【毕业学位论文】（Word原稿）再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究

兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 再造结肠袋内填充固化脲酶对 大鼠 血尿素氮的影响 前 言 肾脏疾病的科学研究已有一百多年的历史，虽然对急性肾衰竭的治疗已经建立了维持水 电解质平衡 和内环境稳定的治疗原则，但是死亡率却仍然居高不下。慢性肾衰竭除了血液透析治疗和肾脏移植，仍然束手无策。而我国每年新增加的慢性肾衰竭病人更逾 20 万人。血液透析不仅费用高昂，在治疗过程中也给患者带来很大的痛苦。虽然少数慢性肾衰竭患者在末期接受肾脏移植后，病情得到极大改善，但由于肾源缺乏、肾脏移植术后免疫排斥反应以及手术的高额费用，使得大多数患者无法承受，所以为肾衰竭病人的 治疗方案另寻出路具有很重要的意义。 在现代生物技术的快速发展之下，由于酶的选择性、专一性和高效性 而 被大规模的应用于工业、农业、食品行业和医药行业中。但由于酶的稳定性差，所以在使用环境中很快会失去活性。为了能够高效的利用酶的活性， 1971年在美国召开的国际酶工程会议上提出了 “固定化酶 ”（ 概念 1。固定化酶是指 “用物理或化学的手段定位在限定的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的酶 ”。 随着化工及生物工程行业的发展，酶在医药行业中的作用越来越大。酶吸附剂在口服治疗肾衰竭 上已经初现优势，可是由于口服吸附剂在体内存留的时间不够 长，无法重复利用酶吸附肾衰竭产生的毒素。于是寻求一个将酶吸附剂留置在体内的方法， 就 成为 我们解决这一难题的新 途径。 对于肾衰竭患者，既要保护其仅存的部分肾功能又要有效地排除体内的有毒物质，最终达到恢复患者的肾功能或维持其剩余部分肾功能 。为了 实现治疗目的，我们必须转换口服吸附剂的思路， 设 计 将其置于体内 的方法 ，形成体内吸附尿素的局域环境 ，以便延长吸附剂在体内滞留的时间，从而更好的发挥重复利用的作用 。 基于结肠的解剖结构和生理功能，在临床手术中已经成为很多器官的 替代材料。国外学者们在大量的结肠代替食管、膀胱和阴道的病人中进行调查和随访后发现，结肠代替这些器官后功能没有显著的差异，患者的生存率和生活质量都很高。 2 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 为此，我们设计了 用 大鼠右半结肠再造结肠袋， 并 将固化脲酶填充其中， 观察 这种方法对 急性 肾衰竭早期血尿素氮 是否有 影响 。 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 材料和方法 1. 材料 要药物、试验试剂和器 材 酶 (9002生化试剂，购自 格： 1g； 胶，生化试剂，购自北京普博欣生物科技有限公司，规格： 500g； 二醛（分析纯），乙醚、稀盐酸（ ）及酚酞：购自兰州大学第一医院药剂科； 霉素钠（生物药品 800000），葡萄糖粉，氯化钠注射液（ ，2%戊巴比妥钠：购自兰州大学第一医院药房； 0%甘油， 50油加 50馏水； 酸缓冲 液（ 购自福州迈新生物有限公司； 醛，二甲苯：上海试剂厂生产； 性福尔马林固定液，蒸馏水：兰州大学第一医院病理研究所自制； 细管：购自兰州大学第一医院检验科； 手术缝合丝线：购自甘肃省人民医院手术室； 号及 4手术缝合丝线：购自兰州大学第一医院手术室； 鼠灌肠器：兰州大学第一医院动物实验室 笼，大鼠饲料，大鼠固定器及大鼠手术台：由兰州大学第一医院药剂科动物验室提供； 碱滴定管：由兰 州大学第一医院药剂科提供； 他：镊子、持针器、手术缝针，组织剪、眼科剪、手术手套、 110射器、甲醇、酒精、中性树胶、多种规格吸头、染色缸、微量移液器、载玻片、盖玻片、胶带、固定针、玻璃棒、纱布、棉签、刀片、碘伏、塑料板、苦味酸等由兰州大学第一医院病理研究所提供； 毒无菌器械：由兰州大学第一医院供应室进行消毒。 