高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体.doc

高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体摘 要在植物基因功能分析中广泛使用的双链RNA干扰（RNAi），是一种高效率的系统，对于制作发夹RNA（hpRNA）结构有一个很大的需求量。在这里，我们描述了一种新的限制性连接方法，提供了包含内含子的hpRNA（ihpRNA）载体的一种简单而高效的建设。该系统以优势型IIS的限制性内切酶BsaI和我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG（GG）以GG克隆为基础。这种方法需要有感兴趣的基因的BsaI识别序列侧翼只有一个单一的PCR产物，然后可以克隆到pRNAi-GG上在正方向和反方向同时形成ihpRNA的构造。在这个过程中，在一个管与一个限制性连接步骤完成后，产生的重组ihpRNA具有高效率和零背景。我们证明与pRNAi-GG载体向量生成的ihpRNA结构的效用有效沉默各种单独的内源和外源标志物基因以及同时沉默这两个基因。此方法提供了植物功能基因组学的大规模分析的新颖的和高效率的平台。介绍在双链RNA被发现作为一体的能触发RNA干扰（RNAi）之后1，RNA干扰也成为一个基因功能2-4分析的最强大的工具。 发夹RNA（hpRNA）结构通常用于通过RNA干扰5的机制来诱导靶基因的degra-dation。在植物中，含有发夹RNA的内含子（ihpRNA）配有一个内含子作为间隔序列表示出了最高基因沉默效率6。因此，ihpRNA结构已被广泛用于植物中的基因沉默。与在植物中基因序列的爆炸性释放和基因组序列，高效率和成本制作ihpRNA结构系统需求量很大。为了便于ihpRNA结构的产生，几种方法已经被报道。传统的连接酶的载体如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA结构6。该方法需要几轮限制和连接，并且因此，比较乏味和耗时。有一种可替代地方法，GATEWAY克隆系统为基础的RNAi载体如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被广泛用于产生ihpRNA结构7-9。在这个系统中，一个单一的PCR产物，从含有适当attB1和attB2位点的引物，可以是同时重组到载体中以形成所述两个臂的发夹。因此，它比传统的基于连接酶的系统更简单和更快速。然而，该方法通常需要两个克隆步骤，包括BP和LR反应生成最终ihpRNA。此外，使用的试剂系统是相当昂贵的，特别是对在发展中国家研究人员。除了传统的基于连接酶系统和GATEWAY系统中，几个重叠扩展（OE）PCR方法被开发来构建ihpRNA盒子。一个叫DA-ihpRNA方法，用于直接从基因组DNA扩增ihpRNA结构，被描述Xiao等10。我们实验室先前报道的混合单步骤OE-PCR方法，通过组装靶基因的两个反向重复片段并且在一个管内的内含子11产生ihpRNA结构。陈等人采用了类似的策略构建其立即插入由TA克隆12的最后的植物表达载体ihpRNA盒子。这些基于PCR的方法不仅比常规的基于连接酶系统更简单和快速，而且比GATEWAY系统还更有成本效益。然而，它们有时会遭受低的效率，因为PCR抑制效果导致两个反向重复序列，特别是对于那些靶基因序列的自退火包含富含GC的区域和/或可以形成序列二级结构。最近，对于一个一步法构建hpRNA的100的效率是基于连接独立克隆（LIC）使用pRNAi-LIC载体，已经被发现13。这种方法简单快捷，因为它可以生成ihpRNA结构用一步法转换用于植物RNA沉默。但是，它仍然需要两轮PCR为扩增不同适配器的两个反向重复和一系列的限制性酶切的矢量线性化在使用ligation-独立克隆之前。为了开发制作一个更简单的RNAi构建系统，我们采用的是Golden Gate（GG）克隆的方法。此克隆策略依赖于IIs型限制性酶，其切割产生的DNA突出端被任意定义在识别序列外侧。