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圆二色性光谱及其应用 CircularDichroism CD 1 光学活性分子对左 右圆偏光的吸收率的差值 2 1 自然光 光具有波 粒二象性 是横电磁波 只有横波才有偏振现象 光矢量的振动方向与光的传播方向垂直 在垂直于光传播方向的平面内 有不同的振动方向 电场矢量E和磁场矢量H互相垂直 位相相同 3 由于感光作用都是E引起的 因而 将E作为光矢量 振动面 E与光传播方向组成的平面 4 从统计规律上说 自然光的光振动 在垂直于光速的平面上遍布所有方向 沿各方向振动的光矢量呈对称分布 相应光矢量的振幅 光强度 相等 5 1 高亮度的点光源 2 日光色 色温接近6000K 3 在可见光区连续光谱 4 高显色性 显色指数 95 5 在整个寿命期内维持光色特性 6 高电弧稳定性 7 热重启能力 8 启动后即能达到接近最大光输出 9 电弧光斑小 易聚光 超高压短弧氙灯 在高压纯净氙气中放电发光 6 自然光 平面偏振光 圆偏振光 样品 椭圆偏振光 7 双折射现象 一束光射入各向异性晶体后有两束折射光 尼科耳棱镜 2 光的偏振 在生物样品中 肌肉纤维 骨骼和牙齿等具有各向异性 淀粉粒 染色体和纺锤体等具有双折射性 因此被用于组织细胞的化学研究 8 9 o光和e光 频率相同 振动方向相互垂直 平面偏振光 10 自然光入射到某些晶体 电气石 硫酸金鸡钠碱晶体等 时 晶片吸收振动面与晶轴垂直的光 而只允许振动面平行于晶轴的光通过 11 自然光 平面偏振光 12 也称线 完全 偏振光 简称偏振光 它的振动面称为其偏振面 振动方向保持不变振幅发生周期性变化E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段 3 平面偏振光 Planepolarizedlight 13 4 布儒斯特角 当入射光射到两种介质界面上时 反射光和折射光的偏振情况与入射光不同 14 5 四分之一波片 使o光和e光的光程相差1 4波长的晶片 此时 相位差为 2 透射的合成光是长轴与晶轴重叠的正椭圆偏振光 15 朝光源看 电场矢量方向按顺时针方向旋转的 称为右圆偏振光 电场矢量方向按逆时针方向旋转的 称为左圆偏振光 若入射平面偏振光的电矢量与晶体晶轴的夹角 45 则Eo Ee 合成光是圆偏振光 Circularpolarizedlight 16 6 光的叠加 一束自然光可以看作是两束相互垂直而没有相位关系的平面偏振光的加和 17 18 振幅相等 振动方向相互垂直 相位相差1 4波长的两平面偏振光合成圆偏振光 右旋 19 7 旋光色散 Opticalrotatorydispersion ORD 旋光性 光学活性分子对左 右圆偏光的折射率不同 透射光虽然仍然为平面偏振光 但其偏振面旋转了一定的角度 旋光物质又称为光学活性物质 旋光度 偏振面旋转的角度 旋光色散 不同波长的偏振光的旋转角度不同 旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系 从而得到一个旋光色散谱 20 圆双折射 某个物质对于左 右圆偏光的折射率分别为nL和nR 若nL nR 则为光学各向同性物质 若nL nR 则为光学各向异性物质 左 右圆偏光的相位改变 若nL nR 透射光的偏振面右旋 若nL nR 透射光的偏振面左旋 旋光现象是圆双折射的一种特殊形式 旋光物质使左 右圆偏振光的速度不同 即其色散大小的折射率不同 旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nL nR的结果 21 旋光 双折射 22 化合物在正常情况下 处于低能的基态 电子占据所有的成键轨道 n轨道 如果电子吸收了外界的能量 它就从基态跃迁到激发态能级 如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级和第一激发态之间 吸收光谱将是很狭窄而不连续的谱线 由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转动能级的跃迁 所以 紫外分光光度计测定物质的吸收光谱 虽然有一最大吸收峰值 但都是具有一定波长宽度并相对平滑的曲线 8 光的吸收和圆二色性 circulardichroism CD 23 光的吸收 若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收 则透射光的光强度小于入射光 24 圆二色性的存在将通过该物质传播的左 右圆偏光变成椭圆偏振光 并且只在发生吸收的波长处才能观察到 25 理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系 100 c l 3300 L R 介质对圆偏振光的摩尔消光系数 c 样品摩尔浓度 l 样品厚度 cm 单位 mol cm 或 cm2 dmol 26 圆二色性的表示 吸收 率 差 L R A AL AR椭圆度 摩尔椭圆度 2 303 AL AR 4 3298 L R 3300 L R 在蛋白质研究中 常用平均残基摩尔椭圆度 27 园二色 双折射 28 9 ORD与CD光谱 同时产生 包括同样的分子结构信息 光学活性物质分子中的不对称生色团 CD反映光与分子间能量的交换 旋光性则是与分子中电子的运动有关 可以由Kronig Krammers转换方程相互转换 