【毕业学位论文】（Word原稿）甲状旁腺素对人甲状腺髓样癌细胞调控作用的实验研究

1 第一章 研究综述 状腺髓样癌 状腺髓样癌的起源 甲状腺癌是最常见的头颈部恶性肿瘤，也是近年来发病率增加最快的恶性肿瘤之一 1。主要有甲状腺乳头状癌、 甲状腺 滤泡状癌、 甲状腺 髓样癌和未分化 型甲状腺 癌四种病理类型。甲状腺髓样癌 （ 一种起源于分泌降钙素（ 甲状腺滤泡旁 C 细胞的较少见的神经内分泌瘤，虽然其占全部甲状腺恶性病的比例小于 10%，2。降钙素可作为 断和术 后疗效判断的指标，因为其是 异性的肿瘤标志物， 1959 年首次描述了 组织学表现，认为它是一种独立病理类型的甲状腺肿瘤。 1906 年本病被首次报到， 其称为 “伴淀粉样变的恶性结节性甲状腺肿 ”。由于起源于属神经内分泌细胞的甲状腺 C 细胞，并且与甲状腺滤泡细胞无关，故病理学家将它归为神经内分泌肿瘤或 状腺髓样癌的特征 临床上分为散发性甲状腺髓样癌 (家族性 甲状腺髓样癌 ( 以 见 ， 占 75%3,4。 据其遗传特点可分为多发性内分泌瘤 2A 型 (A， 多发性内分泌瘤 2B 型（ ）和无 族型 5。其发病通常是多病灶性和双侧性的。是一种由 癌基因的种系突变引起的常染色体显性综合征 6对 族性髓样癌的突变分析表明有超过 30 个不同的错义突变。许多错义的 因突变可导致 学者提出这些错义的突变与遗传性的 3 种不同的表型相互对应 9。目前已知这种种系 癌基因位于染色体 ，并且该原癌基因的点突变就能导致甲状腺 C 细胞的增生 10 约 80%的遗传性髓样癌是以 的形式存在的 12。系 1961 年 次描述此综合征，以 主要临床表现，约50伴有嗜铬细胞瘤 ( 30 有甲状旁腺增生或腺瘤 (13。伴有先天性巨结肠癌和皮肤淀粉样变苔藓 11。巨结肠癌是由于在大肠缺乏了自主交感神经，导致结肠扩张 、 便秘 、 梗阻所致。皮肤淀粉样变苔藓在肩 2 上会有瘙痒的皮疹 12。 与 相比较少见，约只占 的 5%，两者在临床上有很大的区别。在 1966 年 次报道了 的特点有 膜多发性神经瘤、 时伴有类马凡（ 合征，并且少数患者常伴有多发性胃肠道神经节细胞瘤，角膜神经粗大，骨骼发育异常及发育延缓等，但无甲状旁腺疾病 。不同的粘膜神经瘤存在于末梢的舌、唇粘膜和结膜下区域 11。 占遗传性 5%是以在家族中存在四个或以上受牵连的 员，并患有肾上腺髓质或甲状旁腺参与缺失来定义的。肉眼下癌组织呈实体状 ， 切面灰白 ， 无明显包膜 ， 在甲状腺组织中呈多中心性生长。病理组织学特征为 ： 细胞呈梭形或纺锤形 ， 淀粉染色阳性，这类淀粉物质实质上是 C 细胞分泌的降钙素和其它多肽类激素。 临床表现与其它类型的 本相似，主要表现为缓慢生长的颈前肿块，伴有或不伴有颈部淋巴结肿大或腹泻。不同的是发病年龄偏小，病程 进展相对缓慢 。 多表现为双侧甲状腺肿块，这与 C 细胞在甲状腺内分布的组织学特性有关，其在甲状腺组织中成多中心集簇状分布。所以有人认为对 病人主张行全甲状腺切除术或保留部分甲状腺下极的近全甲状腺切除 14。 预后好于其它类型的 甲状腺髓样癌 癌基因编码一种属于酪氨酸激酶受体蛋白家族中的成员。该受体的细胞外部分连接特殊配体 ， 连接配体后 ， 是受体间聚合及激活的过程。一旦受体被激活 ,就会发生信号的级联放大 ， 所有信号都可以通过特殊底物磷酸化而被传递 15。激活 的 变在遗传性的 占到了 95%，约 20%为散发性的。一些与肿瘤发生有关的 因的突变位点已经被证实。除了 癌基因与 发病有关。