【毕业学位论文】（Word原稿）促性腺激素激动剂对子宫内膜容受性调控的研究

I 第一章 前 言 随着近几年不孕症患者增多，辅助生殖技术（ 断被不孕症患者了解和接受，目前国内乃至国外各家生殖机构行体外受精 且以每年 1,000,000 人数的数量级增长，随之所面临的在体外受精 双胎率增高和卵巢过度刺激综合症（ 成为 其是预防和治疗中重度 生的问 题较为棘手。 究现状 目前报道称 其中重度 而具有高危发生 险的患者 生率甚至高达 20%左右，据估计全世界每年的 100 000 个辅助生育周期中发生重度 人数有 100，对于多囊卵巢综合症（ 多囊卵巢状态（ 者，其发生率较一般患者高 1。 大量研究表明 疗周期中发生 高危因素， 者基础窦卵泡丰富， 的文章中提到一侧或双侧卵巢有 10 个直径 4泡时，预示着在控制性超排卵过程中的高反应性状态，成为 者单侧卵巢基础窦卵泡 10，其与 次 指出多卵泡同时发育，多囊样的卵巢上皮间质的血管内皮生长因子（ 达增加，这是 者 生率增加的另一原因。再有研究发现 者 值升高有关，这可能由于 高导致雄激素雌激素转换失调。 研究表明 4，高雄激素血症是 者发生 独立危险因素，伴有高胰岛素血症的 者 病率高达 高胰岛素血症组卵巢增大速度、未成熟卵泡数及排卵期血清雌二醇（ 高于 对照组。所以针对具有卵巢过度刺激综合症发生高危风险的 现有研究表明 生时病理学改变的中心环节是全身尤其是卵巢组织的毛细血管增生和通透性增加，体液渗入第三间隙，从而导致腹水、胸水生成，大量血液外渗造成血液浓缩，血容量下降，表现为高凝状态，血管微循环障碍， 上述情况得不到改善，严重发展为血栓、 至肝肾功能衰竭 5。并且 为早发性和迟发性，如患者正常移植但未孕，黄素化囊肿自然消退，早发性 程可能 1 2 周，有自限性；如患者受孕，前期有发生 期由于 体内持续存在，迟发性 生率增加 4 倍，症状迁延不愈可持续 2。 生时轻则取消移植中断治疗周期，重则病人出现肝肾衰竭危象乃至危害生命，如何安全有效的预防和治疗 成为生殖医学领域关注的重点。 在 疗促排卵过程中，患者均有可能发生 一些患者因为某些自身因素或卵巢反应性因素而具有 发风险，具体高危因素及风险等级如下表所示： 表 1险评估表 风险因素 临界值 一级风险（患者因素） 能预测 24 颗 次级风险（卵巢反应性因素） 大于 13 颗直径 11泡 或大于 11 颗直径 10泡 2 2 和过多数量卵泡 000 或大于 18 颗大中卵泡预示严重的11 颗预示 生 平 暂无临界范围 B 水平 在促排第 5 天，停药日，取卵日三天数值升高 体支持 暂无临界范围 源性 高） 暂无临界范围 （来自 et 2010 ） 苗勒管激素； E2=激素； 囊卵巢综合症； 巢过度刺激综合症；管内皮生长素； 前研究报道 确切发病机制尚未完全阐明，对于 病的中心环节血管通透性增高，与 导的卵巢分泌血管活性物质有关，这些活性物质涉及到炎性因子系统，血管内皮生长因子（ 肾素 以及某些具有过敏体质的患者常出现对促性腺激素的高敏感性也与关， 发生是由多种因素参与的复杂过程，下面就 程中病理生理学机制进行综述。 在卵巢过度刺激综合症发生的病理生理学机制中， 生发展环节伴随免疫系统变化及一些特殊炎性产物的释放。 生时卵巢的病理生理学改变与免疫调节因子参与的过度激活炎症性反应相似，体内出现无菌性过激炎症反应，免疫系统功能亢进 6。研究发现 2， 者血浆肾素原和肾素水平升高，并且与病情严重程度显著有关，可能是 生时激活了肾素血管紧张素系统，研究发现 有可激活该系统，促进血管紧张素转化为血管紧张素；其次 活化花生四烯酸转变为前列腺素生成所需的环氧化酶，与高雌激素共同促进前列腺素合成，下游组织胺生成增加，影响毛细血管通透性增加；另外 者存在凝血系统亢进现象和血小板活化现象，血小板聚集活化释放前列腺素、组织胺， 5致血管扩张，血管通透性增加。