人教版选修3 血红蛋白的提取和分离 课件(55张).ppt

课题3血红蛋白的提取和分离 专题5dna和蛋白质技术 思考1分离生物大分子的基本思路是什么 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么 根据蛋白质各种特性的差异 如分子的形状和大小 所带电荷的性质和多少 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等 可以用来分离不同蛋白质 思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用 作用结果是什么被破坏 变性 变性 空间结构 思考4人们用鸡的红细胞提取dna 用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么 鸡的红细胞具有细胞核 含有dna 便于进行dna的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 一 基础知识 凝胶色谱法 分配色谱法 1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 2 概念 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 来进行分离 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 4 具体过程 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液ph发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 2 作用 能够抵制 的对溶液的 的影响 维持ph基本不变 外界的酸或碱 ph值 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 使用比例 在不同ph范围内 思考 说出人体血液中缓冲液 nah2po4 na2hpo4 h2co3 nahco3 电泳 1 概念 指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液 目的是利用缓冲液模拟细胞内的ph环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色 和材料的科学研究 活性 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的ph 分类 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 测定 通常用十二烷基硫酸钠 sds 聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 由几条肽链组成的蛋白质复合体在sds的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 sds能与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素 sds 单条肽链的分子量 分子的大小 电泳检测结果 四 血红蛋白 在红细胞的组成中 约90 是血红蛋白 它由四个肽链组成 包括两个 肽链和两个 肽链 每条肽链环绕一个亚铁血红素基团 可携带一分子氧或一分子二氧化碳 血红蛋白因含血红素而呈现红色 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 包括红细胞的洗涤 血红蛋白释放 分离血红蛋白溶液等操作收集到的血红蛋白溶液 2 粗分离 透析 透析除去分子较小的杂质 3 纯化 通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去 4 纯度鉴定 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 二实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 血液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐磷脂葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 最多 血红蛋白 两个a 肽链 两个 一肽链 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 共四条肽链 90 一 样品处理 1 红细胞的洗涤 目的是去除杂蛋白 要加入柠檬酸钠防止血液凝固 离心将血液分层 用胶头吸管吸出黄色血浆 用生理盐水洗涤 2 血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下 红细胞破裂释放3 分离血红蛋白溶液 离心分层 滤纸过滤去除脂溶性沉淀层 分液漏斗分出红色透明液体 4 透析 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中 ph为7 0 透析 1 洗涤红细胞 阅读思考 洗涤的目的是什么 去除杂蛋白 洗涤过程 血液100ml 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 红细胞的洗涤 2 释放血红蛋白 阅读思考 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了哪些物质 为了加速释放过程 采取了什么措施 目的分析 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3 分离血红蛋白 分离过程 红细胞混合液 红色透明液体 分离血红蛋白溶液 有机溶剂无色透明的甲苯层 脂类物质白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液红色透明液体 红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物 二 粗分离透析血红蛋白 利用透析袋透析 三 纯化 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 3 样品的加入和洗脱 3 样品的加入和洗脱 2 凝胶色谱制作 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 底塞的制作 打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 2 凝胶色谱柱填料的处理 1 凝胶的选择 g 75 g 表示凝胶的交联程度 膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值 即每克凝胶膨胀时吸水7 5克 2 方法 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后 配成 蒸馏水 凝胶悬浮液 交联葡聚糖凝胶 固定 将色谱柱处置固定在支架上 装填 将 一次性的缓慢倒入 内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶填装均匀 3 凝胶色谱柱的装填方法 凝胶悬浮液 色谱柱 洗涤平衡装填完毕后 立即用缓冲液洗脱瓶 在 高的操作压下 用300ml的20mmol l的磷酸缓冲液 ph为7 0 充分 12小时 洗涤平衡 50cm 3 样品加入与洗脱 加样前 打开下端出口 使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐 关闭出口 缓冲液 凝胶面 加透析样品 注意正确的加样操作 不要触及破坏凝胶面 贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动 调整缓冲液面 与凝胶面平齐 滴加透析样品 用 将1ml 的样品加到色谱柱的 样品渗入凝胶床 洗脱 打开下端 用磷酸缓冲液洗脱 收集 待 接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每 收集一试管连续收集 吸管 透析液 顶端 样品完全进凝胶层 5ml 红色的蛋白质 开始进行层析 收集得到的纯化后的蛋白 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 思考 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步 包括 样品处理 粗分离 纯化和纯度鉴定 首先通过洗涤红细胞 血红蛋白的释放 离心等操作收集到血红蛋白溶液 即样品的处理 再经过透析去除分子量较小的杂质 即 然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去 即样品的 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 思考 样品的粗分离 纯化 纯度鉴定 四 纯度鉴定 凝胶电泳 观察你处理的血液样品离心后是否分层 见教科书图5 18 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的提取纯度 三实验结果分析与评价 注意 凝胶装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间的空隙 装填凝胶柱时不能有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面 否则可能有气泡混入 影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 不能发生洗脱液流干 露出凝胶颗粒的现象 否则重新填装 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯 检查凝胶是否装填得均匀 此外 还可以加入大分子的有色物质 例如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 观察色带移动的情况 如果色带均匀 狭窄 平整 说明凝胶色谱柱的性能良好 如果色谱柱出现纹路或是气泡 轻轻敲打柱体以消除气泡 消除不了时要重新装柱 如果凝胶色谱柱装填得很成功 分离操作也正确的话 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 如果红色区带歪曲 散乱 变宽 说明分离的效果不好 这与凝胶色谱柱的装填有关 注意事项 1 红细胞的洗涤 洗涤次数不能过少 低速 短时离心 2 凝胶的预处理 沸水浴法时间短 还能除去微生物和气泡3 色谱柱的装填 装填尽量紧密 降低颗粒间隙 无气泡 洗脱液不能断流 4 色谱柱成功标志 红色区带均匀一致地移动 1 用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中 关于蛋白质的叙述 正确的是a相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质b相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质c相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质d二者根本无法比较 教学反馈 1 凝胶色谱法是根据 分离蛋白质的有效方法 a分子的大小b相对分子质量的大小c带电荷的多少d溶解度2 缓冲液的作用是 在一定范围内 抵制外界的影响来维持 基本不变 a温度bphc渗透压d氧气浓度3 电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷 的电极移动 a相同b相反c相对d相向4 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的 与氧气的运输有关 a血红蛋白b肌红蛋白c肌动蛋白d肌球蛋白 b b b a 5 血液由血浆和各种血细胞组成 其中 的含量最多 a白细胞b血小板c红细胞d淋巴细胞6 为防止血液凝固 在采血容器中要预先加入抗凝血剂 a naclb 甲苯c 蒸馏水d 柠檬酸钠7 将搅拌好的混合液转移到离心管中 离心后 可以明显看到试管中的溶液分为4层 其