甲状腺细胞的转导与 突变导致 调 16。约 98的 、 95的 和 88的 由 癌基因突变所致 17，有人认为几乎所有的 均是由 癌基因突变引起的，迄今为止尚未发现 中除 外的基因突变 13。除 ，在肾上腺嗜铬细胞瘤中 达水平较 高 15, 这就提示 甲状腺 C 细胞和肾上腺嗜铬细胞的分化中起作用。至于在 达与甲状旁腺增生之间有无关联还未见报道。 状腺滤泡旁细胞的定位与特征 甲状腺滤泡旁细胞是具有形态和功能各异的细胞群。在正常条件下 ， 大多数滤泡旁细胞合成分泌降钙素。然而，属于 统 的滤泡旁细胞通过旁分泌和 /或自分泌分泌多种调节肽 ， 调节甲状腺局部的生长和分泌过程也是其重要的 3 作用。来源于神经嵴的滤泡旁细胞弥散于整个甲状腺内 ， 并且能够分泌多种调节肽。在哺乳动物滤泡旁细胞中发现的调节肽有降钙素 、生长抑素、胃泌素、促甲状腺激素释放激素 ( 羧基端多肽 I 和 18。而降钙素基因相关肽 (神经介素 U、胆囊收缩素、分泌肽 I 在滤泡旁细胞和支配甲状腺神经纤维中均有分布 18。 P 物质 (血管活性肠肽 (神经肽 (组异肽 (丙甘肽 (仅存在于甲状腺神经纤维中。丙甘肽往往与 存 19。研究人员通过电镜观察证实 20，滤泡旁细胞主要位于滤泡细胞之间 ， 细胞常插入上皮细胞之间 ， 而顶部往往被相邻滤泡上皮细胞形成的拱状突起 所覆盖 ， 不直接与 滤泡腔接触。滤泡旁细胞与滤泡细胞之间存在特殊的连接复合体 ， 使它们紧密连接起来 ， 这一形态学结构特点支持了滤泡旁细胞分泌的调节肽对甲状腺激素的分泌起旁分泌作用的观点。长期以来人们知道 ， 当机体对甲状腺激素的需要量减少时 ， 便可在腺体周边滤泡腔内看到大量含高浓度 缩的胶体聚集。在哺乳动物中这一区域很难发现滤泡旁细胞 ， 但其却出现在无大量胶体聚集的区域。这种甲状腺结构的特点说明 ， 滤泡细胞分泌甲状腺激素时需要滤泡旁细胞分泌的调节肽的调节机制参与。调节肽经常是经旁分泌作用附近有其受体的滤泡旁细胞。同时 ， 当滤泡旁细胞 和滤泡细胞胞膜上有其受体时调节肽可经过自分泌起调节作用。此外 ， 滤泡旁细胞在区域内不均匀分布的自然倾向 ， 对这一区域发生病变有重要意义 ， 这一现象在人类较常见 21。滤泡旁细胞也可通过分泌 55影响滤泡细胞的功能。根据最近研究 225为一种细胞之间信号分子经旁分泌途径从滤泡旁细胞到滤泡细胞 ， 并通过自分泌对滤泡旁细胞起刺激作用。 状腺髓样癌的诊断 诊起来很困难，因为其除了仅表现为甲状腺内的结节外，无任何特殊的症状同时也缺乏特异性表现。只有当肿瘤侵犯到包膜外界和 周围的组织时才可以出现相应的症状，如声音嘶哑、气道受压等，也有部分患者有顽固性腹泻。具特征的临床指标是血清学检查，降钙素与 显升高，降钙素异常升高是 异性和敏感性的肿瘤标志物。通常遗传性 发病是双侧性和多病灶性的 ， 且约 95% 发生在年轻人身上。在 病人中还可有并发症，其中大约 42%为肾上腺嗜铬细胞瘤、 25%伴发甲状旁腺功能亢进 ，同时还可伴发 ，此病是由胃肠道末梢神经节细胞缺失引起的。的病人发病时期较早，通常在婴儿期或儿童期 就可发病 ， 它是遗传性恶性程度最高的一种类型 ， 该型病人可伴发肾上腺嗜铬细胞瘤 ， 另外还可伴发黏膜神经瘤 ， 胃肠道弥漫性神经节瘤以及马凡 (合征。家族性无甲状腺髓样癌病人不伴发其他任何的内分泌肿瘤 ， 其发病年龄也比 4 的病人要大 ， 并且其病程进展也相对较缓。 状腺髓样癌的治疗 由于 于甲状腺滤泡旁细胞，不具有依赖 生物学特性，也不具备摄碘功能，因此内分泌治疗和 131I 治疗均无效。