生时大量炎性因子释放， 研究表明 7， 者腹水和血清白细胞介素 度高于对照组，白细胞介素，组织胺， 5种改变可能是通过一氧化氮系统介导来发挥血管通透性增加的作用的。 在现有研究表现， 生中伴发的血管通透性增高与血管活性物质达增加有关 1。研究起初在龋齿类动物中开始，在人类研究中证实，在使用促性腺激素促排卵阶段，尤其是 并且观察到在卵巢所有黄体颗粒细胞和内皮细胞上，均可看到 表达， 血管内皮细胞膜表面的 体偶联时，发挥促有丝分裂，血管重塑，调节通透性等作用 8。在颗粒细胞体外培养实验中，发现颗粒细胞 表达与 在时间和剂量依赖的关系 9，而且可靶向作用于血管内皮细胞，通过自分泌和旁分泌的方式，引起 起血管通透性增加的作用机制主要是由于其重塑了内皮细胞连接蛋白，包括钙粘蛋白和紧密连接蛋白 体外 加入 钙粘蛋白浓度增加，但加入雌激素则不出现钙粘蛋白的变化 10。以上研究表明 度增加主要由 成血管通透性增加主要是由于过量的 血管内皮细胞间紧密 接蛋白 达减少引起的 11。 肯定的是 发生是促排卵引起的医源性并发症，在使用大剂量的促排药物即外源性促性腺激素以获得发育均一化的卵泡过程中，体内生殖激素系统处于紊乱状态。 促排卵前期的降调节作用中被压抑至最低水平，压抑作用发挥直至 2，而在使用外源性促性腺激素后体内雌激素增高至正常水平的 5之多，雌激素的这种迅速变化在两周之内发生，与自然月经周期雌激素变化 大相径庭 12。 体内雌激素变化对心血管系统的影响是肯定的，研究表明雌激素主要以血管内皮细胞为靶向，通过简单扩散穿过细胞膜结合在受体上。赵丕文的文章中提到13，在生理情况下雌激素与孕激素的比例变化调控者子宫内膜螺旋动脉周期性形成、增生、扩张、直至充血破裂；在病理情况下，洪志鹏的研究表明 14，雌激素通过一氧化氮依赖机制来调控血管扩张，在雌激素刺激性下可产生大量的一氧化氮，而长期持续过度的一氧化氮作用可造成血管内皮细胞损伤，血小板凝聚和促炎细胞黏附，内皮屏障作用破坏，血管壁扩张性和弹性发生变化，血流动力学改变；其他的研究指出雌激素能同时影响内皮细胞外基质成分，影响血管壁胶原的生物合成和分解代谢，使胶原纤维过 度增生。但目前关于雌激素对于心血管系统的研究大多集中在绝经期妇女低刺激素状态或激素替代治疗方面， 出现的高雌激素状态具体对心血管系统的影响还不太明确。 研究表明15， 伴随的高雌激素状态通过调控副交感神经作用，来调节心血管系统功能，影响心律。 目前认为针刺疗法辅助 疗预防 值得推崇的，现如今研究主要关注针刺治疗对 结局影响，结论存在争议，有学者认为针刺治疗只起到心理安慰的作用，但针刺选穴，方法，时机的不同不能笼统的将结果相提并论。针灸通过扶正祛邪，调和 阴阳气血，使机体阴平阳秘，恢复各个系统尤其是免疫系统的功能紊乱 16。针刺治疗的独特传统中医学理论和哲学思想，辅助用于现代西医学技术中去，两者相辅相成。本实验关注针灸辅助促排卵阶段的治疗，对后期 生率的影响，结果显示针刺治疗对 防治是有利的，本文将通过一些分子生物学变化来验证其对预防中重度 生的有效性和安全性。 究现状 一种内源性阿片肽，是一种很强的阿片受体激动剂，主要是由下丘脑，弓状核，孤枢核 产生并分泌的 17，其受体广泛分布于中枢和 V 外周各系统， 前体蛋白前阿黑皮素可在腺垂体前叶、大脑及外周组织肺、胃肠道、生殖系统及免疫系统等一些细胞独立合成 18。垂体前叶分泌前阿黑皮素，在促肾上腺皮质激素释放因子（ 调控下，促进肾上腺皮质激素（ 释放，三者具有协同分泌的效应 19。 要参与机体稳态及行为活动的调控，尤其是在各种应激状态下如缺血、缺氧、休克时， 合成增加 20。 全身的调控机制十分复杂，首先 够调节自主神经，通过抑制血管舒缩功能减弱交感紧张和高血压状态；其次 够调控 ， 者协同分泌共同维持肾上腺系统及机体稳态 21；再次 免疫系统有广泛的作用， 阿片受体结合后，耦合腺苷酸环化酶（ 白激酶 A 途径抑制巨噬细胞的活性 22；在其他方面如应激性镇痛、调节呼吸、循环、心血管、消化功能方面 起重要作用 23。 