基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器检测牛奶中黄曲霉毒素M1.doc

基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器检测牛奶中黄曲霉毒素M1 食品与发酵工业FOOD ANDFERMENTATION INDUSTRIESD0110.13995/j.ki.11-1802/ts.017926基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器检测牛奶中黄曲霉毒素M i郭婷，林淑凤，马良4，谭红霞，张宇昊(西南大学食品科学学院，重庆,00715)摘要根据荧光共振能量转移原理，利用磁性纳米材料的磁性分离技术及荧光猝灭能力，构建了基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器，用于高灵敏检测牛奶中黄曲霉毒素M1(a fk to xi nM1，A F M d。 标记羧基荧光素(c cr bo xy-f lu or e s in，F AM)的适配体通过静电作用吸附在F f；34磁性纳米颗粒表面，并与F f；34发生能量共振转移，导致荧光猝灭；当体系中存在A F M1时，适配体与A F M1特异性识别并形成折叠结构，适配体从F e34磁性纳米颗粒表面脱附，使得荧光信号恢复，据此可实现对F AM1的定量检测。 该研究对所制备的F C3O4磁性纳米颗粒进行表征，透射电镜结果表明，F C3O4磁性纳米颗粒粒径在1015n m。 在优化的实验条件下，该传感器的线性范围为0.050.70检测限为0.02p#L。 利用荧光传感器检测牛奶中A F M i的回收率为82.5%102.3%。 关键词核酸适配体；黄曲霉毒素M1F C3O4磁性纳米颗粒；荧光传感器目前，乳及乳制品受到黄曲霉毒素M1(aflatoxm M1，A FM1污染的现象越来越严重。 xx年国家质检总局抽检某批次纯牛奶A FM1超标140%;xx年广州工商局发现部A FM1含量；xx年国家食药监总局公布抽检的部品A FM1超标。 A FM1是哺乳类动物摄人被黄曲霉毒素Baflatoxin B1，A FB1)污染的饲料后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，通过细胞色素P-448调节作用，C-10被羟化而生成A FM1存在于动物分泌的乳汁和尿液中，以乳中最为常见1。 A FM1被世界卫生组织列为I类致癌物，具有强致癌性突变性。 中国、美国等国家规定乳及乳制品中A FM1最大限量为0.5g/kg2，欧盟规定生乳中A FM1的最大限量为0.05pg/k g，婴儿配方乳粉中为0.025|x/k/3。 目前A FM1检测方法主要有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,H PL C)49、免疫亲和层析法（immunoafflnity chromatography，I A C)10-12、酶联免疫吸附法（enzyme linkedimmune sorbentassay,E LI SA)13-14等。 其中色谱检测方法灵敏，稳定性强，但样品前处理复杂，不能满足第一作者博士，讲师（马良教授为通讯作者，E-mail:Zhyhml163?)。 基金项目重庆市技术创新与应用示范项目（cstC018jscx-mSyb084);中央高校基本科研业务费专项资金（SWU117005,XDJKxxB042)018-5-31，改回日期018-10-17目前食品安全快速检测的要求。 E LI SA法操作简便、用时短，但抗体的制备周期且稳定性差。 与其相比，适配体可体外合成，稳定性好，在食品安全检测领巨大的应用前景。 近年来，多的科研工作者构建基于适配体的传感器5-18。 Y A N G等9使用未修饰的金纳米粒子（A uN Ps)作为指示剂，实现对赭曲霉毒素（ochra-toX1n，O T A)的快速检测。 当工作液中没有O T A时，适配体吸附在A uN Ps表面，在盐溶液中保护A uN Ps，未发生聚，溶液为红色。 