所以目前手术切除仍是首选的根治方式。其恶性程度介于分化型与未分化甲状腺癌之间， 多数患者疗效欠佳13,23。目前认为 了外科手术，其它治疗方法基本无效 24。放疗、化疗仅作为一种姑息治疗方法，生物治疗在晚期 初步开始应用，但大多还处于临床研究阶段，真正用于临床还有距离 25。经手术治疗的 者，如果血清降钙素水平降到正常值就说明肿瘤被完整切除了。术后若血清降钙素水平升高，表明手术切除不彻底或疾病又复发了。对 治疗也以手术为主，对同时患有肾上腺嗜铬细胞瘤者，应先行嗜铬细胞瘤切除术。因为若先行甲状腺髓样癌手术，有诱发高血压危象或心衰发生的可能。 因 因突变是 病的分子学基础，所以对于有关的 各种生物免疫治疗，大多数是基于 因，同时， 源于甲状腺滤泡旁细胞，组织中表达的降钙素，降钙素基因相关肽等在其他组织中很少表达或不表达，对其启动子调控可以解决载体的甲状腺靶向性问题。因此分子靶向药物、肿瘤疫苗、单克隆抗体、自杀基因或免疫基因等已经在临床使用或临床前试验中取得了令人鼓舞的前景 23。在 胞系实验中，证实此类型重组腺病毒载体可以诱导细胞凋亡，抑制细胞生长 24。随着对甲状腺癌生物知识的了解，已确定了一些生物靶向治 疗因子。凡德他尼（ 显著延缓局部晚期或转移性甲状腺髓样癌发生和进展的时间 26。从上述这些分子靶向治疗药物对 治疗原理来看，其显示出了诱人的应用前景。 在问题及展望 甲状腺癌根治术后影响生存率因素有很多，主要为手术根治程度、患者的年龄及肿瘤的临床分期。其中对甲状腺原发灶手术方式的选择仍存在分歧，然而生率低，临床表现多样性，预后影响因素文献报道不尽相同 25。且术后甲状腺功能不足和甲状旁腺功能不足等并发症的危险明显增加。由于甲状腺髓样癌具有早期转移的特性， 多数患者术后可发现肿瘤残存，所以，很有必要对甲状腺髓样癌进行更多的研究，为寻找新的有效的治疗方法提供理论基础。 尽管对 在认识 发病机制和相关性方面已取得进展，然而，在对此疾病的某些方面，如个体有相同的突变但在临床上存在异质性方面，还没有很好的答案， 因的多态性与 关性可能解释这一现象。从临床获得的资料 5 经研究证实 多态性在散发性的 起着重要的作用。然而，一些资料未能证实这些 变种与 发生或疾病的进 展有任何的关系 27。也许不同的人种背景和研究方法的缺陷是得到上述不同结果的潜在原因，在这些方面都存在争议 27。 生物学行为可通过分子诊断来指导临床实践 ， 变测试提高了 早期诊断率，并可减少不必要的早期及过度的预防性手术切除，提高了总体生存率 27。同时对 不同临床表现的分子机制方面的研究进展，可进一步细化基因型 而进一步适应治疗。 分子靶向治疗药物虽然显示出诱人的前景，但也存在一些问题。 主要是靶向治疗是一个长期、缓慢的治疗过程，见效比较慢，药物在肝 、 肾脏的 网状内皮系统沉积是否会引起患者中毒或栓塞，对其临床试用的给药有效性进行合理的评价尚存在一定的困难，因此其临床用药的最佳剂量和用药时间还存在一定的问题。随着临床试验的开展，出现了一些对靶向药物耐药性的报道，同时不同的靶向药物对 者疗效差异较大，用药方案应根据患者 变的不同位点或表达水平等制定，药物选择的适应症较强，临床普及困难。 于其独特的分子病因学基础， 已 显示出生物治疗的广阔前景。虽然目前多数研究还局限于体外细胞培养和动物体内实验，即使应用于临床治疗规模也较小，但随着分子生物学 的进展和基因工程技术的完善，生物治疗在 综合治疗中必将发挥更加重要的作用。但在实际应用中，仍存在一些问题有待解决。 