要仪器设备 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 水机：德国 包埋机：德国 G 1140C； 自动式切片机：德国 光显微镜及显微照相系统：日本 子分析天平：上海天平仪器厂； 量加样器（ 200 司； 海恒科隔水式恒温箱 温电烤箱 :冰箱： 验动物 健康雄性成年清洁级 鼠 64 只，体重 20050g，由兰州大学实验动物中心提供。饲养环境温度 (203) ，分笼饲养，标准饲料喂养，适应 环境一周，术前自由进食及饮水。 2 方法 验动物的分组 每只实验动物取血后确定血尿素氮含量完全正常后，将大鼠完全随机分为六组，正常对照组（ A 组），共 3 只；假手术组（ B 组），共 7 只；单纯结肠造袋组（ C 组），共 7 只；单纯肾衰组（ D 组），共 8 只；肾衰结肠造袋组（ E 组），共 8 只；肾衰结肠造袋填充脲酶组（ F 组），共 8 只。 定化脲酶的制备 将 10酶置于 10明胶溶液（ 100g/L）中溶解，待搅匀后，将溶液涂在光滑的塑料板上 5，面积为 200温下干燥成膜后剥离。将剥离下来的明胶膜剪成 1小的 膜 块，浸泡在 1%的戊二醛水溶液中，在 4 冰箱中交联反应 15蒸馏水洗涤 6 次以去除明胶膜上未完全反应的戊二醛。得到的固定化脲酶置于 4 的冰箱中贮存，备用。 组大鼠手术步骤 （ 1） 所有手术动物于术前 24 小时开始禁食，并用 分别在早晚用灌肠器灌肠一次。 （ 2） 2%戊巴比妥钠按 00g 腹腔注射麻醉，麻醉满意后，将大鼠固 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 定在手术台上。用剪刀剪去腹部被毛。常规碘伏消毒腹部皮肤，铺洞巾，于腹正中部做直切口，切口长约 5开腹腔。 （ 3） B 组 ： 打开腹腔找到回盲部后，不进行任何处理，将肠管纳入腹腔后，用 1 号丝线逐层缝合，关闭腹腔。 （ 4） C 组 ： 打开腹腔，将右半结肠提出体外，找到回盲部，在右半结肠距回盲部 36，找一段长 约 离此段肠管并保护好肠系膜血管，然后离断此段肠管的两端后，并将两端分别以 7半结肠的两个断端以 7手术缝线行间断黏膜外单层吻合。吻合完毕确认无出血后，关闭腹腔。 （ 5） E 组 ： 手术方法同 C 组。 （ 6） F 组 ： 打开腹腔后，用上述相同的方法离断肠管 ，将游离肠管一端以7手术缝线行荷包缝合 ，将修剪成合适大小的固定化脲酶 膜块 由另一个断端轻轻放入肠管内，然后将断端荷包缝合。右半结肠的两个断端以 7合完毕确认无出血后，关 闭腹腔。 （ 7） 所有大鼠均在术前半小时、术后半小时内及术后三天按 10 万 肉注射青霉素， A 组和 D 组注射同等剂量的生理盐水，术后切口均以碘伏消毒后涂以苦味酸，防止大鼠咬断手术缝线。 （ 8） 术后三天内对大鼠禁食，不禁饮水，饮水为葡萄糖粉配制的 10%葡萄糖水 7。三天后给予流质饮食。术 后一周内，每天按时对手术切口进行两次消毒。密切观察大鼠的精神状况和恢复情况。 衰竭模型的制备 大鼠术后第五天时，将各组所有大鼠禁水 12 小时 后 ， 在 每只 D、 E、 F 组 大鼠两侧后肢肌肉注射 50%甘油（ 10mL/。 在每只 A、 B、 C 组大鼠 相同部位注射同样剂量的生理盐水之后， 所有大鼠 自由进食和饮水 8, 9。 验动物检测指标 般状态：每天上、下午各观察一次术区情况、饮水量、摄食量、精神状态、毛发状况。 