【毕业学位论文】（Word原稿）水稻印水型CMS恢复基因、金黄色颖壳和节间基因的初步定位作物遗传育种学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 水稻印水型 复基因、金黄色颖壳和节间基因的初步定位 .) .) 目 录 摘要 . I . 文缩略表 . 一章 文献综述 . 1 稻胞质不育和恢复基因的研究进展 . 2 稻细胞质雄性不育的主要类型 . 2 稻胞质不育机理和育性恢复机理 . 4 复基因的遗传 . 5 复基因的定位及克隆 . 7 稻颖壳和节间颜色基因的研究进展 . 10 稻颜色基因的研究进展 . 10 稻颖壳和节间颜色基因的研究进展 . 13 稻颜色基因的应用 . 14 子标记的类型及应用 . 16 子标记的类型及原理 . 16 子标记在水稻遗传研究中的应用 . 20 量性状基因的分子定位 . 21 因定位在水稻分子标记辅助选择中的应用 . 23 究的目的和意义 . 24 第二章 水稻印尼水田谷型 复基因的遗传分析和初步定位研究 25 料与方法 . 25 体构建和性状考察 . 25 子标记分析 . 26 据处理 . 28 果与 分析 . 28 典遗传分析 . 28 本和两池间多态性检测 . 29 复基因的定位 . 29 论 . 31 体构建和标记选择 . 31 尼水田谷型恢复基因的遗传和分子定位 . 32 复基因定位与辅助选择 . 33 第三章 水稻颖壳和节间颜色基因的遗传分析和基因初 步定位研究 . 34 料与方法 . 34 体构建和性状考察 . 34 子标记分析 . 35 据处理 . 35 果与分析 . 35 壳和节间颜色的遗传分析 . 35 黄色颖壳和节间基因定位 . 36 论 . 38 黄色颖壳和节间性状的遗传 . 38 黄色颖壳和节间基因的定位 . 38 稻颜色基因的应用 . 39 第四章 全文结论 . 41 论 . 41 稻印尼水田谷型细胞质雄性不育恢复基因的遗传分析和初步定位研究 . 41 稻颖壳和节间颜色基因的遗传分析和基因初步定位研究 . 41 望 . 41 参考文献 . 43 附录 . 53 致谢 . 55 作 者 简 历 . 56 I 摘要 恢复基因是杂种优势利用的基础，在三系杂交水稻品种选育中具有重要意义； 金黄色颖壳和节间基因在 三系杂交稻机械化制种和水稻品质育种中具有重要利用价值。 由 2000个单株组成的 印尼水田谷型不育系 中 9A /2代群体中，选取 389株进行恢复基因的遗传分析，并用82株完全不育单株作为定位群体，用极端个体分组和隐性基因组分析法定位恢复基因。首先利用分布于 12条染色体的 413对 果表明，位于第 1染色体的 0染色体的 亲本、两池间有多态，用着利用这 5个 2株完全不育单株进行分析，定位恢复基因。在上述 16株进行金黄色颖壳和节间基因的遗传分析，并用 75株金黄色颖壳和节间单株作为定位群体，用隐性基因组分析法定位金黄色颖壳和节间基因，用分布于 12条染色体的 413对 68进行分析，筛选亲本间 有多态的分子标记，以 75株金黄色颖壳和节间单株的 亲本间有多态的标记，筛选与金黄色颖壳和节间性状共分离的 算遗传距离。获得以下主要结果： 1 遗传分析表明，在中 9A/2群体中，印尼水田谷型细胞质雄性不育的育性恢复由两对显性恢复基因控制。 用 尼水田谷型细胞质雄性不育系的两对恢复基因 ， 分别位于第 1和第 10染色体 上 ；位于第 1染色体上的 恢复基因与 .7 位于第 10染色体上的 恢复基因与 分子标记间的距离分别是 基因的精细定位和分子标记辅助选择育种奠定了基础。 2 遗传分析表明，恢复系 金黄色颖壳和节间性状由一对隐性基因控制，但其中金黄色单株间颜色深浅有所不同，说明金黄色颖壳和节间性状除受一对隐性主基因控制外，还受其他互作基因影响。在第 3 染色体上定位到的一个金黄色颖壳和节间基因，位于 间，距离 别为 已定位的金黄色颖壳和节间基因比对，其所在的染色体和位置均不一致， 并且 该基因是一个未知的基因， 所以 暂时命名为 为金黄色颖壳和节间基因进一步的精细定位奠定了基础， 为研究 金黄色颖壳和节间基因 的遗传机理提供了条件， 并为杂交水稻机械化制种和功能性稻米选育提供参考。 