29 CD谱的极值处与吸收峰一致 科顿效应 cottoneffect 因而分子中不同生色团对于谱的贡献比在ORD中更容易分辨 ORD是渐近线 两端不回归 30 CD比ORD容易辨别重叠峰 CD比ORD弱带易检测 CD比ORD更容易拟合 CD比ORD提供较多意义明确的信息 表明有三个生色团 其中两个有光学活性 31 CD能够提供的信息 primarystructure secondarystructuretertiarystructure Alpha helix beta sheet肽链骨架的构象变化 蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰 190 250nm 肽键280 290nm 酪氨酸tyr 色氨酸trp 32 10 J 810圆二色光谱仪 S1 S2 第一级单色器 S2 S3 第二级单色器 M 球面反光镜 P 晶体石英棱镜 L 透镜 F 滤光器 33 由CDM交互形成的左 右旋圆偏光通过光学活性物质 透射光强度随时间的变化 当调制电压过其峰值 正和负 时 R L时 透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值 而左旋最小 实线 R L时 透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值 而右旋最小 虚线 PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所组成 34 圆二色光谱仪工作原理 用相同强度 相同频率的左 右旋圆偏光交替照射样品测得透过样品后的强度IR和IL 由于IR和IL十分接近 令IA IL IR 2 S IR IL 只放大相应于S的PMT输出电压Es 交流信号 而不放大相应IA的输出电压EA 适当选取放大倍数G值 使ESG与EA可比 35 PeltierCellHolder CD TotalFluorescence FMO StoppedFlow 20 200 36 Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive 蛋白质的光学活性 37 1 氨基酸的圆二色性 可见光区 各种氨基酸都没有光吸收 紫外光区 只有芳香族色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸有吸收 氨基酸分子内的紫外生色基团 吲哚基 酚羟基 苯基 二硫键 咪唑基和羧基等 38 2 肽的圆二色谱 活性肽构象与其生理功能的关系肽的构象也是蛋白质构象的一种模型 肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息 39 Far UV 250 170nm SecondaryStructure helix sheet turn randomTertiaryStructureClass all all I all IINear UV 320 250nm aromaticsidechainNear UV Near infrared 300 1000nm coloredproteins 40 苯丙氨酸 phenylalanine Phe 255 261和268nm附近 酪氨酸 tyrosine Tyr 277nm左右 色氨酸 tryptophan Trp 279 284和291nm附近 二硫键的变化反映在整个近紫外区 芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时 在近紫外区表现出CD信号 41 FarUVCDspectraofpoly L Lys 1 100 螺旋2 100 折叠3 100 无规卷曲 42 MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures 43 3 估算蛋白质二级结构含量 仅适合 含量较高的蛋白质 将测得的CD曲线与标准曲线拟合 xa xb xc 1 0qt xaqa xbqb xcqc改变xa xb和xc 使qt与样本曲线最佳拟合 最小二乘法 leastsquaresminimization 未知结构的蛋白的CD信号 44 myoglobin qt xaqa xbqb xcqcfitsbestwithxa 80 xb 0 xc 20 agreeswellwithstructure78 helix 22 coilForfurtherdetails www structure llnl gov cd cdtutorial htm 45 GCN4 p1 0oC 100 helix75oC 0 helixwhatabout50oC qt xoqo x75q75fitsbestwithxo 50 x75 50 Showsthatat50oC1 2ofpeptidea helixdimer1 2ofpeptiderandomcoilmonomer 46 Lau TanejaandHodges 1984 J Biol Chem 259 13253 13261 螺旋二聚体分解为单螺旋 三氟乙醇 trifluoroethanol TFE 诱导肽链形成螺旋 TFE对卷曲螺旋 coiled coil 的影响 47 chymotrypsin allb lysozyme a b triosephosphateisomerase a