液标本 所有大鼠均在注射甘油和生理盐水后，分别在 24h、 48h 和 72h 用乙醚麻 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 醉，用消毒后的毛细管于内眦采血各 1放入无菌肝素抗凝管 内 于 4 保存。最后一批血样采集完毕后立即处死大鼠。 采 得的无菌抗凝血样本，以10000 转 /分离心 10，用无菌移液枪头吸取上清液，送 兰州大学第一医院检验 科检测 血尿素氮 。 肠造袋填充物中氨含量 处死大鼠后，迅速解剖，将结肠造袋内填充物取出，用 1馏水稀释、摇匀后，用移液管移入试管，以酚酞作为指示剂，滴加 酞后 ，溶液呈粉红色，用浓度为 的稀盐酸进行滴定至刚刚呈现出无色为终点，并根据稀盐酸的量计算出氨的含量。 3 组织标本的制备和检测 织的处理 动物处死后，迅速解剖，提取肾脏标本和填充固定化脲酶结肠造袋的标本，将肾脏标本沿外缘向肾门方向切开、肠管修剪为长度 2分别置于 10%甲醛溶液中固定 ，经取材、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，常规切片（ 4m），脱蜡至水， 色，脱水、透明、封片。 4 肾组织及肠管的形态学 观察 解剖动物后 ，检查 肾脏 及 肠管的大体变化 。 色切片 由同一病理医师在学显微镜下观察其组织学改变 ，并用 照 。 5 统计学处理方法 采用 计软件分析及处理数据，结果采用均数 标准差（ X S ）表示，组间及组内比较采用 t 检验， 24 h 血尿素氮含量与肾衰结肠造袋组相比 明显降低，组间比较有着显著差异（ 48 h 后血尿素氮的含量明显低于正常对照组、假手术组及单纯结肠造袋组（ 说明环境及手术因素对大鼠血尿素氮 含量影响 并 不大。 本 实验结果表明，肾衰结肠造袋填充脲酶的血尿素氮与单纯肾衰组和肾衰结肠造袋组相比，从 24 h 内 开始下降， 48 h 时降至最低，说明所填充的固化脲酶 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 在 48 h 内 对血尿素氮 吸附速率最高， 生物活性最强， 48 h 过后至 72 h 内 肾衰结肠造袋填充脲酶组 的血尿素氮有所升高，但仍低于单纯肾衰组及 肾衰结肠造袋组 ， 说明固化脲酶置于肠道内可以 直接与尿素接触并发挥作用。 72 h 内 肾衰结 肠造袋填充脲酶组 的血尿素氮有所升高，接近正常对照组，但仍然远远低于单纯肾衰组及 肾衰结肠造袋组 组（ ，机体出现全身多脏器功能衰竭，如胃肠道、心血管、造血系统等严重失衡。常因高血钾症、脑水肿、心肺功能衰竭而死亡 。 7病程具有不可逆的特点，任何病因引起的慢性肾功能 衰竭最终都会发展成为终末期肾病。 临床上的常见多发病，病情重，预后差，死亡率高。目前除了透析治疗、肾移植外尚无理想的治疗方法。 1、 透析治疗 由于肾衰竭导致大量的代谢废物无法排泄，于是在体内蓄积形成毒素。按其生化特性和透析中的性状可分为以下三大类 8： (1)小分子毒性物质，分子量 300，其又可分为 水溶性、未与蛋白质结合的化台物； 与蛋白质结合的化合物； (2)较大的中分子，主要是多肽，分子量在 300 到 5000 之间； (3)大分子毒性物质，分子量大于 5000，主要 有生长激素、溶菌酶等。 近年来血液透析在急性肾衰竭及慢性肾衰竭的治疗中都扮演了非常重要的角色。血液透析对弥散性强的小分子物质如血肌酐和尿素氮清除能力强，其中尿素是体内含量最多的蛋白质代谢终末产物。尿素在体内蓄积会造成疲乏、呕吐、 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 头痛、嗜睡及皮肤瘙痒的中毒症状。尿素在肝脏形成，由肾脏排出。 低至正常的 40%后，血尿素氮就急剧升高。尿素参与氰化物的产生和蛋白质的氨甲酰化反应，所形成的化合物对多核粒细胞有很大的毒性作用，并造成多核粒细胞功能障碍及蛋白质合成障碍。