复方黑面神软膏制备工艺研究

复方黑面神软膏制备工艺研究摘要：目的建立复方黑面神软膏处方黑面神中表儿茶素和苦参中苦参碱含量的测定方法，优化提取工艺条件，并优选以聚乙二醇4000、聚乙二醇400、聚山梨酯80、丙三醇和羟苯乙酯制备复方黑面神软膏的最佳基质配比。方法采用HPLC法测定表儿茶素和苦参碱的含量，分别运用正交试验考察浸泡时间、加水量、提取时间和提取次数对表儿茶素和苦参碱含量的影响。采用L9（34）正交试验法，以软膏的外观性状、延展性、稳定性、稠度和PH等为评价指标，优选基质比例。结果表儿茶素在0.00840.0336gL-1内线性关系良好，回归方程y=13346x+11.632，r=1.0000，最佳水提工艺：药材加20倍量水浸泡45min，80温浸提取2次，每次1h。苦参碱在0.02940.588gL-1内线性关系良好，回归方程y=1714.9x-3.8355，r=0.9999。最佳提取工艺：药材加20倍水浸泡45min，提取两次，每次1h。筛选出来的复方黑面神软膏基质的最佳配比为聚乙二醇4000:聚乙二醇400:聚山梨酯80:丙三醇=（6:1:0.1:0.5）。结论HPLC法测定复方黑面神软膏处方的含量操作简便，专属性强，准确可靠，可用于复方黑面神软膏的质量控制。优选工艺制备的复方黑面神软膏外观细腻均匀，性状稳定,此最佳基质配比可制备质量较佳的复方黑面神软膏。关键词：复方黑面神软膏；高效液相色谱法；基质；正交试验IThePreparationProcessResearchOfCompoundBreyniaFruticosaOintmentAbstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminingepicatechinandmatrineinCompoundBreyniafruticosaointmentandoptimizetheextractioncondirionsAndoptimizetheoptimumproportionofmatrixforthepreparationprocessofCompoundBreyniafruticosaOintnentbyPEG4000，PEG400，Tween-80，glycerinandethylparaben.MethodsThecontentofepicatechininleavesofBreyniafruticosaandmatrineofSeparationFlavescenswasdeteminedbyusingHPLC.Pereatingtime,ratioofsolidtoliquid，extractiontimeandextractiontimesfortheaffectionofwaterextractionrateofepicatechinandmatrineweredetectedbytheorthogonaltest.Character，stabilityconstant，ductilityandpHvalueoftheointmentwereselectedasindex，L9(34)orthogonaltestwasemployedtodeterminetheeffectsofthefourfactorsResultsThelinearrangeofEpicatechinwas0.00840.0336g/l，thestandardcurveofEpicatechinwasasfbllowsy=13346x+11.632，r=1.0000Theoptimalwaterextractiontechnicswereasf01lows：ratioofsolidtoliquidat1:20(wv)andpemeatingfor45minutes，80extraction2timesand1hourforeachtimeThelinearrangeofatrinewas0.02940.588gL-1，thestandardcurveofmatrinewasasfollowsy=1714.9x-3.8355，r=0.9999Theoptimaldecoctionextractiontechnicswereasfo1lows：ratioofsolidtoliquidat1:20(wv)andpemeatingfor45minutes，extraction2timesand1hourforeachtimeTheoptimumproportionofmatrixofCompoundBreyniafruticosaOintnentwasPEG4OOO-PEG400-Tween-80-glycerin(6:1:0.1:0.5)ConclusionHPLCmethodfordeterminationofepicatechinandmatrineissimpleandselectiveAndcanbeusedforqualitycontrolofCompoundBreyniafruticosaOintnent.Theoptimizedointmentwasfineuniform，withductilityandstablepropertiesWiththisoptimumproportionofmatrixbetterqualityCompoundBreyniafruticosaOintnentcanbepreparedKeywords:CompoundBreyniafruticosaIIOintnent，HPLC，Matrix，Orthogonaltest目录摘要.Abstract.1前言.12材料与仪器.22.1仪器.22.2对照品.22.3试剂.22.4样品.33方法与结果.33.1指标成分含量测定.43.2正交试验.73.3基质配比优选工艺.134讨论.144.1指标成分含量测定分析.144.2基质配比优选工艺分析.155结论.15参考文献.17综述.18致谢.2501前言黑面神为大戟科植物黑面神Breyniafruticosa(L.)Hook.f.的干燥全株，2010版中国药典附录25以鬼画符收载1。分布在我国南部及云南、贵州、浙江和福建等省，生长于灌木林中，散生山坡、平地旷野灌木丛中，全年可采2。具有“清湿热、化瘀滞”的功效。在临床应用上用于治疗各类皮肤病、治疗慢性支气管炎、治疗各类咬杀等。复方二藤洗剂3（由南蛇藤、忍冬藤、三桠苦、大飞扬、黑面神和虎杖等制成）对掌跖脓疱病有清热解毒，祛斑消疱的功效。福建药物志载曰:“黑面神叶、百部各60g。水煎冲明矾适量，洗患处治漆过敏，湿疹。”神矾散在现代临床应用中，对于接触性皮炎、皮肤瘙痒证、脚气病、冻疮、湿热隐疹等症有效，尤其对于接触漆或红花油引起的皮肤过敏有特效4。林挺等人5通过醋酸去炎松霜与中药三七洗剂（由黑面神、苦参、七大姑、蛇床子、野菊花、三亚苦、荆芥，白鲜皮和布渣叶等制成）治疗婴儿急性湿疹疗效进行了对比研究，发现二者的总有效率分别达到87.5%和93.5%，证实中药三七洗剂对婴儿急性湿疹有显著疗效。苦参为豆科槐属植物苦参(SophoraflavescensAit.)的干燥根，始载于神农本草经。其味苦、性寒,具有清热燥湿、祛风、杀虫、利尿等功效。用于热痢,便血,黄疸尿闭,赤白带下,阴肿阴痒,湿疹,湿疮,皮肤瘙痒,疥癣麻风等病症。外用亦治滴虫性阴道炎6。大量研究发现,苦参在医疗方面具有抗肿瘤活性、抗肝损伤、抗溃疡、抗生育、抗炎抑菌、抗心率失常、抗病毒以及治疗慢性肝炎等作用7。苦参还具有抗原虫活性,能抑制致病性皮肤真菌,与百部合用可治甲鱼疥癞、毛霉病等8。张耀龙9报道,苦参碱能抑制角朊细胞增殖,并有抗炎和调节免疫的作用,临床上曾治疗银屑病32例,。由大黄10、连翘、苦参、蛇床子、白屈菜、冰片和赤芍组成的舒肤软膏，功能清热解毒，燥湿止痛，主治疱疹、脓疱疮和湿疹等。另有文献报道11，蛇肤外洗方(主要由三桠苦、地胆头、地肤子、蛇床子、黑面神、漆大姑、金银花叶组成)是广州市名老中医潘仲明的经验方，功效为清热除湿，祛风止痒，与小儿湿疹治则相合，有良好的治疗效果。方中地肤子、蛇床子祛风止痒，黑面神解毒除疮，诸药合用，共奏清热利湿、祛风止痒、解1毒除疮之效。根据黑面神和苦参在皮肤病上的显著疗效，本实验拟研制出以黑面神为君药，苦参为臣药，白鲜皮、蛇床子和地肤子为佐药的具有消炎止痒功效的外用制剂复方黑面神软膏。基质主要为水溶性基质聚乙二醇4000，聚乙二醇400和吐温-80等。本课题前期实验者王英晶等人12对黑面神枝叶中表儿茶素含量测定及水提工艺优化进行了研究，采用高效液相色谱法测定黑面神枝叶中表儿茶素含量，运用正交试验考察浸泡时问、加水量、提取时间及提取次数对表儿茶素含量的影响。得出黑面神枝叶水提最佳工艺条件为：药材加20倍量水浸泡45分钟，80温浸提取2次，每次1小时。本实验对王英晶运用HPLC测定表儿茶素含量的方法进行了验证，并在此基础上采用相似的工艺条件对苦参中苦参碱的含量进行优化，最终配合使用基质制得复方黑面神软膏。2材料与仪器2.1仪器1100型高效液相色谱仪AgilentBs224s型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司KQ3200E型医用超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司JB-3A型恒温定时磁力搅拌器上海雷磁创益仪器仪表有限公司TDL-60B型台式离心机上海安亭科学仪器厂RE-2000B型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂SHB-型循环水真空泵巩义市英峪华中仪器厂DHS16-A多功能红外水分测定仪上海精密科学仪器有限公司2.2对照品表儿茶素对照品中国药品生物制品检定所（批号110878-200102）苦参碱对照品中国药品生物制品检定所（批号110805-200508）2.3试剂水为屈臣氏蒸馏水；甲醇为色谱纯；聚乙二醇4000，聚乙二醇400，聚山2梨酯80，丙三醇，羟苯乙酯为化学纯；其余试剂为分析纯。2.4样品黑面神枝叶购自广州至信药业有限公司，经广州中医药大学生药鉴定教研室黄海波教授鉴定是大戟科黑面神属植物Breyniafruticosa（L.）Hook.f.