目前研究已经证实针灸 对于镇痛方面的有效性，这与针灸促进 泌增加效应有关。研究证实针刺作用后，垂体后叶与脊髓腰段 量增加 24。在中枢，针刺作用后能够调控下丘脑分泌促肾上腺皮质激素（ 多，随之 成增加 25；在外周局部组织，针灸刺入在局部末梢神经产生特殊模式的刺激作用，根据针刺的强度，针刺信号传导至脊髓神经系统或是中枢神经系统。低频电针（ 1够刺激肌肉中的麦角受体，引起神经肽，五羟色胺，内源性阿片肽和缩宫素的分泌 26。 然而目前对于 控生殖系统的具体机制尚未明确， 文章中提到27，无论中枢或外周 于排卵都有抑制作用。在促排卵兔卵巢上，体主要分布于黄体和血管周围组织，但在颗粒细胞、卵泡膜细胞以及窦卵泡和排卵前卵泡均有少量表达。 文章中提到 28,在 病 人卵泡液 浓度是血清中的至少 2 倍，说明卵巢组织卵泡中可以局部自分泌不是从外周血液循环中得来的 , 发现了在子宫腔，输卵管液，正常月经周期妇女的腹腔中均可发现，而且在宫腔液中监测到在卵泡期较黄体期增高29。宋晓琳 30的文章提到，电针“三阴交”能够清除痛经大鼠氧自由基，增加子宫局部镇痛物质 挥子宫自我保护机制。 研究表明 31，卵泡液 含量与卵子质量的关系是有争议的，有研究提到在具有受精能力的成熟卵子的卵泡液中 增加的，然而也有研究显示在 取得成熟卵子的卵泡液中 含量较未成熟的卵子卵泡液含量低。所以 于卵子质量的影响尚待进一步论证。 泡液代谢组学研究进展 卵泡液主要成分是血清渗出液、颗粒细胞分泌物及卵细胞的代谢产物。除了蛋白和类固醇类物质，还存在一些小的有机化合物，比如肌酐，尿素氮，及嘌呤和嘧啶的代谢产物如尿酸等，及无机化合物和 ， K+， 离子 32 ，对于以上成分的研究统称为卵泡液的代谢组学，是近几年的研究热点。卵泡液不仅提供了卵子发育所需的基本原料及适当的环境，而且暗示了卵子新陈代谢及性腺活动的盛衰情况。本综述将从卵泡液物质代谢物和离子代谢物两方面来论述其研究进展。 质代谢 血浆中肌酐（ 尿素氮（ 者分别是含氮的有机物和蛋白质代谢的终末产物，当肾小球滤过功能降低时，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。尿酸是嘌呤代谢的终产物，反应核酸氧化分解状态，其血清浓度受外源性摄入和内源性生成两方面影响。在卵泡液微环境中亦可测出肌酐，尿素氮及尿酸等物质，其浓度反应了其所在卵泡液中卵子的物质代谢水平。对于卵泡液代谢组学，研究最多的是其与卵子质量及胚胎质量的联系， 一项对牛的卵泡液代谢组学的研究中指出 33，在卵泡液中尿素氮的浓度与血浆浓度相当，这证明了卵子质量与卵泡微环 境中尿素氮含量有联系，研究发现初级卵泡中尿素氮的含量高于次级卵泡，这可能与初级卵泡生长发育需要蛋白代谢旺盛有关，即在卵泡发育阶段卵泡液中尿素氮的含量是逐步降低的；其次高蛋白摄入与尿素氮低降解会引起血尿素氮浓度升高，血清高血尿素氮水平则影响胚胎的质量。 究则报道中 34，当进食 含量的食物，血浆与卵泡液中氨浓度均增高，同时伴有胚胎质量下降，另外在卵子体外培养液中添加尿素氮，结果显示对卵子的成熟有负面作用。 文章中提到 35，卵泡液中尿酸的含量暗示了卵泡液微环境中抗氧化能力，报道称尿酸是一种重要的可溶性抗氧化剂。 文章中提到 36，卵子成熟与卵泡液嘌呤代谢的关系，卵泡液内嘌呤代谢与肌酐水平与其中的卵子发育有很大关系，其内高浓度的腺苷酸可能与腺苷脱氨酶缺陷有关。在卵子成熟阶段，腺苷 酸与尿酸的变化幅度相似，即在较小的卵泡中浓度高并且持续不变，这说明了腺苷酸与尿酸的代谢预示了卵子成熟事件的发生，腺嘌呤和尿酸水平维持在 44l 和 l 时，有利于卵子健康发育，另外尿酸的抗氧化能力和对活性氧的对抗作用能够保护卵子发育，从这点出发看出这两种嘌呤代谢产物对卵子发育是有益处的 37；但在取卵及受精阶段，取卵时卵泡液中腺苷酸，腺嘌呤和肌酐浓度水平很低，进一步观察显示正常成熟 具有受精能力卵子的卵泡液中腺苷酸，腺嘌呤，次黄嘌呤彼此有统计学关联性，但没有明显证据显示以上三种成分独立与受精能力有关系 32。