此属性已被用于在单个连接反应中开发多种DNA片段的高效定向组件协议14,15。此外，在切割位点的适当的设计，二消化的片段可被连接，以产生缺乏原始的限制性位点的产物。由此，消化和连接这两个步骤可以由一个单一的限制性连接步骤所取代。根据Golden Gate克隆的这些特性，我们在这里描述，通过我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG的构建，一步法和成本效用能产生ihpRNA有效的方法。利用这个系统，一个植物ihpRNA表达载体可以从感兴趣的基因的单一PCR产物通过单管限制性连接反应和一步转化制成。该方法已成功地应用于产生ihpRNA构建其他各种内源性和外源性标记基因以及两个基因同时有效沉默。我们的结果表明，这种新方法提供了一种制造ihpRNA构建体的高通量和可靠的平台，由此，可以促进在植物中的一个大型功能基因组学分析。结果为了构建ihpRNA载体而发展Golden Gate策略通过使含内含子的反向重复快速和高通量克隆到载体中一个Golden Gate 策略，我们开发了一种新的植物的T-DNA的RNAi载体，pRNAi-GG。这个载体由在重复的CaMV35S启动子和Nos终止子之间的ccdb基因 - Pdk内含子 - ccdb基因（图1A）。在原有的ccdB基因中，一个BsaI识别位点，被不改变编码的氨基酸序列的位点特异性突变消除。两个BsaI位点侧翼每个CCDB基因和被定位的酶切位点在载体中被消除，在合适的产物酶切和连接后。 BsaI对第一CCDB基因的左侧切割位点和第二个CCDB的右侧的序列是相同的，但具有不同的方向和其他两个BsaI位点相同。因此，一个单一的PCR产物可以在正义和反义方向同时替换两个CCDB基因以形成发夹（图1B）的两个臂。使ihpRNA构造中，感兴趣的基因的目标区域扩增在两端侧接BsaI识别位点，和切割位点的序列（适配器pRNAi-GG）是在载体上的合适的序列是互补的。引物设计的普遍形式是59-保护碱基 - BsaI - 适配器pRNAi-GG - 基因序列特异性39。在BsaI酶和T4连接酶的存在下，纯化的PCR产物和pRNAi-GG的孵化产生所需要的载体。由于不存在原来的BsaI位点（图1B），它是稳定的。该混合物然后可以直接转化到标准的大肠杆菌菌株中，如DH5中和TOP10（但不是在DB3.1），只含两个臂的重组体将被回收。因为pRNAi-GG是二元载体，重组pRNAi-GG构建体可以反式直接转化到农杆菌用于植物转化。植物ihpRNA构建体pRNAi-GG快速和高效的克隆为了测试我们的新的植物RNAi载体pRNAi-GG的制造ihpRNA构建体的效率，在标志物基因的GFP（GenBank登记接入号码U87973）的337 bp的一个目标区域进行扩增，并与pRNAi-GG在BsaI酶和T4连接酶存在下混合。在不同的限制性连接时间的克隆效率，将混合物在37uC孵育0.5-2 h或为20-35个循环（2分钟37uC + 5分钟16uC）。在80uC 5分钟热灭活后，将该混合物转化入大肠杆菌DH5细胞并选择在含卡那霉素和氯霉素的LB平板中涂布。如表1中所示的，重组菌落是在增加从0.5到2小时或20至35个循环的形式。在37uC克隆2小时的效率高于20个周期，但比35个循环稍低。考虑到时间效率，在37uC温育2小时被认为是最佳条件。对于每一个转化，12个克隆使用载体特异性引物P21和P22通过PCR进行鉴定，并插入反向引物P12（图S1中，表S1），它可以同时扩大两个臂使其有（当小于12，拾取全部） 267 bp的长度的差异。所有的克隆通过琼脂糖凝胶电泳显示预期的条带，作为结果的一部分在图 2A中展示。 12个克隆还确定通过限制性内切酶消化使用BamHI和SacI鉴定（图S1）。如图2B所示，所有的菌落包含正确的插入，并在消化的两种不同位点的插入是由于内含子的方向不同。内含子的方向，也可以很容易地通过菌落PCR鉴定，使用两个内含子特异性引物P24和P25和一种载体特异性引物P21（表S1，图2C）的组合确定的。