的干燥嫩枝叶；苦参（广州至信药业有限公司，批号：140601）；蛇床子（广州至信药业有限公司，批号：150101）；地肤子（亳州市毫广中药饮片有限公司，批号：20120722）；白鲜皮（广州至信药业有限公司，批号：140601）。3方法与结果技术流程：合并最佳提取液基质配比研究复方黑面神软膏制成表儿茶素最佳工艺提取液苦参碱最佳工艺提取液聚乙二醇4000、聚乙二醇400、聚山梨酯80、丙三醇、羟苯乙酯L9(34)正交试验确定表儿茶素最佳提取工艺L9(34)正交试验，干膏率测定确定苦参碱最佳提取工艺33.1指标成分含量测定3.1.1色谱条件BostonGreenODSC18色谱柱(4.6mm250mm，5m)，流动相甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱(程序见表1)，流速1.0mLmin-1，检测波长：表儿茶素280nm，苦参碱220nm。柱温30，进样量20L。在此条件下,表儿茶素和苦参碱与相邻峰能达到基线分离，其保留时间分别为48.333min和10.026min。理论塔板数按表儿茶素计算不低于3600，按苦参碱计算不低于4000。表1梯度洗脱程序时间（min）甲醇（%）0.1%磷酸溶液（%）059515158535188260237765595图1表儿茶素对照品溶液液相色谱图图2表儿茶素供试品溶液液相色谱图4图3苦参碱对照品溶液液相色谱图图4苦参碱供试品溶液液相色谱图3.1.2对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品8.4mg，加50%甲醇制成每1ml含0.84mg的溶液，摇匀，得表儿茶素对照品溶液；精密称取苦参碱对照品14.7mg，加甲醇制成每1ml含1.47mg的溶液，摇匀，得苦参碱对照品溶液。3.1.3供试品溶液的制备取黑面神药材30g加20倍量水浸泡45min，80温浸提取2次，每次1h，过滤得药渣，滤液70减压浓缩到一定量，用50%甲醇定容至50mL，得表儿茶素供试品溶液。药渣和剩余的4味药（苦参15g，白鲜皮10g，蛇床子8g，地肤子5g）加20倍水浸泡45min提取2次，每次1h，提取液过滤，浓缩至一定浓度，加95%乙醇沉淀至70%浓度，4放置一夜，抽滤，滤液回收乙醇，用甲醇定容至50mL，得苦参碱供试品溶液。3.1.4标准曲线的制备分别精密吸取3.1.2中表儿茶素和苦参碱对照品溶液50.1，0.2，0.5，1，2，4ml置5ml量瓶中，表儿茶素用50%甲醇稀释至刻度，苦参碱用甲醇稀释至刻度，在3.1.1条件下进样分析。以进样浓度（gL-1）为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，表儿茶素回归方程为:y=13346x+11.632（r=1.0000），线性范围：0.00840.0336gL-1。苦参碱回归方程为：y=1714.9x-3.8355（r=0.9999）。线性范围：0.02940.588gL-1。3.1.5精密度试验分别精密吸取同一浓度的表儿茶素对照品溶液和苦参碱对照品溶液，在3.1.1条件下连续进样6次，测得表儿茶素含量和苦参碱含量，结果显示表儿茶素含量RSD=1.85%，苦参碱含量RSD=1.17%。表明仪器精密度良好。3.1.6重复性试验取6份30g黑面神，按表儿茶素供试品溶液的制备方法进行处理。黑面神药渣，苦参15g，白鲜皮10g，蛇床子8g和地肤子5g，6份，按苦参碱供试品溶液的制备方法进行处理，在3.1.1条件下进样分析，分别测得表儿茶素含量和苦参碱含量，结果显示表儿茶素含量RSD=0.95%，苦参碱RSD=1.39%。3.1.7稳定性试验取黑面神按表儿茶素供试品溶液的制备方法进行处理，另取黑面神药渣，苦参，白鲜皮，蛇床子和地肤子，按苦参碱供试品溶液的制备方法进行处理，分别于0、2、4、8、16、24h在3.1.1条件下进样分析，分别测得表儿茶素含量和苦参碱含量，结果显示儿茶素含量RSD=1.43%，苦参碱含量RSD=0.96%，表明样品在24h内稳定。3.1.8回收率试验分别按表儿茶素供试品溶液和苦参碱供试品溶液的制备方法进行处理后的样品平均各分为6份，平行分2组，分别精密加入表儿茶素对照品0.350mg和0.715mg，苦参碱对照品0.350mg和0.715mg，按各自供试品溶液的制备方法进行处理，在3.1.1条件下进样分析，结果显示表儿茶素平均回收率达98.2%，RSD=0.75%。苦参碱平均回收率达97.5%，RSD=0.67%，表明表儿茶素和苦参碱加样回收率试验良好，符合定量分析要求。