同时能引起细胞死亡，物质代谢障碍，影响组织、器 官的功能。尽管透析治疗能够暂时替代肾脏的排泄功能，但却容易造成贫血、感染、心血管并发症、失衡综合征及酸碱平衡失调等问题，并发症很多 9。 结肠透析是近年来临床上对慢性肾衰竭应用较多的透析方法。结肠透析通过结肠透析装置向人体结肠内注入过滤水，进而清洁结肠 ,清除结肠内毒素，而且充分扩大了药物与结肠粘膜的接触面积，然后再注入吸附性药剂，使药液存留在结肠内一段时间，通过结肠黏膜吸附出体内各种毒素，并及时排出。最后再灌入治疗肾脏疾病的制剂，并予保留。在结肠中利用结肠黏膜吸收药物有效成分，起到对肾脏治疗作用，并可降低血肌酐和尿 素氮、尿酸等尿毒症毒素。有研究称结肠透析在临床中对慢性肾衰竭病人有明显的降低尿素氮和血肌酐的作用 10。 由于透析极大地提高了医疗质量 , 在延长肾衰竭患者生命的同时 , 逐渐产生了大量医学、伦理学和经济问题。随着医学模式的转变 , 临床医疗实践与研究不仅仅从生物学及临床的角度 ,更深入到患者的心理以及社会角色的范畴。肾衰竭患者这一特殊群体的健康相关生存质量 (已成为临床医生对肾衰患者采取治疗方式所得到的疗效判断指标。研究表明血透患者的生理 功能对于他们的生活质量非常重要 , 日常活动被限制 , 影响了他们与朋友、家人相聚的快乐 , 降低了他们对工作表现的满意度以及总的生活满意度 11。如果能利用患者其他健康的具有排泄功能的器官加以改造，形成一个能代替肾脏排泄代谢废物及毒素的场所，那么对于肾衰竭患者的治疗意义将是不可估量的。 口服吸附剂是近年来清除尿毒素的研究热点，是通过口服特异性吸附剂后，利用吸附剂在肠道中的移动过程吸收尿毒素，从而达到清除血液中的毒性物质的目的。口服吸附剂价格低廉，且使用方便，已被应用于肾衰竭的临床治疗当中。有实验证明口 服球形活性炭吸附剂对早期慢性肾衰竭大鼠肾脏功能衰竭能够降低血尿素氮及血肌酐 12 。由于口服吸附剂的方法弥补了透析治疗的缺点且能够有效的清除体内的有毒物质，同时也保留了肾脏的其他功能，近年来在材料科学和医学上得到了迅速的发展。 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 2 、肾衰竭治疗应用吸附剂 人 13在 1975 年发现将半透膜涂在活性炭上会增强它的生物活性，可将这种加工过的活性炭放于血液灌流装置中。但这种吸附剂有一种很大的缺点，活性炭的表面会沉积很多微粒，增加的患者血栓的风险。 国内有学者研究出调整沥青基球状活性炭的表面积、孔容积等基本参数后，其对血液中典型的中、小毒性分子吸附力得到了提高，可以作为人工肾的吸附剂。14 同样应用于肾衰竭治疗的吸附剂还有高分子型吸附剂。高分子型吸附剂分为离子交换树脂类、吸附树脂类、碳化树脂、高分子的过渡金属配合物、氧化 分子型吸附剂可以通过人为的设计其分子结构，控制其结构和性能，使它对小分子毒性代谢物的吸附具有更高的 选择性。 脲酶 是一种含 镍 的寡聚金属酶，微生物是其主要来源，大部分细菌和真菌都能产生脲酶 15。它被广泛应用于酶制剂吸附剂，其最适 有绝对 专一性 ， 能高效专一地分解尿素为氨和二氧化碳 16，但其游离酶如果单独使用，它分解尿素产生的 打破电解质的平衡。脲酶的游离酶非常不稳定，必须通过白蛋白、聚乙二醇等高分子物质对其进行微包裹后才能保持它的活性。 17曾报道过对肾衰患者使用微包裹后的脲酶作为人工肾建模，结果表明微包裹的脲酶能够有效地降低血液中尿素氮的含量。国内学者于九皋等人 18将包醛氧淀粉和脲酶制成了固化脲酶制剂，提高了二者对尿素的吸附。另外，脲酶等酶制剂还被应用于血液灌流 19及透析液的再生装置中。 3 、酶吸附剂的固化技术 在现代生物技术的快速发展之下，由于酶的选择性、专一性和高效性，它被大规模的应用于工业、农业、食品行业和医药行业中。