状旁腺素（ 状旁腺素的特点及定位 甲状旁腺素是甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激素，由 84个氨基酸组成 ，其 15个氨基酸残基的前甲状旁腺激素原，分泌过程中它首先在粗面内质网的膜周质腔中被信号肽酶切除 5个氨基酸的信号肽部分成为甲状旁腺激素原，然后在高尔基体中被切掉 6个氨基酸的前体部分成为 84肽成熟激素 28。 84肽在体内可降解成 活性片断，由于 有 此， 端 29。以后这一前身物质在细胞内裂解成为含 90个氨基酸的第二前身物质甲状旁腺激素原，后者进而在细胞内裂解成为含 84个氨基酸的多肽，即 在血钙降低的情况下释放到血液中。 酸，碱性氨基酸的含量比较丰富。各种哺乳动物，如牛、猪、狗、鼠 以及禽类如鸡等的 鱼类的 垂体中也发现有 6 该基因定位于人第 12号染色体 5744，基因全长133123属于人类，是人类大规模测序所获得的具有完整 过对非冗余蛋白质数据库的检索，发现该蛋白在多个物种中具有高相似性的蛋白质，其相似性分别为猕猴 穴兔 猪 马 牛 大鼠 小鼠 原鸡 斑马鱼 30。 理化性质和亲水性预测结果表明该蛋 白预测分子量为 论等电点为 碱性蛋白质。 状旁腺素的生理功能与作用原理 在哺乳动物中， 节钙和磷的代谢，促使血钙水平升高，血磷水平下降。 血钙时， 合于肾和骨靶细胞上的 通过对靶细胞直接或间接的作用帮助血钙维持在一定范围。在肾脏中， 1- 羟化酶的活性，增加肠 内 1， 253介导的钙吸收；在骨骼中， 能通过直接作用于成骨细胞和间接作用于破骨细胞维持钙代谢的长期稳定。另外， 可通过抑制肾近端小管和远端小管对磷的重吸收 使血磷浓度维持在正常范围 31 。 生物化学和细胞生物学研究表明， 蛋白信号转导途径。其中参与磷脂酶 蛋白激酶 C (号转导途径的是高亲和度受体，而参与腺苷酸环化酶 (号转导途径的是低亲和度受体 。 a+换，是 白激酶 刺激新的葡萄糖生成和钙三元醇的合成、抑制 K+目前尚未找到其作用的靶蛋白。另外， 介导的双重作用 (增加上皮电位差和打开细胞表面的离子通道 )刺激对二价阳离子的重吸收；而 括顶膜钙通道嵌入膜中、基侧氯通道打开引起细胞超极化以及调节 种信号转导途径都参与该过程，但其靶分子尚未确证 32。 一般认为 端，但是其 端的另一些生物活性可能是必需的。另有研究表明， 9别是 69和 84位的氨基酸，对 端和成骨细胞的特异性结合起到很重要的作用 33。 端，其 1留了 7 受体结合和生物 活性所需结构为 端的两个 端 15端的高亲和力作用 (这对受体的结合起决定性作用 )以及 端 1这与受体的激活密切相关 )，而 159位的氨基酸残基可影响 端与受体近膜区的结合能力 34 。 26、 27位的 参与受体结合，对活性不重要，因此分别对其进行生物素化 (和生物素结合 )，不影响活性；但同时 生物素化后，活性丢失，可能是因为等电点、疏水性和空间结构均发生了改变 35。20位 它被编码氨基酸取代，则肽的腺苷酸环化酶 (活作用失去；而当它被非编码氨基酸取代后，肽的 0。特异的 水侧链、 0位 37。另外， 15位 3位 使肽以适当的空间构象与受体结合 31。 状旁腺素受体 在 胞上目前发现三种甲状旁腺激素受体，其中可与 可通过 经 和 高细胞内 浓度，从而发挥作用。 目前研究较多的 1% 的同源性，能选择性结合 不能结合 31，这主要与相关蛋白的 5位 36。目前，对 对 个跨膜螺旋区和一个由 150个氨基酸组成的巨大的 外区含 6个保守的 有一些保守氨基酸分散于 膜螺旋和连接跨膜螺旋的环中 31。 