当加人O TA后，适配体与O TA结合从而构象变化形成G-四联体结构，而A uN Ps在在盐诱导下发生聚集导致颜色变化。 B ON EL等20开发一性电化学用来检测O TA。 对辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，H RP)的活性反应进行检测，根据活性变化检测O TA。 G UO等21利用P CR技术结合适配体实现了A FB1的痕量检测，检测限为25fg/m L。 荧光、快速等优点而被广泛的应用于检测22i。 随着技术的快速发展，多的（石墨烯、碳纳米管、二硫物等27-32)应用在荧光方面。 G UO等3开发一种基于单壁碳纳米管（single-walled carbonnanotubes，S WN Ts)的荧光传感器用于检测O TA。 利用荧光修饰适配体，S WN Ts对染料具有很强的;但当加人O TA时，其与适配体结合，使得适配体从S WN Ts表面释放下来，荧光恢复。 L V2182019Vol.45No.5(Total377)分析与检测等34在以上实验基础上利用D N A酶进行信号放大，进一步测的。 然而，在实际荧光检测过程中，工作液中混合及目标物等多种物质，纟I的存在增加本底值的干扰，测灵。 性纳米材料因其较大的比表面积、磁性效果等特性，受到多的科研工作者关注35_37。 目前，使用Fe34磁性纳米颗粒作为荧光猝灭剂的传感平台研究报道较少。 本研究以A FM i为目标物，F AM修饰的适配体为元件，利用磁性的性及性能，构建基于适配体性材料的荧光传感器。 检测机理如图1所示，F AM-适配体吸附在Fe34表面发生能量，造成F AM-适配体的荧光猝灭；当体系中加入A FM i时，F AM-适配体与A FM i结合，F AM-适配体从Fe34表面脱附，荧光恢复。 gQ一4Fe34磁性纳米颗粒FAM-适配体黄曲霉毒素图1传感器的传感机理Fig.1Illustration of sensor1材料与方法1.1仪器与试剂紫外分光光度计（U V-2450)，日本岛津公司；荧光分光光度计（F-2500)，日本日立公司；台式高速离心机，德国Eppendorf公司；透射电子显微镜（J EM-1200E X)，日本电子株式会社。 F AM-适配体（5:AC T GC TA GA GA TTTT CC AC AT-3)，生工生物工程（上海）有限公司；Tris，赛国生物科技；H Cl，重庆川东化工I公司；FeCl3?6H20,氨水、甲醇、NaCl、乙腈、二氯甲烷，成都市科龙化工有限公司；FeCl*40,天津市大茂化学试剂厂；A FM 1、A FB p展青（P AT)、脱腐菌烯醇（D0N)、烯（T-2)标准品，美国Si gm a公司；纯牛奶，购于本地超市，250m L;营养奶粉，购于本地超市，400g;脱脂牛奶，购于本地超市，1L。 11.2试验方法1.2.1Fe304磁性纳米颗粒的合成采用液相共沉淀法制备Fe34磁性纳米颗粒，将12.16g FeCl3?6H20与4.97g F eCl2?4H20溶解于200m L中，剧烈搅拌加入氨水，调节p H至9.0左右，于80C熟化30m in得到Fe304粒子黑色溶液，用体收用交替洗涤后冷冻干燥，得到干燥黑色固体。 1.2.2D N A浓度测定D N A表，用紫2光光度计测定D N A在260n m处的吸光度，依据朗伯比(乂=c)计算得D NA的，配置成100n ml/L(TriS-HCl pH8.0)的溶液，于-20C备用。 1.2.3荧光传感器对A FM i的检测D NA备用溶液解冻后，水浴90C处理10m in，逐渐冷却至室温备用。 将Fe304溶液加入工作液(100nmol/L DNA溶液）中，再将一定浓度的F AM1加入工作液中作用20m in，利用磁铁分离。 取清液测荧光光谱（激发波长40n m)。 1.2.4实际样品中A FM i的检测向样品中加入一定量的A FM i，分别配成质量浓度为0. 25、0. 50、0.75叫/二的阳性样本。 （1)液体样品取5m L液态样品（纟脂)置于、管中，加入1m L甲醇和0.5g Na Cl后旋涡振荡混勻30s，在37C下超声5m in，上清液过0.22m有机微一定体积微萃取工作液；（2)固体样品称取1g固体样品（奶粉）置于管中，加入5m L水，旋涡混勻后，加入10m L甲醇和0.5g Na Cl并旋涡振荡混勻30s，在37C下超声5m in，离心后取上清液过0.2有机微孔滤膜得一定体积微萃取工作液。 