【毕业学位论文】拟南芥Rad23 家族基因在胁迫应答中的功能分析-生化分析与分子生物学博士论文

学校代号 10532 学 号 分 类 号 密 级 博士学位论文 拟南芥 族基因在 胁迫应答中的功能分析 学位申请人姓名 李秀山 培 养 单 位 化学化工学院 导师姓名及职称 刘选明 教授 学 科 专 业 化 学 研 究 方 向 生化分析与分子生物学 论文提交日期 2013 年 7 月 学校代号 ： 10532 学 号： 级： 湖南大学博士学位论文 拟南芥 族基因在 胁迫应答中的功能分析 学位申请人姓名： 李秀山 导师姓名及职称 ： 刘选明 教授 培 养 单 位： 化学化工学院 专 业 名 称： 化 学 论文提交日期： 2013 年 7月 论文答辩日期： 2013 年 11 月 答辩委员会主席： 陈良碧 教授 I (2005 A in of in 2013 博士学位论文 要 紫外辐射敏感蛋白 一种核苷酸切除修复因子，参与了 胞应激反应和生长发育 等。真核生物体内的 此，本文通过对 到了如下研究结果： (1) 分析了 系统研究了 结果显示：紫外胁迫处理后， 子败育率增加以及体内花青素含量明显降低。对一系列与 突变体 变体内 体内 明 (2)实验成功构建了 用纯化后的重组 蛋白制备了多克隆抗体。通过 时， 疫组化实验发现 进一步研究 测了重组蛋白处理后细胞的表型， 实验发现构建的重组蛋白 (3) 通过在 糖和甘露醇等胁迫条件处理下，分析了拟南芥 4种验发现 糖和甘露醇都不敏感，而 对蔗糖和甘露醇不敏感。用 野生型相比，伸长也受到抑制。同时，实验分析了 果表明：与野生型相比， ， 35S:35S:型均得到回复，证明 (4)运用 果发现 花瓣、萼片和雌蕊等组织中的拟南芥 族基因作用于胁迫应答中的生化分析 发率下降，种子败育率增加，将 35S:型得到回复。对一系列与花粉和绒毡层发育相关的基因检测分析发现， 将 35S:回复 明 关键词：拟南芥； 外； 迫应答基因；蛋白 博士学位论文 is a in NA as NA V NA it is in as (1)in of of ER of (2)of as an to in B to be in To V V of V (3) to 南芥 族基因作用于胁迫应答中的生化分析 BA A 5S:5S:to A. of (4) US in US to be in in In of 35S:of of be 5S:a of MS in in 5S:to UV 士学位论文 录 湖南大学学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书 . I 摘 要 . 文所用缩写词 . 1 章 绪 论 .迫对植物生长发育的影响 . 主要特性 . 射对植物的诱导作用 . 紫外胁迫对植物的次生代谢产物的影响 . 植物体内化合物对紫外 迫的保护作用 . 射导致的 胞损伤研究 . 损伤 复的原理和机制 . 紫外线诱导的 胞损伤修复的主要机制和途径 . 复与 26. 核酸剪切修复机制 .0 植物中 关蛋白以及调控途径的研究 .1 因在 径的作用 .物应对环境胁迫的响应 .课题研究的目的意义与设想 . 2 章 拟南芥 因的克隆及功能分析 .料和方法 . 实验主要材料 . 实验方法 .果与讨论 . 因的转录调控区域元件分析 . 拟南芥 基酸序列的同源性分析 . 拟南芥体内 白序列结构预测 . 体的构建和转基因株系的获得 . 拟南芥 因的表达特异性分析 . 拟南芥 入突变体的分子鉴定及纯合子的获得 . 