载体插入连接，六个菌落，采用P22和P23引物进行测序和他们都包含了正确的预期序列。在pRNAi-GG，氯霉素抗性基因插入到PDK内含子，以允许用于选择内含子（图1A）的存在。为了测试氯霉素抗性基因的重要性，在回收的正确的重组产物，我们比较了在存在和不存在的氯霉素的重组质粒。超过50氯霉素抗性克隆通过PCR检测，以及所有被发现具有正确的结构。而在不存在氯霉素，克隆的10-20被发现没有内含子。从三个非法重组序列显示载体本身的重组产物的两个终止子的位置（未显示数据）。因此，我们的结论是在内含子的选择标记是必要的对于ihpRNA产生构建体当我们在使用这个系统的时候。为了证明，在用Golden Gate 方法开发ihpRNA构建体时，载体pRNAi-GG的使用是可重复的和可靠的，我们还成功地产生其它重组pRNAi-GG构建体，包括从本塞姆氏烟草PDS基因的目标区域（NbPDS）（GenBank登记接入号码EU165355）和标记基因的GUS（GenBank登记接入号码AY292368），以及来自GFP的具有内部BsaI位点另一个目标区域（图2D）。要绕过内部BsaI位点的问题，两步连接法被使用。在第一步限制连接的2小时后，将酶热灭活，然后将新鲜连接酶加入到该混合物1小时进行第二连接。通过农杆菌NbPDS的外源标记基因和内源性沉默Coinfiltration已被广泛使用，以确定该功能 - RNAi构建为标记基因的沉默。为了证明ihpRNA构造（如上所述）可用于基因沉默，我们首先测试pRNAi-GUS和pRNAi-GFP的基因沉默通过农杆菌介导的瞬时表达的能力。农杆菌培养，每片含pBIN19-GUS和pBIN19-GFP和农杆菌培养物混合，各自含有pRNAi-GUS或pRNAi-GFP（对于对照），和pRNAi-GFP或pRNAi-GUS（对于对照）。该混合农杆菌培养物渗透到本塞姆氏烟草植物的相同叶片的不同部分。控制渗透区域给予了强的蓝色GUS染色信号（图3A）或绿色荧光（图3B）在3天后农杆菌渗入。然而，对于基因沉默的渗透区，得到弱得多的信号。确认测试标记基因在分子水平上的击倒，我们进行了实时PCR。结果表明，GUS和GFP mRNA水平分别减少至24和36，相对于对照样品（图3C）。除了外源标志物基因，NbPDS的mRNA水平也由含有pRNAi-PDS农杆菌培养物的浸润减少。实时PCR的结果表明，NbPDS在3天后农杆菌渗入的表达减少至17，比对照样品（图3C）。然而，PDS沉默，例如在VIGS（病毒诱导的基因沉默）的光致漂白的典型表型，未在浸润区域甚至15天后浸润观察。的原因可能是在RNA的由农杆菌渗入介导的干扰是短暂的并反应的植物，其不能达到改变的表型的电平小的区域。转基因的一般，农杆菌介导的瞬时EX- PRESSION在2-3天之后argoinfiltration，在这之后的表达水平迅速降低16达到最高水平。重组的pRNAi-GG的内含子的方向影响沉默效率由于在该pRNAi-GG载体的PDK内含子的两侧BsaI的同一切割位点，我们观察到，重组ihpRNA载体包括质粒，其中所述内含子保留了它的正向或反向的方向相对于该启动子而言。内含子的方向可以很容易地通过使用两个内含子特异性引物P24和P25和一种载体特异性引物P21的组合的菌落PCR鉴定（表S1，图2D）或通过限制酶使用BamHI和SacI（图2C）消化鉴定。引物和pRNAi-GG上的限制性位点的位置在图 S1中显示。来测试重组pRNAi-GG的内含子的方向对基因沉默的的影响，pRNAi-GFP和pRNAi-PDS在正义或反义方向的内含子被选择并用于瞬时表达测试。如图4所示，重组pRNAi-GG用不同的内含子的方向之间观察到沉默效率没有明显的差异。因此，内含子方向的选择不是关键的，并且如果需要，它可以容易地通过菌落PCR或限制性内切酶消化确认。GFP和NbPDS同时沉默考虑到Golden Gate 克隆的极高的效率，这是合乎逻辑的，去测试多个片段是否可以插入到pRNAi-GG。为此，我们制定了一项战略来构建ihpRNA在一个单一的针对两个不同的基因克隆步骤（图5A）。两个插入片段都与BsaI位点的左右两边相连，其切割位点序列被设计成使得两个插入物可在消化后连接。