基础肿瘤理论与实践肿瘤凋亡

Apoptosisandcancer Todieornottodie thisisaquestion 蝼蚁尚且贪生 舍生取义 Destiny fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath 1090 131 959 cells RobertHorvitz JohnSulston SydneyBrenner PhysiologyorMedicineNobelPrize2002 SydneyBrenner 20世纪60年代末 英国科学家悉尼 布雷内希望能找到一种适于基因水平研究 并能确定完整的神经系统的实验生物模型 最终布雷内选择了一种较为简单的生物 秀丽隐杆线虫 Hechosethenematodebecauseofitsshortlifecycle geneticsimplicityandtinysize lessthan1mmlong 布雷内慧眼识线虫 JohnSulston 苏尔斯顿提出 细胞程序性死亡 利用布雷内建立的突变的线虫株 发现并分离了一系列影响细胞凋亡的基因 包括ced 1 ced 2和nuc 1 提出生物发育过程中细胞的凋亡是由一系列基因控制的 确定了线虫发育过程中每一个细胞的分裂和分化及其最终的命运 Caenorhabditiselegans 1090 959 131 RobertHorvitz 1986年 罗伯特 霍维茨及其学生发现了线虫中在细胞凋亡过程中起关键作用的两种基因 ced 3和ced 4 这两种基因的缺失将改变细胞的命运 使线虫中原本正常情况下会死亡的细胞存活并继续分化下去 霍维茨等人确认 死亡基因 细胞凋亡的发现以及对细胞凋亡发生机制的研究 为科学开拓出一个神奇的新领域 意义非常深远 它加深了人类对于生命的认识 对细胞凋亡及其机制的研究将为癌症 糖尿病等许多疾病的治疗提供新的可能的方法 对人类健康事业产生重大影响 蝌蚪尾的消失 脊椎动物的神经系统的发育 发育过程中手和足的成形过程 细胞凋亡 Apoptosis 细胞凋亡由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程 是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程 早在1972年Kerr等已发现从细胞形态 超微结构和生化变化等方面来分析 细胞有二种死亡形式 一种是早被熟知的细胞坏死 Necrosis 另一种是新提出的程序性细胞死亡 Programmedcelldeath PCD 学说 但该学说到九十年代初才进入研究高潮 现在普遍称之为细胞凋亡 Apoptosis Apoptosis 细胞凋亡 Necrosis 细胞坏死 细胞凋亡与细胞坏死的区别 坏死凋亡 1 性质 2 诱导因素 强烈刺激 随机发生 较弱刺激 非随机发生 3 生化特点 4 形态变化 6 DNA电泳 5 炎症反应 7 凋亡小体 8 基因调控 被动过程 无新蛋白合成 不耗能 主动过程 有新蛋白合成 耗能 细胞结构全面溶解 破坏 细胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩 核固缩 弥散性降解 电泳呈均一DNA片状 DNA片段化 180 200bp 电泳呈 梯 状条带 溶酶体破裂 局部炎症反应 溶酶体相对完整 局部无炎症反应 有 病理性 非特异性 生理性或病理性 特异性 无 有 无 BasicFeaturesofApoptosis 形态学特征 凋亡的起始 细胞器 染色质等开始变化凋亡小体的形成 质膜包裹染色质和细胞器凋亡小体的消化 被吞噬细胞消化 NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess 488nm 400 凋亡的生物化学特征 非随机性DNA降解细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 DNA断裂与 梯状条带 1 DNA断裂与 梯状条带 2 典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳 呈现梯状条带 Sub G1 DNA断裂的原位末端标记法 TUNEL测定法 凋亡细胞DNA降解产生缺口和末端 故可用原位缺口翻译或末端标记法显示凋亡细胞 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 AnnexinV FITCFluorescence PIFluorescence TimecourseofapoptosisinTF 1cellsculturedinGM CSF freemedium Camptothecin 喜树硷 analkaloidisolatedfromtheChinesetreeCamptothecaacuminata representsapromisingnewclassofanticancerdrugsthattargettheintranuclearenzymetopoisomeraseI topo I Initialclinicalstudiesofcamptothecinwerehaltedbecauseofsevereandunpredictableadverseeffects Supportedbydetailedunderstandingoftheirmechanismofactionandfacilitatedbychemicalmanipulationsthathaveamplifiedtheirsolubility camptothecinshaveadvancedtotheforefrontofseveralareasoftherapeuticanddevelopmentalchemotherapy Inthepresentstudy westudythepotentialinvitroeffectofNSC606985 