拟南芥 变体在紫外胁迫下的表型分析 .南芥 族基因作用于胁迫应答中的生化分析 章小结 . 3 章 拟南芥 因介导胁迫应答的功能分析 .料与方法 . 实验材料 . 实验方法 .果与讨论 . 合表达载体的构建 . 35S:组表达载体的转化 . 基于洋葱表皮细胞的蛋白亚细胞定位检测 . 拟南芥 35: 达载体转基因株系的获得 . 胁迫条件下 变体植株的表型分析 .章小结 . 4 章 核表达载体构建及其及其活性分析 .料与方法 . 实验材料 . 实验方法 .果与讨论 . 因的克隆与原核蛋白表达载体的构建 . 白原核诱导表达产物的 测 . 组蛋白在不同条件下的优化表达 . 组蛋白表达产物的纯化 . 定 组蛋白活性 . 昆明鼠免疫 . 抗血清校价和特异性鉴定 . 重组蛋白在体外对 胞紫外的损伤保护作用 . 白对 胞的增殖活性分析 .0 染分析 白对 胞的凋亡 .章小结 . 5 章 族基因克隆和功能分析 .料与方法 . 实验主要材料 . 实验方法 .果与讨论 . 族基因融合表达载体的构建 . 因在其组织表达的特异性鉴定 .士学位论文 变体植株的分离鉴定和纯合子的筛选 . 入突变体在各种胁迫下的表型分析 . 入突变体种子萌发在 迫下表型分析 . 在 迫条件下 因突变体对脯氨酸代谢的调控 . 变体内胁迫调控基因 达水平的分析检测 . 拟南芥 因的组织表达 . 白在花器官中表达检测 . 因突变对花粉颗粒的活性影响 .1 变对种子发育的影响 .2 节花粉和绒毡层发育相关基因的表达 .章小结 . 论 .考文献 .录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 . 111 致 谢 .南芥 族基因作用于胁迫应答中的生化分析 生型 波紫外线 波紫外线 波紫外 氟烃 碳类 机溴类 02二氧化碳 答因子 性氧自由基 4H 桂酸 4- 尔酮合成酶 基丙氨酸解氨酶 苷酸切除修复 丁烷二聚体 6啶光产物 伤结合复合体 色性干皮病 C 蛋白 氢黄素腺嘌呤二核苷酸 素蛋白酶系统 b 泛素 落酸 A 赤霉素 合复合物 基因组修复 录偶联修复 E 偶联元件 ， 4， 42， 4 脱氧核糖核酸酶 I 核糖核酸酶 洛尼鼠白血病病毒 使 转录 士学位论文 重蒸馏水 5S 花椰菜花叶病毒 35S 启动子 5S 色荧光蛋白 43 丙基 分子干扰 扰 尔 M 微摩尔 摩尔 秒 小时 r 小时钟 l 毫升 l 微升 道尔顿 色荧光蛋 萄糖醛酸酶 六烷基三甲基溴化 量实时 S 养 扰 嘌呤核苷三磷酸 士学位论文 1第 1 章 绪 论 迫对植物生长发育的影响 主要特性 自南极上空的臭氧层空洞以来，由于臭氧衰减而导致的到达地面的 射增强及其生物学效应受到国内外的普遍关注1,2紫外线是指波长范围在 200球上的紫外线大部分来自太阳的辐射，而紫外线在穿过地球大气层时，绝大部分被吸收或散 射。紫外线分类主要依据其 波长，主要分为三类：200短波紫外线 (、 280中波紫外线 (和 320紫外线虽然大部分被吸收或散射，但绝大部分紫外线 此，紫外线 地球上的植物生长具有一定的调控作用，并对地球其它生命物质产 生影响；同时，研究人员还发现， 大部分被臭氧层吸收，因此， 植物的生长发育调控没有显1,2。 图 1. 紫外线分类1 he 拟南芥 族基因作用于胁迫应答中的生化分析 射对植物的诱导作用 随着人类工业生产的迅速发展，向大气中排放 的污染物也越来越多。其中氯氟烃类 ( 氯碳类 (有机溴类 (合物的增多，导致大气平流层中臭氧逐渐耗损3。