在不同的限制性连接时间里克隆的效率进行了测试，结果显示的最佳条件是在16uC（表1），用于在37uC2分钟，5分钟50个循环温育。通过采用这种战略的ihpRNA，即pRNAi-GFP/ PDS，针对GFP和NbPDS构建成功（图2D）。含有GFP和所述pRNAi- GFP农杆菌培养/ PDS被coinfiltrated入本塞姆氏烟草植物的叶子上。 GFP和NbPDS的同时沉默观察3天后农杆菌渗入（图5B）。讨论由ihpRNA诱导的RNA沉默是在反向遗传学最强大，最流行的工具之一。ihpRNA构建体已被广泛用于在植物中基因功能的分析。在植物中基因序列和全基因组序列的爆发性的释放，如何迅速地确定大规模的基因功能是一项艰巨的挑战。在这项研究中，我们开发了一个新的战略和新的植物RNAi载体，pRNAi-GG，为使ihpRNA只有一个限制性连接克隆步骤迅速构建。我们已经表明，ihpRNA构建体，基于Golden Gate 克隆方法的RNAi载体的产生，能有效地诱导靶基因的抑制。这种新颖的方法和我们的植物RNAi载体为大型植物功能基因组分析提供了高通量平台。我们介绍的方法比以传统的连接酶为基础和GATEWAY系统有很多优点。首先，ihpRNA构建体可以在一个管中来产生一种限制性连接步骤。 ihpRNA构建的克隆过程可以在几个小时内完成。第二，我们的方法只需要一个单一的引物对和普通试剂，它们是相对节省成本。第三，有CCDB和氯霉素抗性基因两者，我们的新的载体pRNAi-GG可以用来具有零背景克隆效率ihpRNA构建体。第四，pRNAi-GG是一个二元载体;从而，允许重组pRNAi-GG构造来直接转化至农杆菌用于植物转化。总之，这些优点大大方便和提高大规模基因功能分析的高通量的应用程序。最近，对于ihpRNA的一步法生成与基于使用pRNAi-LIC载体连接独立的克隆（LIC）100的效率构造，已经被开发13。这种方法具有几乎所有的上述优点。但是，它仍然需要两轮PCR扩增两个反向重复序列和限制性内切酶消化的载体克隆的一个步骤。另一方面，我们的方法仅要求一个单一的PCR产物，它可以立即克隆到pRNAi-GG并且无任何其它要求。因此，我们的方法是简单和快速。至少，它是用于制备一种很好的制造高通量的RNAi构建体的替代系统。由于在pRNAi-GG载体PDK内含子的两侧的BsaI的同一切割位点，我们观察到，重组ihpRNA载体包括质粒在内含子反向或保留了其正方向相对于所述的启动子子。类似的结果也在基于GATEWAY系统7,17的pHELLSGATE载体观察到。在重组ihpRNA内含子的反向方向通常被认为在沉默效率中具有负面影响，因此，在一些RNAi载体隔板片段被设计为包含在相反方向的两个内含子，以确保内含子中的一个是在正方向的 7。但是，没有数据被报道内含子的方向影响基因沉默。我们比较内含子的正向和反向对ihpRNA载体的沉默效率，发现内含子的方向对沉默效率没有明显的影响。因此，内含子方向的选择不是关键的，并且如果需要，它可以容易地通过菌落PCR或限制性内切酶消化确认。我们的方法是基于IIs型限制性内切酶BsaI。因此，这种方法的一个潜在的限制可能来自一个的偶然的存在对于感兴趣的基因的几个内部BsaI位点。为了解决这个问题，我们加入新鲜连接酶进行的限制性连接2小时，随后酶热失活，然后再加入新鲜连接酶连接1个小时。其结果是，一个ihpRNA含有一个内部的BsaI限制性位点，成功构建（图2D）。我们发现这是由于限制连接极其有效，在第一步骤中，稳定地连接在载体的末端插入片段，并且第二步连接只需要再连接内部BsaI部位突出端15。由于BsaI限制性位点具有6个碱基对识别序列，预计到存在于基因组中的每四个kb的平均值。由于ihpRNA的茎长度一般约500bp，概率多个BsaI位点是非常不可能的。因此，内部BsaI位点的偶然存在将不会限制本方法的应用。Golden Gate 克隆是建立在IIs型限制性酶的使用上，并允许多个DNA片段的装配在一个限制性连接反应中。