端 端发生结合，称为 端 为 中 蛋白的活化相关 38。 降钙素受体的特点及分布 体内钙代谢虽然受多种激素的影响，但是调节细胞外液中钙离子浓度的两种 8 主要激素是 钙素是由甲状腺滤泡旁细胞分泌的一种肽类激素，可以降低血钙水平 39。降钙素与 其作用正好相反。从表面看，这两种激素起拮抗作用，但实质上是相辅相成的，也正是这两种激素的共同作用，维持着血钙 水平的相对恒定。调节降钙素分泌的主要生理因素也是血浆 度。当血浆 度高于 9毫克 /100毫升水平时，降钙素的分泌随血钙浓度增加而增加。当血钙浓度降至 9毫克 /100毫升水平以下时，血中降钙素水平不可测出 40。可见，在血钙的生理浓度范围内，血钙水平同时受到 而使调节更为精细 41。 蛋白耦联的细胞膜受体超家族，这类受体的共同特点是氨基酸的组成相似，有 7个跨膜结构，受体 中 8个半胱氨酸可能对维持受体的空 间构象有关 42。 胞膜，分子量为 85000氨基酸序列形成 7个跨膜区及连接这些跨膜区的 4个细胞外功能区（ 4个细胞内功能区（ 其氨基端位于细胞外，羧基端位于细胞内，已经证明氨基端功能区和 3、第 6跨膜区是受体激活的关键部位 41。人 号和第 9号染色体。 抑制 K+波状缘的伸展活动受限，导致 外还可抑制碳酸酐酶，减少酸的 分泌； 而增强 发现 逃逸 ”现象后，人们曾把这一现象归咎于继发性甲旁抗和 42。但后来的研究发现， 体外培养的 逃逸 ”现象，因而推测蛋白激酶 体的磷酸化可能降低它与 降低 内所有调节 要是全身性的激素调节，如对体内钙平衡的激素，包括甲状旁腺素、活性 维生素激素等的调节 43。它们与 们主要是通过影响 T，因此对 甲状旁腺素受体单抗 在 中可与 可通过 经 和 高细胞内 浓度，从而发挥作用。 9 抗甲状旁腺素受体的抗体是 性是由 要通过以下途径来调控甲状腺滤泡旁细胞的生理反应 ： l）腺苷酸环化酶 (径 ： 体 G 蛋白 调控基因表达，该途径主要调节一些蛋白的表达及转录，进而调控甲状腺激素的分泌和甲状旁腺细胞的增殖。 2）三磷酸肌醇 (径 ： 体 G 蛋白 磷脂酶 C磷脂酰肌醇二磷酸 ( 二酰基甘油（ +即此时细胞内产生两个第二信使， 过与内质网的 道结合，使 放入细胞质内，升高的度刺激 释放，从而促进甲状腺激素的合成。 体与甲状腺髓样癌细胞株 状腺髓样癌细胞株的研究进展 T 细胞株的建立 及特征 甲状腺髓样癌细胞株是 1981 年由 建立，其来自一位 77 岁白人女性的穿刺活检标本，取自甲状腺髓样癌组织，通过单细胞分离培养的方法，传 代培养 24，由单细胞增殖形成的细胞群，也叫甲状腺导管癌细胞株（ 胞株）。 胞可持续产生高水平的降钙素和癌胚抗原 （ 细胞形状大多为梭形，少数为不规则形。此细胞培养于含 15%胎牛血清的 养基中，于 37 养箱中培养。 胞株是高度分化的 胞株中的一种，代表了少数几个人类上皮细胞中能分泌多肽激素的一类细胞，这些细胞超微结构的特征包括成熟的糙面内质网、显著的高尔基体和一些数量可观的分泌颗粒。通过免疫组织化学已证实 了在 胞中有许多的激素，降钙素（ 降钙素基因相关肽（ 它们是相同基因的产物，但不同的是在 因转录时的 选择性剪切中 40。 胞不但分泌一些激素：如 神经降压素 、 脑啡肽 、 泌素释放肽 (、 5且也可产生嗜铬粒蛋白家族的功能蛋白，如突触小泡蛋白、 结合蛋白和酪氨酸羟化酶等 45。 胞株与构建的其它的甲状腺髓样癌细胞株相比，是目前为止最可信赖的人类滤泡旁细胞的模型系统。 