关键词 ：水稻，恢复基因，金黄色颖壳和节间基因，基因定位 of of in of of of A of 000 F2 of MS 68, A 2 68 F2 to by SR 2 on on 0 to be 2 68 to SR be to a 2 to SR 68 F2 In a 5 as on SR 2 68, SR a 5 SR SR as 68 MS on to f at a .7 f on of 0 at 8.0 4.2 a 68 of to A on on as on at .7 3.3 2.7 cM .7 is it 68 on as of a of it of .), 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 H 增片段长度多态性 极端个体分组和隐性基因组分析法 分离群体分组分析法 酶切扩增序列多态性 衍生扩增片段长度多态性 加倍单倍体 插入缺失标记 分子标记辅助选择 近等基因系 开放阅读框 聚合酶链式反应 数量性状座位 随机扩增多态性 制性片段长度多态性 重组自交系 序列特性扩增区域 单核苷酸多态性 简单序列长度多态性标记 简单重复序列标记 序列标签位点 可变数目串联重复位点 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 水稻年种植面积 约为 公顷，是仅次于小麦的世界第二大粮食作物，产量约占世界粮食总产的三分之一，是世界三分之一以上人口的主要粮食作物。 我国是世界上的稻谷生产大国，稻谷面积居世界第二位、总产居第一位。水稻是我国播种面积最大、总产最多、单产最高的粮食品种，在粮食生产和消费中历来处于主导地位。在过去三十年中，稻谷面积占我国粮食总面积的 30左右，稻谷产量占粮食总产量的 40左右，占谷物总产量的 45左右，占商品粮的50左右。杂交水稻实现三系配套并在生产上大面积应用，给我国水稻生产带来了新的革命；随着 中国 超级杂交稻 研究与推 广规 划的提出和实施，又将给水稻生产带来新的希望。然而中国加入世界贸易组织后稻米市场 的 竞争日益激烈，又由于人们生活水平 的 不断提高 ， 对大米及其相关产品的要求也在不断的变化，因此如何提高水稻及其产品的综合水平已经 成为 摆在研究者和生产者面前的重大课题。 杂种优势利用是水稻育种的一个重要手段。细胞质雄性不育 ( 象在自然界广泛存在，植物细胞质雄性不育是农作物杂种优势利用的基础。水稻是利用杂种优势最为成功的作物之一。恢复基因在杂种优势利用中具有重要作用，长期 以来一直受到研究者的高度重视，已有许多学者从经典遗传学和分子生物学等角度对其进行了研究。目前已成功定位了 野败型、红莲型、包台型等不育胞质的恢复基因，并克隆了包台型的恢复基因。 中国水稻研究所张慧廉研究员以野败不育系作鉴别材料，在栽培稻 (恢复系 )中定向寻找新的不育胞质。通过恢复系与保持系杂交和基因重组，首次发掘出印尼水田谷 6 号等 新不育胞质，并利用印尼水田谷 6 号培育出了 1A 和中 9A 三个杂种产量高、米质评分高、制繁种产量高、种子生产成本低的新质源印尼水田谷型 （简称 印水 型） 不育系 ， 截止 2004 年 ，全国已审定印尼水田谷型杂交水稻组合 146 个 (206 次 )。 1998 年后一直列我国杂交水稻种植面积第二位； 2004 年年种植面积 4700 万亩，占杂交稻总面积 23以上，并呈快速上升趋势。至 2004年，全国已累计推广 亩以上，增产稻谷 64 亿公斤，创造经济效益 95 亿元。印尼水田谷型杂交水稻的育成和推广，在制种产量、米质、杂种产量等方面把我国杂交水稻的生产水平总体提高到一个新台阶，开创了杂交水稻高产制种新时代，对我国粮食安全起到了保障作用。 但目前对印尼水田谷型不育及恢复机理研究的较少，基本停留在经典遗传研究 的层面上。 水稻植株色素的沉积、分布和浓淡，在水稻分类和分子生物学等研究中具有重要价值。