ararelystudiedwater solublecamptothecinesterderivative onacancercelllinecalledNB4 Forthispurpose theexperimentsinFigure2weredone 根据以上结果 作者认为NSC606985能够诱导NB4细胞发生凋亡 请回答 作者得出该结论的依据是什么 10分 在得出如上结论后 作者应该如何开展更深入的研究 10分 HowdoesApoptosisoccur 细胞的凋亡至少受14个基因的控制 CED 9 CED 4 CED 3 APOPTOSIS 具严格底物特异性的半胱氨酸蛋白酶通常以酶原 前体 的形式存在于细胞内活化的Ced 3特异地降解蛋白底物 CED 9 CED 4 CED 3 EGL 1 EGL 1 1993年 袁钧英等发现Ced 3基因与哺乳细胞白细胞介素 1 转化酶 interleukin 1b convertingenzyme ICE 存在功能和序列相似性 和Ced 3一样 ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡 Caspases cysteine containingaspartate specificprotease 含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶 是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用 其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶 Caspase家族的结构与分类ICE亚类Caspase蛋白酶 ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶 参与凋亡但不起主要作用 Caspase1 Caspase4 Caspase5 Caspase11Caspase12 Caspase13 Caspase14 凋亡启动亚类Caspase蛋白酶 Caspase8 Caspase2 Caspase9 Caspase10 凋亡效应亚类Caspase蛋白酶 Caspase3 Caspase6 Caspase7 prodomain 大亚基 20KD 小亚基 10KD Caspase前体 大亚基 20KD 小亚基 10KD p20 p10 2 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶 具有严格的底物特异性 即特异地剪切天冬氨酸残基后的肽键 但是 邻近剪切位点N端的四肽序列及其结构对于caspases的有效酶解也是非常重要的 不同caspases识别的四肽序列明显不同 这可能是造成它们的功能差异的重要基础 使抑制凋亡因子失活 如ICAD破坏细胞结构 如LaminA将调节区与催化区分离 使蛋白失活 如PARP CAD激活方式 Molecularpathwaysofapoptosis Twoprinciplepathways Extrinsic Intrinsicpathway 参与死亡受体信号转导的接头蛋白 死亡结构域蛋白deathdomainprotein TRADD TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF TNFRI 死亡结构域 TRADD 细胞凋亡FADD Fas相关死亡结构域蛋白FasL Fas 死亡结构域 FADD 细胞凋亡RIP 受体相互作用蛋白CRADD 含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白MADD 活化MAP激酶的死亡结构域蛋白 Receptor mediatedpathwayofapoptosis FASL FAS FADD死亡诱导信号复合物 DISC 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够caspase8细胞caspase8浓度不够死亡受体活化 切割BidtBid从胞质到线粒体细胞凋亡CtyC释放 Themitochondria mediatedpathwayofapoptosis 线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径释放caspase活化因子细胞色素C 细胞色素C Apaf 1 caspase9 凋亡体AIF 凋亡诱导因子 Caspase3Apaf 1 凋亡蛋白酶活化因子 凋亡诱导因子 apoptosis inducingfactor AIF Smac DIABLO secondmitochondria derivedactivatorsofcaspase directIAP bindingproteinwithalowisoelectricpoints 核酸内切酶G endonucleaseG EndoG 57KD黄素蛋白AIF Mit Nucleus Chr浓缩DNA降解 IndependentofcaspaseactivationandoxidoreductasesactivityofAIF GuidoKroemer Earlyworkontheroleofmitochondriainapoptosis WorkonperipheralT celltoleranceinMadridin1989 WetreatedmicewithSEB asurperantigenwhoseinjectioncaninduceT celltolerancethroughactivation inducedcelldeath DNAladder ApoptosisofperipheralTcellswasaninvitroartefact JExpMed 1993 IdecidedtolookforbiochemicalalterationsthatwoulddistinguishnormalTcellsandpreapoptoticTlymphocytes