1932 年， 一次提出了甲状腺滤泡旁细胞 ，命名为哺乳动物甲状腺特定地内分泌非滤泡细胞 46。 1967 年 过免疫荧光法成功地证实了在滤泡旁细胞中存在着降钙素，促进了对甲状腺滤泡旁细胞的研究。同时也提出它们是由甲状腺滤泡旁细胞特异性分泌的，因为它们起源于鳃后体， 10 为它们应该被叫做 C 细胞。因此， C 细胞和滤泡旁细胞被用来描述相同类型的，能分泌降钙素的甲状腺细胞。目前在文献中这两种名称通用。甲状腺髓样癌（ 源于滤泡旁细胞，是由滤泡旁 成的。 1959 年以前， 未分化型甲状腺癌没有区别开来。因为它只占了所有甲状腺癌的 10%，且只发生在年轻个体中。大约 25%的 多发性内分泌肿瘤综合症（ 关。研究发现 产生降钙素，认为其为 标志物。滤泡旁细胞产生的降钙素和其它的典型物质在早期的 断中是很有价值的，尤其是在五肽促胃酸激素刺激后筛查潜在的 族成员中。一些滤泡旁细胞非典型的物质如 神经降压素 、脑啡肽 、 5前已建成了起源于 不同的细胞株。 1974 年， 第一次描述了 保持了原始肿瘤的一些形态学和功能特征 46。另一个起源于鼠 细胞株是 44胞株，它是在 1987 年由 描述的，此细胞可合成和分泌神经降压素，降钙素，胃泌素释放肽。 1983 年， 将鼠 胞株成功地用于滤泡旁细胞的模式系统。此细胞表达降钙素，降钙素基因相关肽和缩胆囊肽。 起源于人甲状腺髓样癌的 胞株是目前的最稳定的细胞株。 胞与正常的甲状腺滤泡细胞相比，表达较低量的分泌颗粒。虽然在人类和大多数哺乳动物包括 小鼠中，发现 胞可以产生一些激素和功能蛋白标志物，但第一次免疫组化证明的一些激素为仅为 5 余的激素的 通过细胞杂交化学法检测到的，间接的证实了其的存在 47。通过放射免疫法测定培养基中的激素，或通过免疫细胞化学法研究培养的 胞，已证实在细胞中存在的蛋白与分泌颗粒有关。这些蛋白包括嗜咯粒蛋白 A，突触小泡蛋白。一个非常重要的发现是在 胞中检测到了 经元特异性烯醇化酶）， 含量 随着 泌物而改变，内染色的强度与细胞内 量相反，与培养基中 水平有直接的关系。因此， 可能被用来估计 胞的功能特征。 1985 年 过免疫细胞化学法在研究髓样癌时明确了 细胞骨架蛋白的重要特征。 1995 年在酶参与的氨基酸生成 实验 中，在 胞中发现了胸腺肽缩化酶。在胞液 ，发现了钙结合蛋白和酪氨酸羟化酶。一些标志蛋白已经在胞液和细胞骨架中检测到，代表性的分别有 胞角蛋白。 胞株生物学特性的研究 胞分 泌物的调节机制是其生物学特性研究的热点。通过对 胞超微结构观察和细胞免疫化学法染色发现： 胞与正常的甲状腺滤泡旁细胞和大多数髓样癌细胞很相似，所以 用此细胞株来研究甲状腺髓样癌细胞的分泌和调 11 节功能以及用于临床研究较为合适。大多数研究 胞分泌功能的调节涉及到 过杂交细胞化学法和免疫超微研究证实 胞可以产生两种 两种激素（ 决定是产生是 由 录为 的选择性剪切决定的。目前选择 性剪切的机制还没有完全澄清，此过程受包括激素在内的若干因素的影响。在甲状腺 C 细胞中， 主导地位，而 神经组织中大量存在。然而，剪切决定不是绝对的，正常的甲状腺 C 细胞除了可产生还可产生少量的 分泌的 培养的 胞的生长时期有关，分泌的最高期是在 胞生长的稳定期，最低是在指数期 48,49。这些在培养的细胞中的变化有可能与 人的行为一致。通过细胞质 T 与 比率随着 胞的增殖而变化。在 初期培养时， CT 水平很高， 水平相对较低，在早期的对数生长期， 水平成倍的增长，而 CT 水平变化很轻微，随着细胞接近融合，CT 水平都增长，随后， 水平在融合后大体上降低，而 CT 水平保持上升。