但水稻颜色基因的遗传很复杂， 目前国际上多数研究认为色素的遗传受 C（色素原基因）， A（色素转化基因）， P（表现部位基因）三个基因构成的一个互补基因系统所控制，在不同的遗传背景下其显隐性和基因间互作也不同（ 1995）。国内外对金黄色颖壳和节间基因的研究由来已久，已经报道的有 近年来，水稻色素的遗传研究和育种利用取得较大的进展， 克隆了 2006）； 水稻 色素基因在品质育种和机械化制种中中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 也得到一定的应用。 稻胞质不育和恢复基因的研究进展 稻细胞质雄性不育的主要类型 细胞质雄性不育 (指植株的雄性生殖系统不能正常发育产生有功能的花粉，而其雌性生殖系统发育和营养生长完全正常的一种生物学现象。 于 时，它又在研究细胞质遗传、核质互作和花粉发育方面具有重要的意义。因此，这一课题长期以来引起了国内外 科学家们的普遍关注。并对它进行了深入的研究，为揭示 胞学、生理生化等方面的基础。近年来成为植物遗传育种和分子生物学研究的一大热点。 水稻雄性不育早在 20世纪 20年代就已有报道。我国在上世纪 60年代也发现了雄性不育水稻（无粉型和花粉败育型）， 70年代起我国在杂交水稻研究特别是选育和应用推广方面一直处于世界领先地位。对于水稻雄性不育的分类，我国学者做了详尽的研究，目前应用最广的有两种分类方法：按不育胞质来源分类和恢保关系分类。细胞质是引起水稻不育系雄性不育的重要原因，多年来国内外学者通 过各种方法培育了多种不同胞质类型的不育系，迄今已报道了 35种。按其细胞质来源的不同，目前在生产上应用的主要 种类型（ 曾千春 等， 2000）： 野败型不育系：胞质来源于普通野生稻天然败育株，即野败 ( 属孢子体雄性不育，该类型不育系数量最多，配制的杂交稻组合也最多。 冈型不育系：胞质来源于西非籼稻 (G)与矮脚南特杂交后代， 从 分离后代中选不育株再转育而成。转育过程中，有地理远缘的籼籼交，还有籼粳交，由于稳定的途径不同 ， 育成的不育系花粉败育时期 和败育特征也有所差异， 如：朝阳 1号 小早 生产上应用的不育系属孢 子 体不育， 花粉 败育时期及败育特征 与 野败 型 不育系 相似。 质来源于籼稻 52/37， 属孢子体不育类型；花粉败育时期及败育特征与野败型不育系相似。 印尼水田 谷 型不育系：胞质来源于印尼水田 谷 6号 ()。属孢 子 体不育类型 ， 花 粉 败育时期及败育特征与野败型不育系相似。 矮 败 型不育系：胞质来源于江西矮秆野生稻，属孢子体不育类型 (简写 花粉败育时期及败育特征与野败型相似。 红莲型 不育系：胞质来源于红芒野生稻 ， 属配子体不育类型 (简写 不育系雄性败育特征是花药浅黄色、不开裂，花粉多在二核期败育。用 色，花粉以圆败为主，较高温度下能自 交结实。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 质来源于 号等杂交、回交选育而成。其特点是以粳稻作母本并用籼稻作轮回亲本进行连续回交，育成的籼型不育系具有粳质籼核。 包台型不育系：胞质来源于印度籼稻 与台中 65杂交育成，属配子体不育类型 (简写为 滇型不育系：滇型 (交稻研究于 1969年育成我国第一个粳型不育系， 1973年实现三系配套。该类型不育系包括胞质来源于粳稻品种台北 8号半不育及低不育株，与地方品种红帽缨杂交、回交育成的滇一型不育系，胞质来源于粳稻的 9型不育系。生产上有所应用的均属配子体不育类型，花粉败育时期及败育特征与 上述 9 种 质类型中 ， 前 7 种类型用于籼型杂交稻，后 2 种类型用于粳型杂交稻。其特点见表 李广贤， 2005） 。 表 我国生产上应用的按细胞质来源分类的 要类型 MS as on of 型 细胞质来源 败育特点 遗传特点 败育时期 野败（ 海南野生稻 典败 孢子体不育 单核期 K 型（ K） 云南粳稻 败 孢子体不育 单核期 矮败（ 矮杆野生稻 典败 孢子体不育 单核期 D 型（ D） 败 孢子体不育 单核期 冈型（ 冈比亚卡 典败 孢子体不育 单核期 印尼水田谷（ 印尼水田谷 6 号 典败 孢子体不育 单核期 红莲（ 红芒野生稻 圆败 配子体不育 二核期 滇一型（ 粳野生稻 染败 配子体不育 三核期 包台（ 败 配子体不育 三核期 同时根据雄性不育的败育时期、败育特点及恢保关系等方面还可以将水稻雄性不育系类型分为三大类：野败型、红莲型、包台型 (李泽炳等， 1983；朱英国， 2000)。