6表2表儿茶素加样回收率试验结果称样量/g样品中量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均值/%RSD/%0.50140.34580.35000.675197.030.50220.35020.35000.687698.200.49870.34530.35000.681798.040.50060.35120.70001.037298.670.50250.35080.70001.027797.800.50170.35180.70001.043199.1798.20.75表3苦参碱加样回收率试验结果称样量/g样品中量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均值/%RSD/%0.50121.2281.2302.39897.560.50241.2311.2302.38396.830.50251.2411.2302.42998.300.50141.2252.4603.61998.210.50321.2362.4603.57896.810.50181.2332.4603.59897.4397.50.673.2正交试验3.2.1表儿茶素提取正交试验3.2.1.1水提工艺条件表4因素和水平ABCD水平浸泡时间/min加水量/倍提取时间/h提取次数/次130200.51245251.02360301.533.2.1.2表儿茶素正交样品溶液的制备取黑面神30g置1000mL烧杯中，按L9(34)正交试验表进行提取，具体工7艺流程如下：黑面神加水浸泡80浸泡过滤水提液减压浓缩定容至50mL得9份样品溶液。在3.1.1条件下进样分析，测定表儿茶素含量，结果见表2，表3。表5正交试验结果试验号ABCD表儿茶素含量（mgg-1）111110.323212220.510313330.412421230.553522310.408623120.562731320.602832130.473933210.447K10.4150.4930.4530.393K20.5080.4640.5030.558K30.5070.4740.4740.479R0.0930.0290.0500.165表6表儿茶素方差分析结果因素SSfFPA0.017213.1430.05B0.00120.0630.05C0.00422.9820.05D0.041231.517ACB，以极差最小的B因素加水量作为误差项，浸泡时间、加水量和提取时间对表儿茶素含量的影响无显著性差异，提取次数对表儿茶素含量的影响有显著性差异。确定优选的提取工艺路线为A2B1C2D2，即30g黑面神加20倍量水浸泡45min，80温浸提取2次，每次1h。3.2.2苦参碱提取正交试验3.2.2.1水提工艺条件为提高苦参中苦参碱的水提得率，以苦参碱的含量和干膏率为参考指标，设计L9(34)正交试验，对浸泡时间、加水量、提取时间和提取次数进行考察，因素和水平见表3。表7因素和水平ABCD水平浸泡时间/min加水量/倍提取时间/h提取次数/次130100.51245151.02360201.533.2.2.2苦参碱正交样品溶液的制备取黑面神药渣、15g苦参、10g白鲜皮、8g蛇床子和5g地肤子置1000mL烧杯中，按L9(34)正交试验表进行提取，具体工艺流程如下：原处方药材加水浸泡煎煮过滤水提液浓缩至一定体积醇沉静置一夜抽滤滤液回收乙醇浓缩定容至50mL得9份样品溶液。在3.1.1条件下进样分析，测定苦参碱含量，结果见表4，表5。3.2.2.3干膏得率的测定参照中国药典2010年版一部（附录XA）浸出物测定法13，将正交试验所得的药液浓缩至10mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿（设重量为W1）中，水浴挥干，残渣于105干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量（设重量为W2），通过以下公式计算干膏得率。%10-2药材重量干膏得率9表8正交试验结果表评分标准：综合评分=干膏得率30%+苦参碱含量70%表9干膏得率方差分析结果因素SSfFPA0.68620.2550.05B8.489210.0480.05C1.83122.1670.05D4.87225.7660.05试验号因素ABCD干膏得率（%）苦参碱含量（mgg-1）综合评分111116.1390.5112.199212225.4502.1273.124313338.1342.3404.078421237.8972.1383.866522314.0572.1042.690623127.9361.2973.276731326.3521.6203.040832137.4131.2353.089933217.9861.8453.678K16.5746.7967.1636.327K26.8975.9077.1116.597K37.2508.0196.4487.815RK0.6752.1120.7151.488L11.6591.4231.0141.487L21.8461.8222.0371.681L31.5761.8292.0211.904RL0.2970.4041.0230.417N13.1343.0352.8552.859N23.2772.9683.5593.147N33.2723.6803.2693.678RN0.1430.7120.7040.81910误差0.8452注:F0.05(2,2)=19.00,f=2表10苦参碱含量方差分析结果因素SSfFPA0.12220.1760.05B0.32320.4670.05C2.05929.2670.05误差2.772注:F0.05(2,2)=19.00,f=2表11综合评分方差分析结果因素SSfFPA0.21721.0000.05B0.921223.5940.05D1.042226.709DCA，对苦参碱含量的影响次序为CBDA，综合评分影响提取效率的因素为DBCA。