通过放线菌素 D 阻止最初的转录表明，这些与增长有关的 率的可逆改变不是因为定性的变化 50。研究表明 胞可逆的改变 择性剪切的模式是由于体外的生长条件， 所以在 胞快速增长时 CT 平低而平高 51。 1987 年 报道 1， 25减少 胞中 因的表达。这一发现于 1988 年由 小鼠的实验中证实 46。 1991 年， 过免疫细胞化学法在 胞的细胞核和细胞液中证实了 1， 25体的存在。他们发现当将细胞培养于生理浓度或高 1， 25度时受体的水平增加。相似地，相同剂量的 1， 25制分泌，指出在 1， 25间存在着反馈调节。 由此推断 1， 25用于 胞的调节机制为：钙离子修饰 放，是以快速的方式通过滤泡旁细胞而没有先影响 合成，因而在分泌过程中是直接的影响 46。 胞是研究甲状腺髓样癌最有代表性的细胞。在先前的研究中已证实生长激素抑制素独特地结合在 胞的表面，这表明此激素的受体存在于 胞上。利用特殊的受体激动剂和抑制剂已经证实在 胞表面至少存在着两种类型的生长激素抑制素的受体。已有证实奥曲肽是一种生长激素抑制素的类似物，可抑制 胞的增殖，减少 细胞中的数量，促进细胞的凋亡与坏死 52。另有研究表明，奥曲肽也影响 胞 因的表达和选择性 12 剪切，提高了 产量。此影响有可能是因为 胞携带着生长激素抑制素受体，可自己产生生长激素抑制素，而生长激素抑制素以自分泌的方式不但控制着细胞的增殖也控制着其自身的表达 53。也有人认为 胞是良性 为它们有相同的生物学性能，其等同于体内正常的 C 细胞 54。胃泌素不仅可以诱导 放 可促进 胞中 因的转录，伴随地嗜铬粒 蛋白 A 表达被促胃泌素激活 55，表明 胞对研究促胃泌素和 分泌，基因活性和增殖效应是一个新的靶点。 T 细胞株的研究展望 甲状腺髓样癌的发病率为 8%但死亡率远高于 10%。目前手术切除是唯一可选择的根治方式，通过体外培养 胞而模拟 胞体内的生存环境，给于一些药物干预，通过生物学方法测定细胞的生长状况，如增殖 、 凋亡 、坏死等，来预测药物对 作用，为药物开发提供理论基础。 2011 年在 研究了三种 酶在 26 个 者组织中的表达情况并且分析了 酶的抑制剂 胞的生长及肿瘤发生学的影响 56。此研究最后得出的结论是 以抑制 胞的生长及其的肿瘤发生学，在 治疗方面有潜力。 一个很重要的特征是氨酸激酶原癌的转变， 皮生长因子受体（ 血管内皮生长因子受体激酶的 争性抑制剂 57。 研究了人甲状腺髓样癌细胞株 作用机制， 表明 胞的增殖 58。通过 扰技术敲除单个受体表明 赖于殖，在给 胞给于 理的情况下，再给于 制剂使细胞增殖。这表明在 胞中， 靶向治疗药物 一个关键点。对 胞株基因研究的结果对人甲状腺髓样癌的治疗有重大意义，了解不同原癌基因在人类恶性肿瘤中扮演的重要角色，为 基 因的治疗提供视角。最近 胞被用 来研究 癌基因的下调表 达， 癌基因在人类肿瘤中大量的表达。 胞株是用来研究 位基因突变的生物活性和生物化学性能的合适模型，随着（ 2导的 胞分化可导致 着对 胞结构和功能的研究继续，有越来越多的材料可用于支持这个理论：研究人类滤泡旁细胞这些独特的细胞株仍是最可信赖的模型系统。 体对 胞株的作用机制 促甲状腺激素（ 是腺垂体分泌的促进甲状腺生长的激素，主要作用于甲状腺。 甲状腺滤泡细胞 13 的特异 受体结合促进甲状腺激素的释放，促进 合成 59。 方面受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素（ 促进性影响，另一方面又受到甲状腺分泌的 馈性的抑制性影响。 