基酸的研究却很少。另外，至今尚未看到免疫应激是否影响肉仔鸡对日粮氨基酸消化、吸收的报道。本试验比较了两种免疫状态下肉仔鸡内源氨基酸损失 量的异同，然后测定日粮中氨基酸的消化率，为实现氨基酸需要量的针对性设计积累资料，也为研究免疫应激对肉仔鸡苏氨酸 /赖氨酸需求比例的影响作准备。 1 材料与方法 1 1 试验动物及分组 1 1 1 回肠末端内源氨基酸损失的测定 从两倍数量的预饲群中选用体重一致的 16 日龄商品代 50只，随机分为对照组、免疫应激组和采食量配对组，每组 5 个重复，每重复 10 只鸡，采用三层笼养。对照组和应激组的试验期为 16 21日龄，采食量配对组的投料量要根据应激组的采食量确定，试验期延后至 1722日龄。 1 1 2 日粮回肠末端氨基酸消化率的测定 中国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 30 与 用 16日龄商品代 公鸡 150只，随机分为对照组、免疫应激组和采食量配对组，每组 5 个重复，每重复 10 只鸡。其它过程和要求同 1 2 试验日粮 1 2 1 半纯合日粮 采用 （ 1990）及 1991）建 立的肽营养超滤技术测定回肠末端内源氨基酸损失。含酶解酪蛋白的半纯合日粮的组成及营养水平见表 2解酪蛋白购自北京双旋微生物培养基厂，总含氮量 12%，电泳检测分子量小于 6400了粗蛋白和氨基酸，半纯合日 粮其它指标与 表 2含酶解酪蛋白的半纯合日粮的 组成 of 料 % 营养水平 % 玉米淀粉 算值 葡萄糖 纤维 解酪蛋白 谢能 MJ/酸纤维素 粉 磷 酸氢钙 食盐 豆油 氯化胆碱 0%) 复合预混料 抗氧化剂 三氧化二铬 *复合预混料给日粮提供微量元素和维生素为（ mg/锰， 120；锌， 100；铁， 100；铜， 8；碘， ， 生素 A， 8000生素 1000生素 E， 20；维生素 胺素， 黄素， 酸， 酸， 生素 物素，酸， 生素 1 2 2 试验日粮 以可消化氨基酸体系 配制缺乏苏氨酸的 试验 日粮（玉米 花生粕型），作为试验三中的日粮 。由于现行国内外肉仔鸡饲养标准缺乏可消化氨基酸指标，本试验 日粮按 如下步骤 配制 ： （ 1）按 慧乐、周鼎年译， 议的公式计算可消化赖氨酸的需要量：可消化赖氨酸需要量 = 龄） = 0 21日龄公鸡，平均日龄 ）。该公式计算的可消化赖氨酸水平要求日粮代谢能为 J/国肉仔鸡饲养标准（ 2004）日粮代谢能为 J/此 对日粮的可消化赖氨酸水平进行调整，使日粮代谢能 /可消化赖氨酸比不变。调整后的日粮可消化赖氨酸水平： （ 2）按 1994）的肉鸡理想蛋白模式（表 2计算日粮中其它可消化氨 中国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 31 基酸水平。除氨基酸，日粮其它指标的水平达到我国肉仔鸡饲养标准要求（ 2004）。 （ 3）测定原料的总氨基酸含量，并参照味之素“动物营养（第七版）”建议值计算原料的 可消化氨基酸含量，据此配制缺乏苏氨酸的试验日粮，其组成及营养水平见表 2 表 21 21 日龄 肉鸡理想蛋白模式 1 1994) 氨基酸 率 基酸 率 赖氨酸 00 缬氨酸 7 蛋氨酸 6 精氨酸 05 含硫氨基酸 2 组氨酸 2 苏氨酸 7 亮氨酸 09 色氨酸 6 苯丙氨酸 +酪氨酸 05 异亮氨酸 7 表 2缺乏苏氨酸的试验 日粮 的 组成 of 原料 % 营养水平 玉米 测值 玉米蛋白粉 蛋白质 粕 赖氨酸 生粕 蛋氨酸 粉 蛋 +胱 酸氢钙 苏氨酸 盐 算值 小苏打 谢能 MJ/油 纤维 氨酸 灰份 氨酸 胱氨酸 磷 化胆碱 0%) 色氨酸 合预混料 * 180 抗氧化剂 防霉剂 * 二氧化钛 注： *黄曲霉毒素 g/*复合预混料给日粮提供微量元素和维生素为（ mg/锰， 120；锌， 100；铁，100；铜， 8；碘， ， 生素 A， 8000 生素 1000 生素 E， 20；维生素 胺素， 黄素，酸， 酸， 生素 物素， 酸， 生素 * 由百奥明化验所提供； *代表日粮电解质平衡值， 1 3 免疫应激的诱导和喂料方式 中国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 32 1 15日龄期间的饲养管理按 要求进行。 16日龄，应激组试鸡按 500 g/称 清型 5， 司产品，在注射前用无菌生理盐水溶解、 存）诱导免疫应激，并在 18 和 20日龄按首次剂量重复注射，以维持免疫应激状态。对照组试鸡同日注射等量无 菌生理盐水。采食量配对组注射生理盐水的时间分别为 17、 19和 21日龄。 应激组和对照组 18日龄前自由采食按我国肉鸡饲养标准（ 2004）配制的玉米 成见试验一中表 1 18日龄，先绝食 12 h，然后换料： 试鸡喂给表 2试验日粮。 