但另有研究提到嘌呤的终级代谢产物尿酸浓度增高，则与受精失败正相关。 子代谢 研究表明卵泡液的渗透压接近或略低于血浆的渗透压，其中含有电解质如 ， K+， 离子和无机盐成分，下面就以上几种离子的研究综述如下。 对于卵泡液中钠离子的研究中， 文章中提到 38，卵泡液中钠离子浓度增高可能与卵泡发育能力及刺激卵泡合成雌激素有关，在大卵泡的卵泡液中发现钠潴留，同时观察到了 19次卵泡发育伴随着卵泡体积增大则与血液渗出增多有关，而这种血液的渗出则依靠着卵泡液 卵泡液中钠离子浓度增高则充分形成这种离子梯度，渗透作用得以充分发挥，从而使血液渗入卵泡液物质增加，卵子发 育逐步成熟。 文章中提到 39，小卵泡卵泡液钾、钠浓度较血清中高，这可能与在促排卵过程中小卵泡闭锁，颗粒细胞凋亡，细胞降解所释放的钾增多有关。文章中在对牛卵泡微环境的研究中发现 33，小卵泡中钾离子浓度较大卵泡中的高，这可能与大卵泡葡萄糖代谢旺盛有关，钾离子由大卵泡细胞外液进入细胞内液参与葡萄糖代谢。 在对卵泡液氯离子的研究中， 文章中提到 40，在卵泡逐级发育的过程中，卵泡液氯离子浓度是降低的，在对鸡卵泡液实验中观察到氯离子具有诱导启动颗粒细胞分泌 赖型甾体类激素，如人绒毛膜促性腺激素，和 其他受响的肾上腺分泌的类固醇物质，而氯离子具有增强血管紧张素酶的作用，这种酶也在猪的卵泡液中可以测出。 在对于卵泡液中钙离子的研究中， 牛的卵泡液研究中提到 33，大小卵泡液中钙离子的浓度没有差异，如卵泡液中钙离子浓度增高可能与血清中钙离子浓度变化有关，而血清钙离子浓度则反映了全身钙离子储备情况，因为钙离子是全身各组织器官进行物质和能量代谢的必要离子，对于颗粒细胞来说，也是其发挥正常功能和生成甾体激素的必需离子之一 41。在 文章中提到 42，在大卵泡的卵泡液中钙离子与钠离子存在线性增长的关系，卵泡液中钙离子浓度增高则卵泡发育中该卵泡类固醇激素生成能力增强，而且能够促进促性腺激素调控卵巢合成甾体激素及诱发排卵过程。其次在小卵泡液中低钙 /镁比例与凝血酶的生成减少有关系。 8 第二章 资料与方法 究对象 根据前言中卵巢过度刺激综合症发生风险评估表的相关内容，选取 2012年 6 月 12 月在兰州大学第一医院生殖中心行 孕治疗的具有发生中重度卵巢过度刺激综合症高危风险的女性患者 102 名，拟行标准方案促排治 疗。 断标准 巢过度刺激综合症诊断及分级标准 本实验根据下页 度表，在 射后 3内，如患者出现腹胀，或腹泻，恶心呕吐等症状，阴道 B 超监测盆腔积液 5且当天血常规示1%， 5 106/断该病人发生早发性中度 在 内，患者出现重度腹胀，腹部膨隆， B 超下可见腹水，胸水，有呼吸困难，低血压等症状，同时当天血常规示 5%， 5 106/且辅助白蛋白静脉注射治疗，则诊断早发性重度 射后 12后发生 床表现，并伴随尿妊娠试验阳性，诊断为迟发性 发性在本课题观察范围内。 9 表 1巢过度刺激综合症诊断及分级 级 临床指征 实验指征 轻度 腹胀或腹部不适感 无重要改变 轻微恶心呕吐 腹泻 卵巢增大 中度 轻度症状 +以下特征 高（ 41%） 超声下可见腹水 高（ 15000） 低蛋白血症 重度 中度症状 +以下特征 血液浓缩 5% 临床证据有腹水 25000 胸水 尿 /无尿 5 严重腹部膨隆 肝酶升高 低血压和中心静脉压 体重快速增加（ 24 小时增加 1 晕厥 严重的腹痛 静脉血栓形成 极重度 无尿 /急性肾衰 实验数据恶化 心律失常 血栓栓塞 心包积液 大量胸膜积液 动脉血栓形成 成人呼吸窘迫综合症 败血症 （来自 et in 1992） 清肌酐 ; 酐清除率 ; 细胞计数 . 