凡使用我国不同地区的普通野生型水稻作母本与栽培稻杂交育成的野栽不育系，都属于野败型，另外， D 型、冈型、印尼水田谷型也属于这一类。该类型不育系 属孢子体不育，花粉在单核期败育，形态为典败，因而不育系的花粉败育彻底，不育性稳定。保持系一般为我国长江流域的早籼品种，恢复系一般为东南亚的籼稻品种（如 我国华南晚籼品种等，不育系和恢复系杂交 花粉可育率可达 90%， 体一般可分离出一定比例的不育株。红莲 型和野败型在雄性不育的败育时期、败育特点及恢保关系等方面都不一样，红莲型不育系属配子体不育，花粉在二核期败育，以圆败为主。野败型的主要恢复系一般不能恢复红莲型的不育系，而恰恰是该类型保持系，其不育系与其相 应的恢复系杂交， 体单株育性 呈 连续性变异，很中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 少出现不育株。包台型不育系一般为配子体不育，花粉败育以染败为主。日本和我国的大部分粳稻品种对该类型的不育系具有保持能力。该类型的恢复基因存在于籼稻品种中，生产上应用的恢复系主要是将籼稻中的恢复基因导入粳稻育成的。 稻胞质不育机理和育性恢复机理 稻细胞质雄性不育的可能形成机理 尽管在一些植物中已经鉴定出与 是对植物细胞质雄性不育的机理仍然知之甚少，一般推测，水稻 1、线粒体 基因组中新的嵌合阅读框与其邻近的保守基因共转录，造成保守基因的单顺反子转录本减少，从而减少了保守基因编码的蛋白量 ， 致使植物的某些功能异常或丧失而不育； 2、新的嵌合阅读框编码一个毒性蛋白，该蛋白干扰保守基因的生物活性或干扰花药发育中的生理生化过程从而中断花粉发育、形成雄性不育。 从恢复基因对 果是第一种原因引起 么相应的恢复基因就应该是通过恢复保守基因的表达量来起作用。对几种植物 恢复基因有与无两种遗传背景下，虽然嵌合基因的转录模式有明显不同，但都可以检测到线粒体保 守基因转录本的存在，且在量上没有明显的区别（ 1991； 1999； 1999； K 994）。这表明第一种解释并不理想。 对第二种解释目前有较多的试验支持（ 1996； 1998； 1999； K ， 1994 ； 1994； 1996）。 1996） 将含特异启动子、线粒体转导序列、菜豆的不育相关基因 得了几株含有 疫细胞学分析表明，在转基因植株中异常发育的小孢子细胞壁表达出不育相关蛋白 0为 荣敏等（ 2000）将 果发现具有 测 稻细胞质雄性不育育性恢复机理 在许多 经鉴定了一些恢复基因。恢复基因通过改变 复基 因还可能影响到其他与雄性不育无关的线粒体基因，存在 “ 一因多效 ” (象。恢复基因在转录后水平 (转录模式的改变 )和翻译后水平 (对不育相关区域发挥作用。基因的作用方式可能至少有两种。一是可能编码一种过在转录后水平影响不育相关区域转录本的加工、编辑，进而导致蛋白谱的差异，引起育性恢复（ 1994）。最近的研究表明，在恢复基因引致育性恢复的过程中 复基因直接促使 加工后的 辑作用。完全编辑过的 未加工过的 第一章 文献综述 5 不编辑，随后容易被降解或翻译出功能异常的蛋白 。 1993）的工作为这一假说提供了较直接的证据。将编辑过和未编辑过的小麦 端并转入烟草细胞核基因组，表达的蛋白被转运到线粒体。在不育和半可育的转基因植株中，都含有未编辑的 含有编辑过 水稻包台型 台型雄性不育是 由于细胞质线粒体 致产生一个新的独特的基因 一基因转录出一条 没有恢复基因的情况下，这一 而导致不育。这一线粒体基因的作用可被细胞核中的恢复基因补偿，当恢复基因存在时， 剪辑为 2个片段，一条长 一条长 个 而使雄性不育得到恢复；相反，如果没有恢复基因，这个 株处于雄性不育状态。 恢复基因的另一种 作用方式可能是编码一种蛋白酶，以翻译后作用机制 ， 通过减少不育基因编码的蛋白质累积量而引致育性恢复。不育相关