以极差最小的A因素浸泡时间作为误差项，加水量和提取次数对苦参碱含量的影响有显著性差异，浸泡时间和提取时间对苦参碱含量的影响无显著性差异。确定优选的提取工艺路线为A2B3C2D2，即黑面神药渣、苦参、白鲜皮、蛇床子和地肤子加20倍量水浸泡45min，煎煮提取2次，每次1h。3.1.3基质配比正交试验3.1.3.1正交试验条件设计将四种对基质理化性状影响较大的辅料聚乙二醇4000（A），聚乙二醇400（B），吐温-80（C）和甘油（D）定为因素，根据初选数据定下以下三个水11平：表12因素和水平ABCD水平PEG4000/gPEG400/g吐温-80/g甘油/g1101.00.20.52111.50.31.03122.00.41.5表13正交试验结果试验号ABCD综合评分111114721222523133368421235752231706231293731328283213959332180K156.66762.00078.66765.667K273.33373.66765.00075.667K386.00080.33373.33373.667R30.33318.33315.66710.000表14方差分析结果因素SSfFPA1392.66722.2740.05B508.66720.8300.05C380.66720.6210.05D268.00020.2740.05123.1.3.2试验结果分析由正交试验结果可知，4个因素对软膏综合得分的影响顺序为ABDC，最佳处方为A3B3C1D2。以极差最小的D因素为误差项进行方差分析，A,B,C,D因素水平变化对结果变化影响不显著。最终确定复方黑面神软膏基质的最佳配比为聚乙二醇4000:聚乙二醇400:吐温-80:甘油=（6:1:0.1:0.5）。3.1.3.3验证试验按正交试验优选出的的最佳基质配比制备3批软膏，结果发现3批软膏的外观性状、稳定性、延展性、稠度、pH均无差别。外观性状、延展性、稠度适宜，稳定性良好，pH符合要求。3.3基质配比优选工艺3.3.1复方黑面神软膏的制备取黑面神药材30g加20倍量水浸泡45min，80温浸提取2次，每次1h，过滤得药渣，滤液70减压浓缩到一定浓度。药渣和剩余的4味药（苦参15g，白鲜皮10g，蛇床子8g，地肤子5g）加20倍水浸泡45min提取2次，每次1h，提取液过滤，浓缩至1.0g生药/ml，加95%乙醇沉淀至70%浓度，4放置12h，抽滤，滤液回收乙醇后与黑面神滤液合并，80回流浓缩至相对密度为1.071.09g/ml。取上述混合液4.8g与一倍辅料（聚乙二醇4000：聚乙二醇400：吐温-80：甘油=6：1：0.1：0.5）。药液先和丙三醇、羟苯乙酯混合，加热至70，搅拌15分钟至均匀，加入软膏基质（基质制备：取聚乙二醇4000、聚乙二醇40070加热熔融，保持70搅拌15分钟至均匀制成基质）中，快速搅拌（600r/min，15分钟）至混合均匀后，停止加热，待温度降至约40加入吐温-80，继续搅拌（600r/min，15分钟）均匀至冷凝，即得。3.3.2基质优选指标及评分标准外观性状满分为20分。从色泽均匀、质地细腻、稠度适宜、涂抹分散性及有无颗粒感等方面进行考察，每项各占4分。离心稳定性14满分为20分。将各组软膏分别置于离心管中，2500rmin1离心30min，观察有无分层或起泡现象。观察有无分层、结块、起泡13或出水等异常现象。耐寒试验满分为10分。将各组软膏用塑料样品杯装一定量置于4冰箱中1个月，观察有无分层、结块、出水等异常现象。耐热试验满分为10分。将各组软膏用塑料样品杯装一定量置于40恒温烘箱中1个月，观察有无分层、变色、霉变等异常现象。延展性15满分为20分。取10cm10cm大小的两块干净玻璃板，上面一块重125g(不足质量加砝码补足)。称取室温放置24h的各组软膏1g置两玻璃板之间，1分钟后用直尺测定延展后的软膏直径，取最大直径与最小直径之比的平均值。pH16满分为20分。分别取各组软膏5g置于小烧杯中，加等量蒸馏水充分溶解，搅拌均匀，用pH计测定每组pH，pH68为满分，其余为零分。4讨论4.1指标成分含量测定分析4.1.1提取方法的选择本课题的前期实验证明温浸提取法测定的表儿茶素含量较高且在本实验中得到验证。根据查阅文献，苦参碱的提取方法一般包括水提醇沉和醇提水沉，实验过程中比较了温浸提取法，醇提水沉法和水提醇沉法对苦参中苦参碱含量的影响。结果显示，水提醇沉法苦参碱得率较温浸法高。故选择水提醇沉法提取作为苦参碱的提取方法。为体现本实验复方的性质，每次提取时加入温浸后的黑面神药渣。