但由于酶的稳定性差，所以在使用环境中很快会失去活性。为了能够高效的利用酶的活性， 1971年在美国召开的国际酶工程会议上提出了 “固定化酶 ”（ 概念 20。固定化酶是指 “用物理或化学的手段定位在限定的空间区域，并使其保持催 化活性，可重复利用的酶 ”。 酶的固定化方法主要有以下几种方法： 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 （ 1）载体结合法：是将酶与不溶于水的有机或无机载体结合。载体结合法又分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。物理吸附法和离子结合法不轻易改变酶的高级结构，酶的活性中心也不易破坏，可是由于酶和载体的作用力小，酶易脱落。共价结合法操作复杂，反应条件剧烈，会改变酶的高级结构，破坏部分活性中心，但由于酶和载体的作用力强，使其不易脱落。 （ 2） 交联法 ： 是利用交联剂使酶分子间及酶分子和载体分子之间发生交联而形成三向网状结构的固化方法。常用的交联剂有戊二醛 和偶氮联苯等。但此法的反应条件剧烈，酶分子之间会互相交联，使酶的活性中心结构改变，酶的活性回收率不高。但与其他两种固定方法配合，使酶与载体紧密结合。 （ 3） 包埋法：分为网格型和微囊型。网格型是将酶置于高分子化合物的网格之中，最常采用的载体有聚乙烯醇、淀粉、明胶等高分子化合物。微囊型是将酶包裹在高分子半透膜中形成球状体颗粒，其直径在几微米到几百微米不等。虽然微囊型固化酶的体积小利于其扩散，但由于反应条件苛刻，使得制备成本很高。由于包埋法是利用高分子化合物的网架进行扩散，所以只有小分子底物和产物可通过，对大分 子物质会产生扩散阻力。 4、明胶固定化酶 明胶是动物的结缔组织或表皮组织的胶原部分水解出来的蛋白质。它遇水形成可逆性凝胶，具有良好的亲和性、分散稳定性、持水性等物理及化学性质。由于造价低廉和良好的物化特点，使得明胶在食品、工业和药用上都得到了广泛的使用。 明胶在冷水中溶胀（是指将干燥的明胶置于适量的冷水中时，首先看到它们的外层慢慢地胀大起来，随着时间的推延，胀大现象逐步向内层发展。）形成凝胶，溶胀后的明胶加温至 35 以上就会形成完全溶解于水的溶胶 21。明胶溶液具有很高的粘度，而在室温下，明胶溶液的存在状态为凝胶，易形成网状结构，粘度增大。在 1980 年， M 等人 22就发现了明胶的热可逆性可以用于酶的固定化并大大提高固化后的酶的稳定性。固定化酶的稳定性、重复利用性及 用范围都有很大的提高。 兰州大学硕士学位论文 再造结肠袋内填充固化脲酶对大鼠血尿素氮影响的实验研究 等人 23在实验中用甲醛、戊二醛和乙酸铬对用明胶固化 的脲酶进行交联后，对比了酶的活性，发现戊二醛是最适合的交联剂。利用戊二醛交联过的固定化脲酶能在常温常压下最大程度的保留酶的活性。 在临床上，张瑞明等人 24已经将口服吸附剂清除血液中的有害物质作为治疗肾功能衰竭的重要方法，这对于能够自排尿的 者，既可以保护剩余的肾功能也可以有效的清楚体内的有毒物质。包埋法固化脲酶的特性为其下一步的临床应用打下了基础。慢性肾衰的口服治疗药物，血液透析装置及血液灌流器的制作都充分利用固化脲酶的优越特性。 结语 由于脲酶能够特异性的分解尿素，利用这一特点， 采用合适的固化方法将其活性保存后，使脲酶成为慢性肾衰竭治疗的新途径，可以预计，随着固化方法的优化，脲酶作为肾衰竭患者血液净化的有效手段将大放异彩。 参考文献 1. 王桂花 , 急性肾衰竭治疗 . 中外健康文摘 , 2010. 07(21). 2. 李军辉 , 汪年松 , 王锋 , 320 例急性肾功能衰竭患者的临床分析 . 中华肾脏病杂志 , 2008. 24(3): 4. 3. et of of of J 2005. 115(7): 17434. F. . of a