18 和 19 日龄期间，挑出采食和精神状况不佳的试鸡。 20 日龄，从第 3次注射 生理盐水开始，以重复为单位分别称量 1天内应激组和对照组半纯合日粮（ 试验日粮（ 采食量。配对组在 19 日龄时换料 ， 21 日龄，从注射生理盐水开始的 1天内，将与应激组采食量等量的半纯合日粮（ 试验日粮（ 分 6次喂给。 1 4 样品收集与指标测定 1 4 1 收集食糜 第 3 次注射 生理盐水后第 24 h 时，每重复中取体重适中的 4 只鸡，颈部放血致死，迅速剖开腹腔，轻轻挤出回肠后段食糜（小肠卵黄囊息室至回盲瓣之间的后半段）。同一重复内 4只鸡的食糜混合为一个待测样品，盛放在塑料试管中，密封后置于 20冻存。 1 4 2 食糜样品的超滤（ 1991） （ 1）将上述收集到的 试鸡的食糜在 4解冻、混匀，取部分样品准确称量用于超滤，剩余部分用于测定 （ 2）待超滤的食糜首先于 1450 g、 0离心 45 分钟，将上清液转移置一洁净试管中，沉淀物加 5 轮混匀。 （ 3）沉淀物重复（ 2）两次。 （ 4）将（ 2）和（ 3）的上清液合并，用 行超滤，操作过程按超滤管使用手册进行。 （ 5）超滤后的大分子（分子量 10k 液与（ 3）离心后得到的沉淀物混匀、烘干，充分回潮 后称重，计算食糜经超滤后风干物质的百分含量（用 并测定样品中 17种氨基酸含量。 （ 6）将（ 1）中的剩余食糜样品称重、混匀，在与（ 5）相同的条件下烘干，充分回潮后称重，计算食糜不经超滤而直接烘干时风干物质的百分含量（用 （ 7）由于超滤造成食糜中非含氮小分子（分子量 但仍可注意到应激组缬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸比对照组低 10%以上。 应激组与配对组试鸡的采食量基本一致。与配对组相比，除了甘氨酸，应激组其余氨基酸的回肠末端内源流量增加，其中 8种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和精氨酸）及总氨基酸流量在两组间的差异显著（ 其余氨基酸及总氨基酸的内源流量减少幅度达到显著水平（ 对内源氨基酸损失进行校正后的消化率有较好的可加性、重复性（ ， 1997）。校正后的消化率有真消化率（ 标准消化率（ 分。仅用基础内源损失进行校正称为标准消化率，用基础损失加特殊损失进行校正叫真消化率。中国农业科学院博士学位论文 第三部分 试验研究 38 由于本试验采用基础损失进行校正，而没有考虑到日粮因素造成的特殊损失，因此结果称为标准回肠末端氨基酸消化率。据报道，标准消化率与真消化率很接近。此外，虽然内源氨基酸损失量与干物质采食量有关，但据现有资料来看，至今尚未弄清它们之间的定量关系。本试验利用肉仔鸡在免疫应激后 1天的内源损失（ mg/d）来计算标准消化率，没有考虑半纯合日粮和常规日粮采食量的差异。计算结果见表 2 表 2免疫应激对肉仔鸡日粮表观回肠末端氨基酸 消化率的影响 (n=5) of on of in of %） 从表 2看出，免疫应激组有 12 种氨基酸（天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸 、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸）的标准回肠末端消化率高于对照组和采食量配对组；采食量配对组有 4种氨基酸（苏氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸）的消化率高于其余两组；对照组只有甘氨酸消化率最高。与表观消化率一样，不同处理组间所有氨基酸标准回肠末端消化率的差异都不显著（ P 厌食是免疫应激降低动物生产性能的主要原因。 1998a）试验表明，隔日注射 E 400 g/羽使肉仔鸡在 13 22日龄间的采食量减少 14%（ 。 表 2免疫应激对肉仔鸡日粮标准回肠末端氨基酸消化率的影响 (n=5) of on in at of %） 氨基酸 照组 疫应激组 +食量配对组 冬氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 脯氨酸 甘氨酸 丙氨酸 半胱氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 组氨酸 氨酸 精氨酸 采食量 g a b b 本试验测定的 17 种氨基酸，表观消化率比标准消化率平均低 其次是色氨酸，达 脯氨酸和缬氨酸达 甘氨酸达 而赖氨酸（ 、蛋氨酸（ 和精氨酸（ 的两种消化率最接近。因此，用不同营养体系表示的理想蛋白模式