荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用VIP

荧光定量 PCR 在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用 建立荧光定量 PCR 检测结核分枝杆菌方法 评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应 用价值 方法 针对结核分枝杆菌保守序列 IS6110 基因设计引物和探针 建立荧光定量 PCR 方法 分别以荧光定量 PCR 集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊肺结核患 者随访的痰标本 比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用 结果 荧光定量 PCR 的检测灵敏度为 4 Copies 反应 远高于抗酸染色法和集菌培养法 荧光定量 PCR 法 与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为 64 29 35 12 和 12 5 患者 治疗效果的随访检测结果显示 结核分枝杆菌的数量呈持续减少的趋势 结论 荧光定量 PCR 方法具有快速 敏感和特异性高的特点 可以快速 及时获取肺结核患者服药后的治 疗效果 为医生的后续督导治疗提供依据 具有重要的临床意义 结核病是全球性的重大公共卫生问题之一 全球现有肺结核病人 2000 多万 其中 95 在 发展中国家 1 我国是 22 个结核病高负担国家之一 活动性肺结核患者居世界第 2 位 每年因结核病死亡的人数达到 15 万人 给国家和社会带来沉重负担 严重影响我国经济和 社会的发展 2 结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据 提高实验室检测能 力 促进早诊断 早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施 目前临床以集菌培养和染色 镜检法为主要的实验室检测手段 大量研究表明 传统方法的检出率低 培养周期长 已 难以满足临床需要 3 4 荧光定量 PCR 是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术 具 有灵敏度高 特异性好 可定量 污染少 易于标准化等优点 该研究建立了荧光定量 PCR 检测临床结核分枝杆菌的方法 并对荧光定量 PCR 在临床肺结核诊断和疗效评估中的 应用进行了评价 现将结果报告如下 1 材料与方法 1 1 标本 1 1 1 疑似肺结核病患者 采集 2009 2010 年 5 月某传染病院诊断的疑似肺结核患者痰液标 本 168 份 其中男性 115 份 女性 53 份 年龄 15 60 岁 疑似肺结核病患者的确认依据 结核病诊断指南 患者出现咳嗽 咳痰 3 周或以上 可伴有咯血 胸痛 呼吸困难 或者 发热 盗汗 乏力 食欲降低 体重减轻 月经失调等症状 临床需进一步做痰和胸部 线检查的患者 5 1 1 2 确诊患者 选择临床确诊肺结核病患者 为确保样本采集的连贯性 在争取患者同意 随访的同时 选择暂时在家休养的就近患者 共选取 5 例活动性肺结核患者 样本采集患 者漱口后痰液 在服药前 1d 即开始留样 服药后 在随访中 1 7d 内每天采集 1 次 后续 间隔 2 5d 采集 1 次 1 2 仪器 Bact Alert 3D 全自动细菌快速培养和药敏检测系统 Heraeus 低温冷冻离心机 Megafuge 1 0R Biospec mini DNA RNA Protein analyzer 岛津 7500 荧光定量 PCR 扩增 仪 Applied Biosystems 凝胶成像系统 英国 UVI tec 1 3 抗酸染色法与集菌培养法 操作参考 结核病诊断细菌学检验规程 5 进行 1 4 痰液 DNA 的提取 取 0 5ml 痰标本加入 2 倍样本体积 4 的 NaOH 液化 10min 后 15 000r min 离心 5min 去上清液 向沉淀中加入 0 5ml 灭菌水 充分振荡混匀 15 000r min 离心 2min 去上清 重复洗涤 3 次 沉淀中加入 50 l DNA 提取液 1 NP 40 2 Triton X 100 充分振荡混匀 100 水浴 10min 待冷却至室温 15 000r min 离心 5min 取上 清液备用 1 5 荧光定量 PCR 方法 1 5 1 引物与探针设计 针对 IS6110 基因设计引物与探针 上游引物 5 GTC GCC CGT CTA CTT AAT G 3 下游引物 5 GCG GAT TCT TCG GTC GTG 3 产物长度为 107bp 探针 5 FAM CCG ACG GTG CGT AAG TGG GTG CGT CGG DABCYL3 由 上海基康生物技术有限公司合成 1 5 2 反应条件 反应体系 40 l 4 0 l 10 buffer 7 0mmol L Mg2 200 mol L dNTP 0 2 mol L 上下游引物 0 2 mol L 探针 4 LDNA 模板 2 5U Taq DNA 聚合酶 扩增条件 