4.1.2检测波长的选择中国药典2010版记载，对儿茶中儿茶素和表儿茶素进行含量测定时，检测波长为280nm，测定苦参碱含量时，检测波长为220nm。相关文献对苦参碱、表儿茶素进行含量测定时亦多数分别采用这两个检测波长。然王英晶在用高效液相色谱法测定表儿茶素含量时选用230nm为检测波长，本实验与其使用相同的实验仪器设备，本实验过程中分别比较了220nm、230nm和280nm下表儿茶素和苦参碱供试品溶液的HPLC色谱图，发现波长分别为280nm和220nm14时表儿茶素和苦参碱峰面积最大，且峰型较好，故表儿茶素选用280nm为检测波长，苦参碱选用220nm为检测波长。4.1.3流动相的选择中国药典2010版记载，测定苦参碱含量时，以氨基键合硅胶为填充剂，以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(80:10:10)为流动相。本次实验使用C18色谱柱，按此流动相测定苦参碱时，2min左右出峰，出峰时间太快导致基线漂移，且分离度不好。考虑到最后的质量标准考察要运用高效液相色谱法进行复方处方的含量测定。选用王英晶测定表儿茶素含量时采用的流动相甲醇-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱时，出峰时间为10.02min，分离度明显改善，且峰型较好。故将测定黑面神中表儿茶素的流动相运到测定苦参中苦参碱的含量。因用甲醇定容制得的表儿茶素供试品所测得的峰面积过小，而用50%甲醇定容制得的表儿茶素供试品测得的峰面积较大且分离度较好，故制备表儿茶素对照品溶液和供试品溶液时用50%甲醇定容。4.2基质配比工艺分析由于基质配比正交试验选取的四个因素聚乙二醇4000，聚乙二醇400，吐温-80和甘油之间差异性太小，且仅仅选择综合评分作为考察因素，导致正交试验结果四个因素水平变化没有显著性差异，在今后的生产工艺中需要改进。软膏主药的相对密度，主药和辅料的比例对软膏的成型均有一定影响，药液相对密度大小对软膏成型，软膏颜色影响很大。本次实验在基质配比正交试验前考察了软膏主药的相对密度，主药和辅料的比例。结果显示，当药液的相对密度为1.071.09时，药液和辅料的比例为1:1时，所制得软膏外观细腻均匀，稠度适宜。5结论本次实验在已有研究的基础上用高效液相色谱法测定黑面神中表儿茶素的含量时使用C18色谱柱，以280nm为检测波长，甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱取得较理想的实验结果。测定苦参中苦参碱含量时，以220nm为检测波长，相同的流动相进行梯度洗脱，苦参碱峰型和分离度皆较好，表明实15验切实可行。实验过程中两次运用L9(34)正交试验优化处方提取工艺以及软膏基质配比工艺，最终制得的复方黑面神软膏外观细腻均匀，延展性、稠度适宜，性状稳定。查阅相关文献，关于制备复方黑面神软膏的报道几乎没有。软膏基质包括油脂性基质、乳剂型基质和水溶性基质，本次实验制备复方黑面神软膏选用水溶性基质，选用其他基质制备复方黑面神软膏还需进一步研究。16参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典S一部.北京:中国医药科技出版社,2010.2MengDH,ChenWL,ZhaoWM.Sulfur-containingspiroketalglycosidesfromBreyniafruticosaJ.JournalofNaturalProducts.2007,70：824-829.3李东海,李勇,齐庆,等复方二藤洗剂治疗掌跖脓疱病疗效观察J陕西中中医,2010,31(12):16264姚启华神矾散的制备与用法J中国中医药信息杂志,1997,4(6):285林挺，徐洁明.中药洗剂治疗婴儿湿疹的疗效观察J.实用医学杂志，2003，19（8）：8296国家委员会.中华人民共和国药典S.一部.北京：化学工业出版社，20101887张宏利,张跃进,韩崇选,等.苦参生物活性研究进展J.西北农林科技大学学报,2004,32(5)：31-37.8林斌,钱蕾.防治鱼病的几种野生中草药J.福建农业科技,1999,(6):379张耀龙.苦参碱治疗银屑病临床观察J.河北医学,1996,2(6):590.10周勇高,韩燕全,孟楣.HPLC法同时测定苦黄软膏中大黄素、大黄酚的含量J.安徽医药,20011,15(4)：430-1.11黄向红.蛇肤外洗方治疗小儿湿疹的临床研究J.新中医,20011,43(6)：75-76.12王英晶,彭伟文,梅全喜,等黑面神枝叶中表儿茶素的含量测定及水提工艺优化J中国实验方剂学杂志,2014,20(9)：93-95.13国家药典委员会.中国药典2010年版M.北京：化学工业出版社,2010,附录25.14张带荣,张耕,张红白疕消软膏基质的工艺优选J中国药师,2009,12(12):174015孟楣,王晓玉,刘奇虓,等星点设计-效应面法优化苦黄软膏基质组方J中国中医药信息杂志,2011,18(6):521716于鑫,李西林,柳国斌,等.正交试验法优选水溶性紫朱软膏基质J.中国实验方剂学杂志,2012,18(15)：42-44.