10 囊卵巢综合征 多囊卵巢综合症（ 床表现为月经异常、不孕、高雄激素征、卵巢多囊样表现，同时可伴有肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等代谢异常，是心脑血管病、 2 型糖尿病和子宫内膜癌发病的高危因素，严重影响患者的生活质量。 本研究采用 2003 年鹿特丹会议（ 立的标准为具备以下三项中的两项：排卵障碍：无排卵或稀发排卵，有规则的无排卵月经是本症的表现之一；高雄激素血症：血清性激素检查为总睾酮水平升高，伴有高雄激素临床体征，如年轻患者为多毛，毛发呈男性分布，亚洲女性较少见；其次为痤疮，年龄较大者可出现脱发。卵巢改变： B 超改变作为诊断多囊卵巢综合症单侧可见征的基本标准已得到普遍认可，即多囊卵巢综合症在 B 超下表现为单侧卵巢内有10直径 2小卵泡，呈现车轮样或蜂窝样排列，双侧卵巢体积10卵巢体积按 径 (横径 (前后径 (算），部分患者卵巢大小也可正常。具备上述三项中的两项诊断后，还必须逐一排除其他可能引起高雄激素的疾病和引起排卵异常的疾病如迟发型先天性肾上腺皮质增生、柯兴氏综合征、低促性腺激素低性腺激素性闭经、卵巢或肾上腺分泌雄激素肿瘤、甲状腺功能异常、高催乳素血症。 囊卵巢 多囊卵巢（ 超声检查对卵巢形态的一种描述， 关于超声诊断标准 国内外 虽然进行了 很多 研究， 但因 人种的差异， 国际上没有统一标准 。 本研究根据 2003 年鹿特丹 声 判定 标准 确定如下：单侧卵巢内直径 29卵泡数 10 ， 或卵巢体积 10同时 超声下 可表现为髓质回声增强。 者仅具有典型的超声表现，不伴有排卵障碍或高雄激素血症。 者选取标准 入标准 1 1年龄 20。 2符合 断标准或 定标准。 3可伴发输卵管因素性不孕，或男性因素性不孕，或双方因素性不孕。 输卵管因素性不孕指女方患有输卵管功能障碍，具体表现为子宫输卵管造影 11 示双侧输卵管通而不畅，梗阻或积水，伴或不伴有盆腔粘连，或腹腔镜下行输卵管通液术示双侧输卵管不通或通而不畅，术中可见盆腔组织粘连；男性因素不孕即男方患有少精子症，弱精子症，畸精子症，重度少弱畸精子症，梗阻性无精子症等因素引起的不孕；双方因素即女方患有输卵管功能障碍，伴有男方患有男性不孕病因。 4自然周期月经期血清性激素检查 1 孕治疗中均采用标准 方案促排卵方案。 2促排卵治疗中 调节剂量 11 颗。 7取卵后黄体支持仅使用雌激素和孕激素，不添加 黄体支持。 如前期已经纳入本课题的患者在治疗中出现治疗用药不符合本课题治疗标准要求的患者，及时排除该病人参与本课题，以求治疗标准纳入的均一性。 除标准 1 1年龄 35 岁。 2伴发其它原因所致不孕，如子宫肌瘤，子宫内膜异位症，子宫腺肌症、免疫性不孕，不明原因性不孕，高泌乳素血症，卵巢储备功能不良等疾病。 3自然周期月经期血清性激素指标异常，尤其 0L，或5ng/ 4未签署或拒绝签署本课题知情同意书患者。 5有严重心血管疾病，出凝血系统疾病，肝脏肾脏系统疾病的患者。 6无法完全配合医生治疗方案及生活指导，及未能完成 孕治疗周期的患者。 7伴有严重神经及精神疾病，沟通功能障碍者。 12 2 1 孕治疗中采用 长方案、短方案和超短方法的促排卵方案。 2促排卵治疗中 调节剂量 超长方案多次降调节治疗。 3促排卵治疗中降调节标 准不符合兰大一院生殖中心采用的指导标准。 4促排卵方案采用递减方案。 5停药日 机剂量 10000联用 扳机治疗。 