pH cationconcentrations membranepermeability lysosomechangeandsoon DiOC6 adyethatindirectlymeasuresthemitochondrialtransmembranepotential JEM 1995 LossofMTPmarkedairreversibleearlystepoftheapoptoticprocess JEM 1995 Acellfreesystem inwhichweconfrontedpurifiedmitochondrialwithpurifednuclei Uponinductionofpermeabilitytransbilitytransition wefoundthatmitochondriareleasedanapoptosisinducingfactorthatcausechromatincondensationandfragmentationwhenaddedtopurifiednulclei JEM 1996 ThemitochondrialreleaseoftheseapoptogenicfactorsbutnottheiractiononthenucleuswasfoundtobecontrolledbyBcl 2 JEM 1996 Mitochondrialwoulddecidethefateofcellsandservesasacentralintegratorandcoordinatoroftheapoptoticprocess FASEBJ 1995 Mitochondrialarebullshit Withoutthishelp wewouldhavebeenforcedtoabandonourwork XiaodongWang DouglasGreen Cellfreesystemofxiaodongwang Cellfreesystemofkroemer Todetectcaspaseactivationasthefinalreadout Tolookforaproteinthatwouldcausechromatincondensation intheabsenceofcytosol inacaspase independentmanner AIF Nature 1999 Artefact inducingfactor Itisprobablywrongtoconcentrateonjustoneorfewproteins ANT VDAC p53 asbeingcrucialregulators weshould atleastsometimes concentratedonprocesses ratherthanonindividualmolecules CytoC Howapoptosisisregulated Tsujimoto和Crose发现极大多数非何杰金氏滤泡状B细胞淋巴瘤 B celllymphomas 存在染色体易位t 14 18 caspases Apaf 1 14号染色体的IgH基因 Bcl Bcelllymphoma 2基因 基因转染实验显示Bcl 2高表达广泛抑制大多数刺激剂诱导的细胞凋亡 Bcl2 含有1 4个Bcl 2同源结构域 BH1 4 分两类 抗凋亡基因 如 Bcl 2 促凋亡基因 如 Bax 促凋亡蛋白能引起线粒体外膜通透性改变 导致cytc释放 引起凋亡 bcl 2相当于线虫的ced9 主要定位于线粒体膜 也存在于ER和外核膜 拮抗促凋亡蛋白的功能 bcl 2基因家族 Bcl 2genefamily Zimmermann2001 EarlyworkonthefunctionofBcl 2 DavidVaux Fulllengthofbcl 2cDNAwasclonedin1986bybothTsujimotoinPhilidelphiaandMikeClearyatStanford 1987 receivedthebcl 2cDNAfromMikebutwasaskednottomaketransgenicmice Tofigureoutwhetherbcl 2wasanoncogenewhoseoverexpressionwasresponsibleforcausingfollicularlymphoma Toseeifitcouldactlikeotheroncogenetotransformfibroblasts ashadbeenshownforras v raf ormakegrowthfactordependentcellsfactorindependent ashadbeenshownforv abl v fms NIH 3T3 FDC P1 IL 3dependent Infectedwithbcl 2 Infectedwithvector Injectedintosyngeneicmice Growthfactorwithdraw Growthfactorwithdraw Nocolonies Nocolonies Notumorsgrow Immunologytoday 1989 DeathDNAladder NodeathNoDNAladder Whetherbcl 2andc myccouldsynergizeinthetransformationofcellsinvitro Normalbonemarrowcells E mycbonemarrowcells Bcl 2 Softagar Softagar lymphoma Nature 1988 F1cross 1989 5 Transgenicbcl 2mice 1988 9 TransgenicE mycmice Pre orpro Bcellleukemias Nature 1990 Thinkingthatevolut