因位于染色体 14度为 6060包括 10 个外显子和 9 个内含子，第 1显子编码 N 端链的膜外区蛋白，第 10 外显子编码跨膜区和膜内区蛋白 62,63。长 2470码 764 个氨基酸，分子量为 85糖链后为 100白属 G 蛋白偶联受体超家族成员，为一大分子糖蛋白。 甲状腺癌的内分泌治疗是基于反馈抑制促甲状腺激素的分泌。甲状腺髓样癌起源于甲状腺滤泡旁 C 细胞，不受 影响，因此传统的促甲状腺激素抑制疗法对 者无效。甲状腺髓样癌分泌降钙素，而患者的血钙浓度在正常范围内，其主要原因与甲状旁腺素的调节有关，是否可以推测甲状旁腺素在甲状腺髓样癌中起调节作用。已有研究证实 以抑制某些细胞株的增殖，如骨和肾细胞，但对 胞是 否也有增殖作用目前还未报道。 体可与胞内的 合，从而使细胞内 含量增加，此实验中我们以甲状腺髓样癌细胞株（ 研究对象，模拟 内的生长状态，外源性的给予 体两种药物，检测细胞的生长状况，为基础研究提供一系列的证据。 验的目的意义 （ 1） 通过研究 体在 胞中的作用，推测其对甲状腺髓样癌病变的影响，初步分析甲状腺髓样癌的激素调控机制。 （ 2） 为甲状腺髓样癌治疗提供新的途径，并对临床药物的开发 和甲状腺髓样癌研究提供平台。 （ 3）目前国内外对此方面的报道比较少，因此，探讨 体对甲状腺髓样癌细胞调空机制有非常重要的价值和临床意义。 14 第二章 材料与方法 究对象 甲状腺髓样癌细胞株（ 胞株），此细胞购自中国科学院上海细胞库，来自一 位 77 岁白人女性的穿刺活检标本， 胞持续产生高水平的降钙素和 癌胚抗原 。在更换培养基后 24 小时和 72 小时在培养基中检测到的免疫活性的降血钙素浓度分别为 3900万细胞和 7700万细胞。 72 小时后 累浓 度超过 27万细胞。 要试剂及器材 主要试剂包括 养基（ 15%，美国 司） 、 胎牛血清（ 司） 、胰蛋白酶（ 1%） 、 、 青霉素（ 500U/、 链霉素（ 500U/、 谷氨酰胺（ ） 、 丙酮酸钠（ ） 、 、 、 细胞 凋亡 检测试剂盒（ 、 、一链 成试剂盒（上海生工 ） 、 步法 剂盒（ 。 主要设备包括 ，流式细胞仪（美国 倒置相差显微镜（ 艾科浦超纯水系统（ 超净工作台， 养箱，立式压力蒸汽灭菌器，低俗大容量多管离心机（ 液氮罐， 电脑电热恒水槽，恒温干燥箱，电热恒温培养箱均由国内公司生产。 表 1 测的引物序列 - 3 - 3 398 - 413 15 胞的培养 器的清洗及消毒 使用的培养器皿，要严格进行清洗，以去除所带有的灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性，降低各种有害物质对细胞的损害。先用自来水加洗衣粉浸泡过夜，浸泡后用软毛刷进行刷洗，刷洗干净后置于 烘箱烘干，然后浸入酸中过夜，酸液具有很强的腐蚀作用，操作过程中要戴防护用具。浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，至少冲洗 10 次，直至没有任何酸浸液残迹，然后依次用一蒸水，三蒸水漂洗 3 遍， 2 遍，要求干净透明。置于烘箱烘干，用牛皮纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、棉线绳等严格包装好，以防止消毒灭菌后再次遭受污染，固体一般在 126高压 30 分钟。液体 121高压 10 至 20 分钟，将针头插入胶塞使其透气。 对于塑料瓶盖或胶塞