6取卵后黄体支持添加 料与设备 床药物 控制性超促排卵药： 达菲林（ 射用醋酸曲普瑞林，每支 性腺激素释放激素激动剂，博福 果纳芬（ 重组人促卵泡激素 注射液， 300 ，基因重组型卵泡刺激素，默克雪兰诺公司）； 普丽康（ 组促卵泡素 注 射液， 100加农制药有限公司）； 尿促性腺素（ 75，珠海丽珠集团丽宝生物化学制药公司）； 人绒毛膜促性腺激素（ 2000 或 5000，默克雪兰诺公司） 床针灸用品 一次性无菌针灸针： 65 苏州华佗） 一次性无菌针灸针： 50 2 寸 苏州华佗） 一次性无菌针灸针： 40 苏州华佗） 一次性无菌针灸针： 25 1 寸 苏州华佗） 铝制针灸盒：大号（广东潮安） 灯：单头 庆航天） 剂与仪器 人 国 R&D 试剂公司） 人血管内皮生长因子酶联免疫试剂盒（欣博盛生物科技有限公司） 13 人白介素 联免疫试剂盒（上海西唐生物科技有限公司） 酶标仪（普朗酶标分析仪 9602A） 全自动生化分析仪（型号： 箱； 箱； 36C 恒温水浴箱，离心机； 高精度加液器及一次性吸头（ 000 离心管（ 1 双蒸水 ,坐标纸 验分组 在 2012 年 9 月 12 月期间予兰州大学第一医院生殖中心行体外受精及单精子卵胞浆内注射术（ 患者中，取得患者知情同意，签署知情同意书。根据卵巢过度刺激综合症发生风险评估表，参照上述纳入排除标准，选取具有发生中重度卵巢过度刺激综合症高危风险的 02名，采用随机数字表法按照建档顺序随机分为两组：单数纳入实验组，双数纳入对照组，实验组：常规促排卵辅助针刺治疗组，共 52 人；对照组：单纯促排卵组，共 50 人。 法与步骤 床试验 方案 疗前患者准备： 建立规范的病例档案，降调节前期做好以下前期体检及药物准备工作。 月经及内分泌激素情况：了解病人月经周期、行经天数、有无痛经等；自然月经周期月经来潮 2采用化学发光法检测血清性激素五项 P，T；对于伴有高雄激素血症的 者，降调前一个周期使用达英 行内分泌调节。 盆腔情况：在降调节治疗前一月经周期于月经前期、中期、后期分别行经阴道 B 超探查患者盆腔情况，明确子宫位置，宫腔深度，子宫内膜月经周期性改变是否正常；月经前期记录基础窦 卵泡数，排卵情况，有无黄素化不破裂卵泡；卵巢位置有无异常，与周围组织是否粘连；输卵管积水位置与大小，是否有反流可能；据此确定最佳采卵方式和移植体位。对于盆腔粘连患者嘱咐物理治疗以改善盆腔血液循环。对于多囊卵巢综合症和排卵障碍的患者，在治疗前一月经周期予以妈富隆进行内分泌调节。 病毒及微生物检查：双方血清甲肝，乙肝三系统，梅毒，艾滋病毒学检查， 14 如病毒感染处在活动期，则先治疗后再行 孕治疗；女方宫颈及阴道细菌学，滴虫、霉菌、淋球菌、支原体、衣原体，若有阳性发现及时行阴道上药等预防感染治疗；双方 核抗体、胸片，若有结核活动期病灶则先抗结核治疗 1 年后再行助孕治疗。 男方精液检查：精液常规及精子形态学检查，包括精液量、液化时间、酸碱度、精子密度、活动率及分级、精子畸形率检查，对于少弱畸形精子症患者，前期予以维生素 C，复方玄驹胶囊，及戒烟戒酒、规律排精的生活指导。 其它：双方染色体、血型、女方血清生殖抗体全项、男方抗精子抗体等，如有抗体阳性前期加用小剂量阿司匹林改善敏感性。 知情同意：夫妻双方了解即将进行的 情况，如大致流程及成功率，花费，注意事项等；双方了解将其纳入本课题针灸辅助治疗的范 围，同意并签署知情同意书。 特殊用药：对于有葡萄糖耐量检测异常，胰岛素抵抗的患者，根据患者实验室检查结果等予以二甲双胍治疗。 照组 疗 ： 根据患者 疗前临床及实验室检查情况，参照卵巢过度刺激综合症发生风险评估表，根据实际情况选取风险参照标准，在降调节治疗前选取满足 0， 者， 20 颗，选入满足以上条件具有卵巢过度刺激综合症高危风险的患者，从降调节开始以下促排卵治疗。 对照组患者均采用标准促性腺激素释放激素 激动剂（ 方案方案进行常规促排卵治疗。 在患者黄体中期（月经第 18左右）或服用妈富隆 20 天左右，超声监测无卵巢囊肿及黄素化未破裂卵泡，予以长效 剂达菲林 体使用剂量根据患者年龄、基础血激素水平、基础卵泡数及体重指数等因素综合判定。