将1m L微萃取工作液、200L分散剂乙腈和60L萃取剂二氯甲烷加管中，旋涡混勻勻的乳，静置1m in，下层有机相C H2Cl230k L于试管中，37C水浴氮吹。 将干燥物溶解于Tris-HCl l中品溶液。 然后按照构建的荧光测。 另外，根据国家标准采用液相色谱法进行方法对照实验。 2结果与讨论2.1Fe304磁性纳米颗粒的制备及表征采用液相共沉淀法制Fe304磁性纳米颗粒的反应原理如下F e2+2F e3+80H-=Fe304+4H20Fe2+与Fe3+在碱性条件下高温处理，合成黑色Fe304磁性纳米颗粒。 利用透射电子显微镜对其进2019年第45卷第5期（总第377期)219a-FAM-适配体；b-FAM-适配体;c-FAM-适配体+Fe304+AFM!;d-FAM-适配体+Fe304;e-AFM1图3不同条件下荧光光谱Fig.3Fluorescence spectraunder differentconditions2202019Vol.45No.5(Total377)因此，可以通过检测荧光信号强弱与体系中A FM i的浓度的关系，实现A FM i的定量检测。 2.3检测条件优化2.3.1Fe304浓度Fe34与F AM-适配体浓度比例在很大程度上影响会荧光的，因此考察二者的比显得十分重要。 如图4所示，含有100nrnol/L的F AM-适配体的缓冲溶液中，荧光强度随Fe34浓度的增加而急剧，当Fe34质量到达0.35m g/m L时，荧光于，当Fe34质量浓度继续增加时，对F AM-适配体荧光的影响，且过量的Fe34会降低传感器的灵敏度。 因此，选用0.5m/m L作为在后续实验中Fe34浓度。 不同质量浓度Fe34下FAM-适配体的荧光光谱（a-0. 1、b-0. 2、c-0. 3、d-0. 35、e-0. 4、f-0. 45、/-0? 5、h-0. 6、i-0.8mg/mL)图4不同质量浓度Fe34对体系荧光强度的影响Fig.4Kfect ofdifferent concentrationsof Fe304on thefluorescence2.3.2荧光恢复时间实验中添加A FM i后需要孵育一段时间才能引起荧光信号恢复，本实验研究了孵育时间0?80m in的荧光恢复情况。 如图5所示，随着F AM-适配体和A FM i孵育时间的，荧光力口，20m in后趋于。 研究选择20m in最佳荧光恢复时间。 插图不同孵育时间对应的FAM-适配体（100nmol/L)的荧光光谱（a- 80、b- 60、c- 50、d- 40、e- 30、f- 20、/- 15、h- 10、i- 5、j-0min)图5不同孵育时间对荧光恢复的影响Fig.5Mfect ofincubation timeon fluorescenceintensity行表征，具体表征结果如图2-A所示。 结果显示该方法制备的Fe34粒径约为8?15nm。 图2-B显示Fe34的磁滞回归线，说明该Fe34具有良好的磁分离能力，能够。 -20000-1000001000020000Magic field/Oe图2Fe34磁性纳米颗粒的透射电镜图（A)和磁滞回归线（B)Fig.2TEM images(A)and magization curves of Fe304(B)2.2检测原理本研究以A FM1为研究对象，构建荧光传感器。 F AM修饰在适配体的一端，其荧光光谱图如图3曲线a。 加入Fe304溶液后，F AM-适配体通过静电相互作用吸附在Fe304表面，Fe304与F AM-适配体发生荧光能量，荧光信号，如图3曲线d所示；当体系中加入A FM1时，F AM-适配体与A FM1形一定结构，F AM-适配体从Fe304表面脱附，荧光信号恢复，如图3中曲线c所。 F00D ANDFERMENTATI0N INDUSTRIES食品与发酵工业分析与检测2.4荧光传感器的构建在上述优化实验条件下，以A FM i为目标构建荧光。 在荧光中，加入不同A FM t2液。 