综述黑面神的化学成分和药理作用研究进展1概述黑面神属（Breynia）又名山漆茎属，属于大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠亚科。本属植物共26种，主要分布在亚洲东南部。我国5种，分布于广东、海南、广西、云南、福建、浙江、贵州等地。分别是小叶黑面神（Breyniavitisidae）、钝叶黑面神（Breyniaretusa）、喙果黑面神（BreyniarostrataMerr.）、广西黑面神（BreyniahyposauropaCroiz）和黑面神（Breyniafruticosa（L.）H.）。黑面神Breyniafruticosa（L.）Hook.f.又名青凡木，膝大治，蚊惊树，钟馗草，四眼叶，狗脚刺1。为广东常用地产药材，其根和枝叶均可入药，味微苦，性寒，有毒。具有清热祛湿、活血解毒的功效。主要用于腹痛吐泻，湿疹，缠腰火丹，皮炎，漆疮，风湿痹痛，产后乳汁不通，阴痒等症的治疗2，还作为湛江蛇药的一种重要成分。中华本草3记载，黑面神嫩枝清热祛湿，活血解毒。主治腹痛吐泻，湿疹，缠腰火丹，皮炎，漆疮，风湿痹痛，产后乳汁不通，阴痒。黑面神根祛风，解毒，散瘀，消肿。主治乳蛾，咽痛，热泻，漆疮，鹤膝风，杨梅疮，产后腹痛，崩漏。2黑面神化学成分研究进展中华本草中记载3，黑面神枝、叶和茎皮中均含有鞣质成分，茎皮中含量为12.02%。叶含酚类与三萜。种子含脂肪油。M.Ilyas4首次在Breyniarhamnoides中检测到含有植物甾醇，包括胆甾醇、18莱子甾醇和豆甾醇等化合物。浮光苗等人5从黑面神地上部分提取得到鞣质、酚类和三萜类等16个化合物。此外还分离鉴定了新化合物aviculin。毛丽华6对采自云南西双版纳的黑面神干燥全株进行了系统的化学成分研究，从其甲醇提取物的乙酸乙酯部分和正丁醇部分中分离鉴定了15个化合物，包括熊果酸、豆甾醇、咖啡酸、Vomifoliol、4-羟基-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-酮、8-羟基木犀草素-8-鼠李糖苷、3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-酮（异佛尔酮）、3,4-二羟基苯甲醛（原儿茶醛）、香草醛、9-octadencenoicacid,2,3-dihydroxypropylester、（4S,9R）4-羟基-1-酮-紫罗兰醇-9-0-D-吡喃葡萄糖、（4R,9R）-1-酮-紫罗兰醇-9-0-D-吡喃葡萄糖、3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛。徐荔等人7建立傣药黑面神药材的质量标准研究，结果显示含有还原糖、多糖类、酚类、鞣质、内酯类、香豆素、强心苷、有机酸、蒽醌类等成分。周红娇8等对云南西双版纳大戟科植物喙果黑面神（Breyniarostrata）的化学成分进行研究，分离鉴定了包括木栓酮，算盘子酮醇，isomultiflorenone，芹菜素，谷甾醇和胡萝卜苷等6个化合物。李艳平9等对云南西双版纳的黑面神全株进行化学成分的研究，分离鉴定出20个化合物。包括5个木脂素类化学物，其中2个新的二氢苯并呋喃类木脂素类化合物。10个酚性成分，2个萜类和1个黄酮。林理根10通过研究山漆茎属植物黑面神Breyniafruticosa根的化学成分，从黑面神根95%乙醇冷浸液的醋酸乙酯部位分离鉴定了4个三萜类化合物：无羁萜、木栓醇、羽扇烯酮和算盘子二醇；3个甾醇类化合物：-谷甾醇、豆甾烷-3,6-二醇和-sitosterylglucoside-6-octadecanoate；2个脑苷类化合物：1-O-D-glucopyranosyl-(2S,3R,4E,8Z)-2-(2R)-2-hydroxypentacosanoylamino-8-octadecene-1,3,4-triol；4个其他类化合物：()-表儿茶素、-己内酯、aviculin和香草醛等13个化合物。MorikawaH等11从黑面神属Breyniaofficinalis叶子中提取到6种萜烯酯苷类，6种酚类糖缀化合物。3黑面神药理作用研究193.1抑制酪氨酸酶作用卢武林等12研究了黑面神提取物对酪氨酸酶活性的影响，通过酪氨酸酶催化氧化左旋多巴速率法体外测定酪氨酸酶活力。用Lineweaver-Burk曲线推导出黑面神提取物对酪氨酸酶的抑制效应及动力学。结果表明，黑面神提取物正丁醇部分对酪氨酸酶抑制机制为可逆的混合型抑制。黑面神提取物的正丁醇部位显示出比较显著的抑制作用。推断黑面神对酪氨酸酶的抑制成分主要集中于正丁醇部分因其极性较大，还需进一步对黑面神成分进行分离鉴定并进行实验加以确认。3.2抗炎抑菌作用彭伟文等13采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验以及腹腔注射冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高试验，研究黑面神水提液对炎症反应的作用。