94 3min 94 20s 52 20s 72 20s 40 次循环 试验设定阳性对照 弱 阳性对照与空白对照 no template control NTC 按照荧光定量 PCR 分析软件设定基线 baseline 与阈值 threshold 以标准品浓度的对数值为横坐标 Ct 值为纵坐标 绘制 标准曲线 1 5 3 标准品制备 以结核分枝杆菌 H37Ra 为参考菌株 PCR 扩增 IS6110 基因并克隆到质 粒载体 提取纯化重组 DNA 10 倍梯度稀释至 107Copies mL 作为强阳性标准品 103Copies mL 作为弱阳性标准品 1 5 4 特异性 以结核分枝杆菌 H37Ra 为阳性标本 提取牛型分枝杆菌 偶发分枝杆菌 蟾 分枝杆菌 草分枝杆菌 龟分枝杆菌 肺炎链球菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 脑膜 炎奈瑟氏菌为模板检测引物与探针的特异性 1 5 5 灵敏度与标准曲线绘制 抽提标准品 DNA 10 倍系列准确定量稀释 102 107Copies mL 的 DNA 模板 分别取 4 L 进行荧光定量 PCR 扩增 1 5 6 结果判定 荧光定量 PCR 扩增曲线规则 呈对数增长 Ct 值 36 即可判定为阳性 如扩增曲线不规则或 Ct 值 40 报告为阴性 如 Ct 值在 36 40 之间 且扩增曲线呈对数 增长 样本重复测定 如 Ct 值仍在 36 40 之间报告为阴性 2 结果 2 1 荧光定量 PCR 法的特异性 结核分枝杆菌 H37Ra 出现特异扩增 凝胶电泳出现 107 bp 条带 对该 PCR 产物进行测序 序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列 其他非结核分枝 杆菌扩增结果均为阴性 2 2 荧光定量 PCR 法的灵敏度与线性 以 10 倍梯度稀释配制原始拷贝数 102 107Copies mL 的标准品系列 取 4 L 进行分子信标荧光定量 PCR 绘制标准曲线 其回归方程为 Ct 3 61344 logC0 45 78456 线性范围为 4 102 107Copies mL r 0 99503 Ct 值与 DNA 模板含量呈线性关系 经多次重复试验 最低可检测 4 Copies 反应 见图 1 图 1 荧光定量 PCR 法检测结核分枝杆菌标准曲线 2 3 肺结核的诊断 采集 168 份疑似结核病患者痰标本 集菌培养法和涂片染色法阳性检 出率分别为 35 12 59 168 12 5 21 168 荧光定量 PCR 法阳性检出率 64 29 108 168 对抗酸染色法和培养法阳性的样本 荧光定量 PCR 法的灵敏度分别为 100 和 95 4 对 20 份正常人群来源的痰标本 荧光定量 PCR 方法检测结果为阴性 符 合率为 100 2 4 随访检测 随访周期 3 个月 对 5 例活动性肺结核进行了动态检测 荧光定量 PCR 检 测结果显示 随着临床治疗方案的进行 病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋 势 即 Ct 值增加 随访期间连续 4 次测定患者标本的结果 Ct 值分别为 26 60 27 58 28 25 29 14 呈连续增加 图 2 为保证检测结果的准确性 每份晨痰都 进行平行测定 图 2 随访期间荧光定量 PCR 连续测定肺结核患者标本扩增曲线 随访期间 3 例患者转阴 2 例仍为阳性 病例 1 为男性 23 岁 发病时间约 2 个月 病 程较短 病情较轻 治疗前 X 线检查未见异常 痰涂片检查 涂阳 1 服药后在 1 个月内 迅速转阴 结核分枝杆菌从 105copys mL 减少到不能检出 病例 2 3 4 5 治疗前 X 线 检查均有不同程度的异常 病程较长 患病时间在半年以上 如病例 2 为男性 41 岁 X 线检查右上肺可见斑片状 条索状模糊影 密度不均 边缘不清 其中间见一空洞 无粟 粒 痰涂片检查结果为涂阳 3 诊断为 III 型涂阳肺结核患者 经过 3 个月的治疗 4 例 患者咳嗽 咳痰等临床症状均有减轻 病例 2 和 3 涂片与荧光定量 PCR 检测结果均转阴性 病例 4 5 仍为阳性 随访各病例结核分枝杆菌 Ct 值随时间的变化曲线见图 3 图 3 荧光定量 PCR 检测结核分枝杆菌 CT 值与随治疗时间变化曲线 3 讨论 荧光定量 PCR 是近年发展迅速的基因诊断技术 与传统检测方法比较 荧光定量 PCR 的 阳性检出率有显著提高 研究中荧光定量 PCR 与传统的培养法和涂片法的阳性检出率分别 是 64 29 35 12 12 5 与文献报道一致 6 7 而且荧光定量 PCR 法极大地缩短 了检测的时间 有助于对患者确诊并及时采取治疗手段 8 9 目前临床所用实验室检测 方法十分落后 已成为阻碍我国结核病防治工作顺利展开的重要原因 在基层建立和推广 特异性强 灵敏度高的检测方法非常必要 在对 5 名确诊结核病患者的随访中发现 经过 3 个月的治疗 3 名患者痰液中不再有结核 分枝杆菌检出 另 2 名由于感染时间较长 并有较大程度的器质性改变 经过治疗虽未很 快转阴 但排出的结核分枝杆菌数量也有显著减少 在随访监测期间 荧光定量 PCR 检测 结核分枝杆菌