研究发现，在一，随着A FM i质量浓度的增大，A FM i与更多的F AM-适配体结合，脱离Fe34，荧光强度逐渐恢复，如图6所示。 然而，当A FM i的量到一定值时，荧光强度不再明显增加，达到平衡。 荧光与A FM i质量在0.05?0.70叫/L范围内呈线性关系，检出限为0.02p g/L。 AFM i质量浓度&-0. 05、-0. 1、-0. 2、1-0. 3、-0. 4、-0. 5、/-0. 6、11-0. 7、i-0. 8、j-0. 9、k-1.0叫/L图6不同浓度A FM i对所构建传感器荧光响应变化（A)和荧光与A FM i浓度的线性关系（B)Fig.6Fluorescence spectrumofsensorwith differentcon centrationsof A FM1(A)and relationshipbetween Fand concentrationsof A FM1(B)2.5荧光传感器选择性为了研究荧光传感器的选择性，本研究以A FB i、0TA、D0N、P AT、T-2为对象考察该传感器的特异性。 结果如图7所示，当加入0.5pg/L A FM i时，荧光强度显著增加。 加入1pg/L对照毒素时荧光强度没明。 结果表明本研究所构建的器对A FM i有较好的特异性。 图7方法选择性Fi/.7Selectively ofsensin/system AFMi质量浓度为0.5p/L，其他对照毒素质量浓度均为10p/L2.6实际样品测定为了考察实际测定效果，我们以纯牛奶、脱脂作为实际阴性样品，研究加标回收情况，并用液相色谱法进行对照实验。 结表1所示，利用传感器检测的加标回收率在82.5%?102.3%的，这说明该荧光用于真实复杂样品中A FM i的测定。 3结论本研究构建一种基于适配体和磁性纳米材料的荧光，可用于、性检测A FMi。 在最优条件下,的线性0.05?0.70p/L，检测限为0.02p/L。 且在实际样品检测中同表1实际样品加标回收率U=3)Table1Real samplespike recovery(w=3)纯牛奶脱脂牛奶奶粉回收率AFM1添加质量浓度/(p/?L-1)AFM1添加质量浓度/(p/?L-1)AFM1添加质量浓度/(p/?L-1)0.250.500.750.250.500.750250.500.75回收率/%(传感器）99.082.587.583.294497687694.7102.3回收相色谱）87.485.491.085.9850953849855947样表现出较好的效果，说明本检测方法在食品安全检测中的实用性。 为发、选性的食品安全生物的途径。 参考文献a basisfor publichealth decisionsJ.Muta/enesis,xx,17 (6)71.2中华人民共和国卫生部.G B2761xx食品中真菌毒素限量S.北京中国标准出版社，xx.3MISSION REGULATT0N(E C)NO165/xx.1WILD CP,TURNER PC.The toxicolo/y of aflatoxins as4TAHERIMASLAK Z,AMOLI-DIVA M,ALL AH Y A RY M,et al.Ma/ically assistedsolid phase extraction usin/2019年第45卷第5期（总第377期)221食品与发酵工业FOOD ANDFERMENTATION INDUSTRIESFe304nanoparticles binedwith enhancedspectrofluorim-etric detectionfor aflatoxin Ml determinationin milksam plesJ.Analytica ChimicaActa,xx,84263-69.5M AO Jianfei,LEI Shaorong,LIU Yunhua,et al.Quantifi cationof aflatoxin Ml inraw milkby acore-shell columnon aconventional HPLCwith 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