此外， 于大气臭氧层变薄，导致到达地球表面的 ,4 。增强的 物、微生物以及人类的生长发育将 产生重要的影响，可以引起 细胞内的生物大分子如响各种细胞发育和生长。对于植物而言，由于 且不能完全穿透植物叶片。因此，增强的 遍认为， 时也能影响植物的生理和形态结构的变化5,6，如增加植物 响植物蛋白质合成、抑制 光合作用、损伤叶绿体功能等，其后果是影响植物的生产力7。增强的 导致植物的氧化胁迫， 由于芳香族氨基酸对紫外部分的吸收作用， 2,13，对蛋白质造成直接的伤害14，影响植物体内酶的活性15,16，以及通过脂质过氧化破坏膜系统等等13,17。 图 2. 南极大气臭氧层空洞2he 博士学位论文 外胁迫对植物的次生代谢产物的影响 对大多数植物而言，环境因子的变化能影响次 生代谢产物的积累与合成。其合成的数量和种类也随环境因子的变化而影响较大，在特定的环境因子条件下，植物体内能合成一些特殊的次生代谢产物，并且在特定时候能显著地增加次生代谢产物的产量。许多环境因子能诱导部分次生代谢产物的积累与合成，如一些生物因子和部分非生物因子。生物因子主要有病虫害的干扰、病虫害数量等；部分非生物因子主要有紫外线、 环境温度、 培养水分、 培养的土壤、 空气的污染等18,19。植物体内次生代谢产物受环境因子的调控作用十分复杂，其合成与积累可受多种环境因子诱导的影响，并随环境因子变化而引起次生代谢在植物体内的连锁反应，只是各物种之间存在一定的差异，其对环境因子敏感度不同而已。 有学者研究发现，许多转录因子参与了 代谢途径基因表达的调控，如 的生物合成的调节20。 人利用转录因子 在部分未分化的玉米细胞过表达培养发现， 该转录因子调控了黄酮类物质的生物合成途径21。同时，在水稻中也发现，过表达转录因子 增强植物对部分真菌的抗性22。如拟南芥关键酶的合成。将拟南芥 因突变，能增加植物体内中芥子酸酯和 而提高了植物对紫外辐射的抵抗能力22。 图 he V on 物体内化合物对紫外 迫的保护作用 植物体在长期的进化过程中形成了各种保护机制，保护植物免受 3。其中高等植物中最重要的一种保护机制是在叶肉组织中积累紫外吸收化合物，这些化合物能够像防晒剂一样，减少 5,23，这些物质能强烈的吸收 可见光却能自由通过叶表，并在到达叶肉细胞后拟南芥 族基因作用于胁迫应答中的生化分析 4启动体内的光合作用24,25。不同物种之间或相同物种在不同 生长阶段，其生长的环境都会影响植物体内这些物质的含量。同时， 苯基丙氨酸解氨酶 (查尔酮合成酶 (因26，这两种基因的大量表达能促进植物体内黄酮类物质的快速积累。而这些黄酮类物质主要在植物叶表皮细胞中大量表达，能有效的促进叶片对 而减少细胞内部紫外的辐射量，极大的降低紫外辐射对植物细胞组织的伤害和其它生理的影响。大量实验表明，紫外吸收物质能降低 提高植物对紫外辐射的抵抗力27。 射导致的 胞损伤研究 紫外线 特点就是参与了生物效应调控。紫外线外光子能量能被细胞体内分子或原子吸收，从而改变原子或分子内电子能级的状态，引发细胞内连锁反应。据文献报道，短波长的 长波长的 细胞内的部分氨基酸和 究发现， 以细胞中的染色体 这种紫外损伤很容易诱导细胞内部分基因的突变。紫外线 胞单链断裂、 基烷基化等28,29。 列修复反应，如当 胞内立即激活相关修复系统，参与受损伤 胞在停滞阶段，为防止细胞发生突变或癌变，细胞利用各种方法去修复损伤的 0。在细胞内 以修复时，细胞将启动程序性死亡，受损严重的细胞将被自动清除，从而避免细胞将错误的信息遗传给子细胞。因此，紫外线对细胞 胞增殖、细胞