结果表明，黑面神水提液高、中、低剂量组均有显著地抑制二甲苯引起小鼠耳廓肿胀及由冰醋酸引起组织毛细血管通透性增高的作用。表明黑面神水提液能显著抑制急性炎症反应。文献14报道黑面神有抑菌作用，1:1200黑面神流浸膏稀释液在试管内对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、甲型链球菌均有很强的抑菌作用。另有文献报道15，黑面神合剂（由黑面神叶、东风桔根、鸭跖草、尖尾芋根茎和补骨脂制成）和主药黑面神100%煎液，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、弗氏痢疾杆菌和甲型链球菌等五种细菌体外抑菌作用较强。3.3抗病毒作用黑面神全草提取物（100500g/ml）对鼠RNA病毒逆转录酶和人DNA聚合酶有抑制作用，其IC50分别为2.0g/ml和5.0g/ml16。孟正木等17研究了包括青凡木在内的8种中草药提取物，对水疱性口炎病毒、腺病毒型、单纯疱疹病毒型、流感病毒A型及艾滋病毒逆转录酶活性的影响。结果显示青凡木（黑面神）对水疱性口炎病毒和腺病毒显示出较低的CPIE，表明青凡木具有较强的抗病毒活性。203.4免疫抑制作用为探讨黑面神水提物对小鼠的免疫调节作用，彭伟文等18连续给小鼠灌胃黑面神水提物5天，观察黑面神水提物对正常小鼠免疫器官指数的影响，并采用炭廓清实验法测定小鼠网状内皮系统中巨噬细胞的吞噬功能。结果显示，黑面神水提物各剂量组与空白对照组相比，均能明显降低正常小鼠的脾脏及胸腺指数，降低小鼠网状内皮系统中巨噬细胞吞噬碳粒的能力。3.5抗皮肤I型超敏反应作用彭伟文等19采用尾静脉注射0.025%低分子右旋糖酐诱发小鼠阵发性皮肤瘙痒模型，通过比较黑面神水提物高、中和低剂量（18、9和4.5g/kg）组，扑尔敏（4mg/kg）与空白对照组（内源性组胺和外源性组胺实验，等容蒸馏水）实验结果发现，黑面神水提物组小鼠30min内瘙痒发作次数显著减少，持续时间显著缩短，毛细血管通透性显著降低。得到黑面神水提物可通过抑制组胺的释放发挥抗皮肤I型超敏反应作用的结论。3.6其他作用大戟科134种药物有80种以上的品种有清热解毒、消炎止痛的作用，治疗痈疮肿毒、肠炎痢疾及虫蛇咬杀。MorikawaH等11从黑面神属（Breyniaofficinalis）叶子中提取到6种萜烯酯苷类和酚类糖缀化合物，具有一定的清热解毒、消肿的作用。浮光苗等5从黑面神属（Breyeniafruticosa（L.）Hook.f.）干燥的地上部分提取到鞣质、酚类和三萜类等化合物，具有清湿热，化瘀滞、治疗毒蛇咬伤、疗毒、疮疖和湿疹的功效。OluyemiA等20从黑面神属树皮中的提取物具有抗失眠作用。现代药理学研究证明其具有抗肿瘤、抗病毒的活性，以及调血脂的作用21。全国中草药汇编记载：“黑面神叶30g，东风橘、芒果叶各15g，红糖9g。水煎服，每日1剂治疗慢性支气管炎。”岭南草药志载曰:“黑面神叶、蛇总管、黑骨走马，捣烂取汁，再用洗米水将药煎汤1小碗，加入药汁和服，药渣外敷伤口周围治蛇咬伤”。以黑面神为主药的制剂在岭南地区使用广泛，如复方黑面神糖衣片、复方东桃片、黑面神合剂（II），具有清热解毒，止咳平喘，扶正培本的功效，均可用于治疗慢性气管炎。而黑面神合剂（I）用于治疗子宫内膜炎、附件炎22。213.7毒性黑面神味苦性寒，有毒，枝叶是其毒性部位，历代本草均有记载。生草药性备要记载，黑面神味甘，性寒。中华本草中记载，黑面神根味苦，性寒，有毒。内服不宜过量，不宜久服。孕妇禁服。浙江药用植物志：“孕妇忌服。黑面神根有毒。内服过量可引起中毒性肝炎。”中国植物图谱数据库收录黑面神为有毒植物。曾有报道称23，4例患者服30100g鲜品（煎剂）后引起中毒性肝炎，表现为头晕、头痛、上腹不适、频繁呕吐、胃纳减退、黄疸、甚至深度昏迷，肝肿大、压痛，肝功能检查明显损伤；1例小孩因肝昏迷而死亡24。中药大辞典中记载25，小鼠腹腔注射5%去鞣质的黑面神注射液两星期无死亡。家兔静脉注射鞣质的黑面神注射液10天未见异常，解剖检查各脏器无任何改变。表明除去鞣质的黑面神注射液毒性较低。4黑面神研究展望黑面神是我国民间传统用药，具有清湿热，化瘀滞功效。查阅文献可知，黑面神的主要化学成分包括鞣质、植物甾醇、酚类、三萜和木脂素类等；药理作用包括抑制酪氨酸酶作用、抗炎抑菌作用、抗皮肤I型超敏反应作用、抗病毒作用和免疫抑制作用等；临床应用包括治疗各类皮肤病、治疗慢性支气管炎和治疗各种咬伤等。虽然近年来对黑面神药理作用及临床应用的研究报道日益增多，但通过对黑面神的化学成分研究、药理学研究、临床应用等方面的总结发现黑面神在化学成分和药理研究方面，进展缓慢，尤其是在国内，有关黑面神各个方面研究的文献都很少，且这些文献多数只是对黑面神单味药的考察研究，复方少之又少。黑面神作为广东的地产药材，资源丰富，具有广泛的生物活性，在皮肤病方面更有显著作用。广东的湿热天气适合各类病菌的生存繁衍，常是湿疹、带状疱疹、麻疹、皮炎等多类皮肤病的高发区。然而，价格便宜、含中药有效成分的皮肤外用药种类仍较少。开发出安全有效、使用方便、价格便宜