本中心采用的降调节标准为： 5 IU/ 20 ，超声监测卵泡直径 0.5 宫内膜厚度 0.5 下次月经期第 2行血清 定，在达到上述降调节标准后适时启动控制性超 促排卵（ 本中心常规使用的促排卵药物有：果纳芬、普丽康、尿促性素， 起始剂量根据患者的年龄、体重指数、基础血清性激素水平、基础卵泡数及降调节压抑水平等进行定量。在促排卵期间，行阴道 B 超监测卵泡大小与数目、子宫内膜厚度，同时采用化学发光法检测血清雌二醇（ 黄体生成素（ 孕酮（ P）水平，根据患者激素水平及卵泡发育情况调整促排卵药物剂量。针对纳入具有卵巢过度刺激综合症高危风险的病人，较常规促排病人缩短监测周期，尤其 15 在促排卵后期每天行激素水平及卵泡监测，以防卵巢高反应性出现高 促排中期 出现卵巢高反应性，即 000ng/侧卵巢卵泡数目 20 个伴有发育大小不均一卵泡，可采用间歇停药法（ 理；促排卵后期嘱咐病人行高蛋白及优质蛋白饮食，注意均衡营养摄入，改善生活方式。在促排卵后期行阴道 B 超监测下，当双侧卵巢中直径 18 卵泡在 11 个以上，停止 射，并在停药后 36 小时予以 丽珠集团 )5000注。在停药日前 1，安排病人清晨空腹采血，行出凝血实验和血常规检测。 患者均于 射 34时后，在全麻下行经阴道 B 超引导下穿刺取 卵术。取卵当天男方采用手淫法取精，对于手淫取精困难男方可提前取精冷冻精液备用，梗阻性无精子症患者即女方取卵当天行附睾和（或）睾丸穿刺取精，经过梯度离心法收集精子，根据人类辅助生殖技术规范选择体外受精方式，行常规 常规 程中，取卵后收集卵母细胞，从卵泡取出的卵母细胞经体外培养 6 小时后进行授精，授精后培养 16时，在显微镜下剥离卵周的残留颗粒细胞，观察卵子受精情况，在确认见到精、卵原核，标志受精成功，将正常受精卵继续培养，并于受精后的 24 小时、 48 小时观察胚胎的卵裂情况，同时评 估胚胎的质量形态学。 常规 程中，在精子准备阶段，少弱精子症的精液使用专业精子分离液，经过梯度离心收集精子；附睾穿刺抽吸取精时，收集稀释处理的附睾液，加2养液， 200g 离心 5 分钟备用；睾丸穿刺取精时，用细小弯头镊磨碎穿刺取出的曲细精管，将此悬液吸入配制好的双层梯度分层离心管中，同少、弱精子症精液操作，梯度离心法收集精子。精子准备阶段完成，取用 M成熟卵母细胞，常规行单精子卵母细胞浆注射术，将 的卵子培养 16 小时，检测受精情况，受精卵继续培养 24时，观察卵裂情况，进 行胚胎评分。 取卵后第三天，经过胚胎评分，选择质量较好的胚胎，按照我国卫生部 2003年 8 月发布的人类辅助生殖技术规范要求，首次接受 疗的年龄16中卵泡数（ 12小卵泡数（ 如表 3 验组与对照组中，原发不孕和继发不孕患者所占的比例，采用四格表卡方检验，无统计学差异 (P如表 3示。 据患者不孕症病因诊断，对研究对象进行病因构成分类，将纳入研究的患者病因分为六类： 单纯输卵管因素伴 双方复合因素伴 单纯男方因素伴女方 单纯输卵管因素伴 双方复合因素伴单纯男方因素伴女方 用四格表校正卡方检验，实验组与对照组患者病因构成没有统计学差异（ p如表 3示。 表 3两组患者基础情况比较表 实验组 对照组 p 值 年龄（岁） 孕年限（年） kg/ 础卵泡数 (个 ) H 2 3两组患者病史比较 实验组 对照组 p 值 原发不孕率（ %） 35/52） 64（ 32/50） 发不孕率（ %） 17/52） 36（ 18/50） 3两组患者病因构成比较 21 实验组 对照组 P 单纯输卵 管因素伴 %） 21/52） 34（ 17/50） 方因素伴 %） 3/52） 10（ 5/50） 纯男方因素伴 %） 1/52） 6（ 3/50） 纯输卵管因素伴 %） 20/52） 40（ 20/50） 方因素伴 %） 3/52） 4（ 8/50） 纯男方因素伴 %） 4/52） 6（ 3/50） 疗情况比较 较实验组与对照组患者进行标准长方案促排卵治疗中降调节达菲林使用剂量、降调天数、 始剂量、总 量、 数等指标，经方差齐性检验，两总体方差相等，经两独立样本 t 检验，组间没有统计学差异（ p如表 3示。 