人教版选修1 5.3 血红蛋白的提取和分离 课件（31张）.pptxVIP

课题三血红蛋白的提取和分离 专题五dna和蛋白质技术 课题背景 蛋白质是生命活动不可缺少的物质 随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成 人类跨入了后基因组和蛋白质组时代 对蛋白质的研究与应用 首先需要获得纯度较高的蛋白质 因此 从复杂的细胞混合物中提取 分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作 课题目标 1 说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法 2 说明凝胶色谱法的原理和方法 3 说出电泳的基本原理和方法 4 运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化 基础知识 一 蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异 1 分子的形状 大小2 电荷性质和多少3 溶解度4 吸附性质5 对其他分子亲和力 基础知识 根据相对分子质量的大小分离蛋白质 根据分子带电性质的差异以及分子本身大小 形状的不同分离蛋白质 1 凝胶色谱法 1 材料 凝胶 微小的多孔性球体 如葡聚糖或琼脂糖 内部有许多贯穿的通道 2 原理 小蛋白质 大蛋白质 混合物上柱 洗脱 大分子流动快小分子流动慢 收集大分子 收集小分子 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小 相对分子质量较大 凝胶内部的通道 容易进入 无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较长移动速度较慢 路程较短移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 2 缓冲溶液 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的溶液 2 作用 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的ph的影响 维持ph基本不变 3 配制 通常由1 2种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同ph范围内使用的缓冲液 4 本实验使用的是磷酸缓冲液 nah2po4 na2hpo4 目的是利用缓冲液模拟细胞内的ph环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色 和科学研究 活性 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中 如h2co3 nahco3 nah2po4 na2hpo4等 3 电泳法 1 概念 指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2 原理 分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小 形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度 从而实现样品中各种分子的分离 3 类型 由于琼脂糖本身不带电荷 各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小 形状的不同 在凝胶中加入sds 使蛋白质解聚成单链 与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 使其迁移速度完全取决于分子的大小 实验操作 1 洗涤红细胞 血液100ml 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 一 样品处理 2 释放血红蛋白 洗涤好的红细胞导入烧杯 加蒸馏水到原血样体积 加40 体积苯 充分搅拌10分钟 3 分离血红蛋白 红细胞混合液 滤纸 过滤 脂类物质 有机溶剂 血红蛋白 烧杯 4 透析 过程 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液中 ph为7 0 透析12小时 目的 除去样品中分子量较小的杂质 二 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 3 样品的加入和洗脱 1 凝胶色谱柱的制作 打孔 挖穴 安管 覆网 纱包 插管 2 凝胶色谱柱的装填 50cm高 固定色谱柱 配凝胶悬液 装填色谱柱 洗涤平衡 沸水浴加热 紧密不得有气泡 磷酸缓冲液 ph为7 0 3 样品的加入和洗脱 1 调液面 2 加样3 再调液面 4 洗脱 5 收集 红色区带均匀一致地移动 操作提示 1 红细胞的洗涤 洗涤次数不能过少 低速 短时离心 2 色谱柱的装填 装填尽量紧密 降低颗粒间隙 无气泡 洗脱液不能断流 3 凝胶的预处理 沸水浴法时间短 还能除去微生物和气泡 4 色谱柱成功标志 结果分析与评价 1 血液样品的处理 分层明显 样品处理完成 2 凝胶色谱柱的装填 放一支与凝胶柱垂直的日光灯 直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 若色带均匀 狭窄 平整 装填成功 3 血红蛋白的分离 血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随洗脱液缓慢流出 分离成功 血红蛋白的提取和分离 课堂小结 1 以下关于猪血红蛋白提纯的描述 不正确的是 a 洗涤红细胞时 使用生理盐水可防止红细胞破裂b 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核 提纯时杂蛋白较少c 血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测d 在凝胶色谱法分离过程中 血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢 d 课堂练习 方法点拨 1 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 2 血红蛋白的分子量比杂蛋白大 质量越大的 通过凝胶色谱柱的速度越快 a 2 蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术 下列有关叙述不正确的 a 根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性 可将样品中各种不同蛋白质分离b 根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小 可通过电泳分离蛋白质c 根据蛋白质相对分子质量的大小 可通过凝胶色谱法分离蛋白质d 根据蛋白质的分子大小 密度不同 可通过离心沉降法分离蛋白质 方法点拨 蛋白质分子不能通过半透膜 但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜 因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离 3 下列关于dna粗提取实验和血红蛋白的提取实验 叙述正确的是 a 前者选择鸡血细胞作为实验材料较好 后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好b 样品预处理时 前者静置1天处理除去上清液 后者需要加入清水 反复低速短时间离心洗涤 至上清液无黄色c 在dna粗提取实验中 往2mol l氯化钠溶液中加入蒸馏水析出dna时 应该缓慢加入 直到出现黏稠物即止d 洗