根据Golden Gate克隆的几个协议已经报道了DNA改组14，遗传模块18,19，长度的DNA20和转录活化剂 - 样（TAL）效应21-24的组件。在这项研究中，我们通过Golden Gate克隆，使高通量ihpRNA构建。在我们的方法中，重组体可以立即在PCR产物和目标质粒中产生，而不在原始的Golden Gate 克隆中进入和目的地质粒。这意味着，PCR产物的亚克隆是不必要的，这进一步增强了高通量建设ihpRNA的。总之，我们已经开发出一种简单，快速并且可靠的制作ihpRNA结构的方法。这种方法被证明是有前途在广泛应用为植物功能基因组学的大规模分析。方法植物和质粒材料野生型本塞姆氏烟草被用于瞬时沉默的分析。pBIN19-GUS和pBIN19-GFP被基于pBIN19并各自用于GUS和GFP的表达。所有的质粒室友由麦斯特博士25提供。 pBI121的是用于植物转化26的二元载体。植物RNAi载体pRNAi-GG构建体使用T-DNA的载体pBI121作为骨架生成pRNAi-GG载体。复制的CaMV 35S启动子，用pSATN-cEYFP-C1 27作为模板扩增的。 CCDB基因的两个拷贝和PDK内含子含有氯霉素抗性基因是使用pRNAi-LIC 13作为模板的PCR扩增。在原始CCDB基因BsaI位点是由重叠PCR方法除去的，而不改变其氨基酸序列，以及被修饰的CCDB基因是在BsaI位点两侧。这些引物序列列于表S1。所有四个PCR产物克隆到T-载体PMD-18T，然后用HindIII和ApaI，ApaI和SalI，SalI和XbaI，XbaI和SacI分别消化。最后，四个消化片段是被连接到HindIII-和SacI消化的pBI121，在一个管中，以产生pRNAi-GG。 pRNAi-GG用于产生所有ihpRNA构建用于这个研究的基因沉默，并维持在大肠杆菌菌株DB3.1，其中CCDB基因不是致命的。 pRNAi-GG的全长序列和详细注释沉积于GenBank（访问号码JQ085427）。用Golden Gate 克隆法制造 ihpRNA构建体 pRNAi-GG为了沉默pRNAi-GG载体感兴趣的基因，我们通过Golden Gate 克隆法，去制造ihpRNA构建体时，只有一个单一的PCR产物是被需要的。该产品是由低聚物扩增的：59- acca ggtctc aggag - 基因特异性正向引物39和59-acca ggtctc atcgt-基因特异性反向引物39（59-保护碱 - BsaI - 适配器pRNAi-GG - 基因特异性序列39）。制作ihpRNA构建体的Golden Gate 反应是被50纳克纯化的PCR产物所设置，200纳克pRNAi-GG载体，5单位BsaI酶（NEB）和10单位T4 DNA连接酶（Promega公司，高浓度的连接酶 - 20/ ml）的10 mlin16连接缓冲液（Promega）中的总体积。限制性连接在37uC保温2小时，接着孵育在50uC（最终消化）5分钟，然后在80uC 5分钟（热灭活）。然后5-10毫升混合物转化入大肠杆菌DH5感受态细胞中，涂布含有25mg / L卡那霉素和5毫克/升的LB培养基上从而筛选重组体。用于沉默GUS，GFP和NbPDS的ihpRNA构建体是由该限制 - 连接反应中产生并分别命名为pRNAi-GUS，pRNAi-GFP和pRNAi-NbPDS。这些构建通过PCR和DNA测序证实。这些引物序列列于表S1。通过农杆菌的瞬时表达从先前报道的程序中，农杆菌渗入有轻微的变形例28。烟草植物在25uC标准条件下的生长室下16小时光照/ 8小时黑暗周期生长。所有ihpRNA构建体转化至农杆菌菌株GV3101。每个转化农杆菌的单个菌落用于接种5毫升YEP培养基（细菌用胰蛋白胨10克/升酵母提取物，10g/升;氯化钠，5克/升; pH7.0）其中含有100毫克/升利福平和50毫克/升卡那霉素。细菌生长过夜，得到1.0-1.5在28uC的OD 600，以200rpm振荡。将培养物离心2000转沉淀5分钟，细胞用浸润缓冲液（50mM MES pH为5.6，10mM的MgCl 2和100mM的乙酰丁香酮）稀释至0.1-0.3的最终OD 600，然后