b myoglobin alla CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructure 48 49 pH变化引起的肌球素变性前后CD谱的动力学变化 50 稀释前后的荧光和CD谱从伸展到折叠 螺旋含量的变化的动力学检测 KineticTraceat222nm secondarystructureregion 51 Kinetictracesat289nm Aromaticsidechainregion 细胞色素c伸展和折叠状态的CD和荧光光谱反映了芳环侧链 色氨酸残基 的变化 盐酸胍中的细胞色素c 伸展状态 与PBS混合后的CD和荧光光谱 52 6 磁圆二色谱 MagneticCircularDichroism MCD 磁性材料对左 右圆偏光的吸收不同而产生的二色性现象 利用法拉第效应 在外加磁场的作用下 许多原来没有光学活性的物质也具有了光学活性 原来可测得CD谱的 在磁场中CD信号可增大几个数量级 7000Gauss 53 实验要点 54 Sampleconcentration AgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV VISspectra CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV VIS bestS Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0 6to1 2 It susuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance ofsample solvent isover2O D 55 样品杯 高度均匀的熔融石英 不会带来附加的圆二色性 光程 0 01cm 1cm 为了降低溶剂影响 一般提高样品浓度 用短光程 cellpathlength 56 Nitrogenflushing Flushingtheopticswithdrynitrogenisamust Xelamphasaquartzenvelope soifoperatedinairit lldevelopalotofozone harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation 57 HTplot TheHTplotisveryimportant sincereadingsabove600 650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel 58 59 Bandwidth SBW selection Settingofslitsshouldbeaslargeaspossible todecreasenoiselevel butcompatibletothenaturalbandwidth NBW ofthebandstobescanned AsaruleSBWshouldbekeptatleast1 10oftheNBW otherwisethebandwillbedistorted IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection Tradeinofaccuracyversussensitivity i e theuseoflargerthantheoreticalSBW isoccasionallyrequired 2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion wherefinestructuresmaybepresent optimalband pass aslargeaspossible butnotloosinginformation canbedeterminedafteratrial 60 标准操作时谱带宽度选为1nm 高分辨率测量用较窄的狭缝宽度 此时PMT电压较高 信噪比差 当样品的光密度很高 CD很小时 就要保持测试CD峰多需要的足够浓度 并用较宽的狭缝宽度 此时 由于样品OD值过高 可能存在有荧光或杂散光引起的某些假象 61 Numberofdatapoint datapitch i e numberofdatapointspernm willnotdirectlyinfluencethenoiselevel Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise it sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithm 62 Accumulation anotherwaytoimproveS Nistoaveragemorespectra HeretootheS Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations Averagingisveryeffectivesinceitcompensatesshorttermrandomnoise butit llnotcompensatelongtermdrifts mainlyofthermalorigin Soiflongaccumulationsareu