验组和对照组患者在促排卵治疗结束后，取卵日行经阴道 B 超监测到两侧卵巢的大卵泡数（ 16卵泡数）、中卵泡数（ 12卵泡数）、小卵泡数（ 如表 3示。 验组和对照组在取卵后，卵子质量及受精指标如实际获卵率（ %），率 (%)，正常受精率 (%)比较，两组无统计学差异（ p如表 3示。 验组与对照组，实验室行 者 疗方式的人数比没有统计学差异（ p如表 3示。 表 3两组患者长方案 疗情况比较 实验组 对照组 p 值 达菲林剂量（ 调天数 （天） n 起始剂量（ （ 数（天） 量（ 530 22 表 3两组患者卵泡及获卵情况比较 实验组 对照组 p 值 大卵泡数（个） 卵泡数（个） 卵泡数（个） 卵数（个） 卵数（个） 数（个） 数（个） 3两组患者卵子质量及受精情况比较 实验组 对照组 p 值 获卵率 (%) 率 (%) 精率 (%) 3组患者采用 疗比例的比较 实验组 对照组 p 值 （ %） 70（ 36/52） 80（ 40/50） （ %） 30（ 16/52） 20（ 10/50） 23 关比较 验组与对照组，两组患者 疗移植日周期取消率、 常移植率、临床妊娠率、流产率均无统计学差异（ p在取消周期的其它原因中，实验组有一例因轻度卵巢蒂扭转取消移植，对照组有一例移植日突发胃痛取消移植，如表 3示。 验组与对照组，两组患者中 生率存在统计学差异（ 而出现腹胀、便秘、睡眠差的人数有统计学差异（ 两组患者移植日盆腔腹水面积均无统计学差异 (p如表 3示。 验组与对照组， 两组患者在停药日前 2血常规中白细胞计数（ 中性粒细胞绝对值 (红细胞压积（ 血红蛋白无差异，但移植日血常规中白细胞，中性粒细胞绝对值两组有统计学差异（ 到移植日雌激素水平均下降，且实验组较对照组下降有差异，这种现象可能是针灸发挥后遗效应，针灸治疗后降低了颗粒细胞雌激素的分泌，表现出卵泡液局部微环境中钠离子的 浓度梯度降低，减弱了渗透作用，则卵泡液中雌激素及其他炎性因子入血的机会减小，同时减弱了其对心血管系统的副作用，临床上表现为减弱了 症状与表现。 如前言所述，小卵泡卵泡液钾、钠浓度较血清中高，这可能与在促排卵过程中小卵泡闭锁，颗粒细胞凋亡，细胞降解所释放的钾增多有关。而钾离子由大卵泡细胞外液进入细胞内液参与葡萄糖代谢作用。在本实验中实验针灸组比较对照组卵泡液中钾离子浓度偏低有统计学意义，从这方面也可能说明针灸干预可能促进大卵泡中的能量代谢，钾离子伴随葡萄糖入胞内流增加，细胞外液即卵泡液钾 39 离子浓度降低， 卵泡发育局部微环境原材料丰富，有利于卵子发育的高质量。 在本实验中得要的重要阳性指标是在实验针灸组与对照组卵泡液中 K+， 子浓度基本与血浆正常离子浓度范围一致，但实验组卵泡液中K+， 子较对照组浓度低，而实验组卵泡液中 子较对照组浓度高。因本实验重点关注直径大于 卵泡的卵泡液成分，对于小卵泡卵泡液代谢组学未涉及，待进一步研究。针灸在辅助 疗中，对卵泡液代谢组学的影响研究很少，本实验在此方面具有创新性。目前关于针灸对于电解质代谢方面的研究如下所述。 针灸对 调节离子水平的现有研究中， 文章中提到 63，在对于哮喘鼠模型行针灸干预后，可以降低呼吸道平滑肌细胞 子浓度，以改善平滑肌细胞重塑，研究表明针灸可能具有调控 T 型 子通道的作用，来影响细胞内子相关的表达。在 文章中提到 64，针刺委中（ 太溪（ 于骨质疏松症的病人能够改善其骨代谢水平，针灸组血清骨钙素升高，血磷下降，文章提出针灸可能有保护骨代谢中钙离子水平稳定的作用，但具体尚待研究。 在 文章中 65，利用核磁共振及现代显像技术对针灸作用原理进行研究，在细胞学水平上发现在穴位针刺的局部会产生一个横切声波，并且以不衰减的形式通过肌肉作为介质在体内传导，直达末梢神经，在细胞水平这种横切声波通过子来进行