基于硅溶胶凝胶褐藻酸钠复合膜包埋酪氨酸酶的苯酚传感器研制[1].doc

基于硅溶胶凝胶褐藻酸钠复合膜包埋酪氨酸酶的苯酚传感器研制1 第35卷分析化学(FENX IHUAXUE)研究简报第2期xx?2月Chinese Journalof AnalyticalChem istry273276基于硅溶胶2凝胶/褐藻酸钠复合膜包埋酪氨酸酶的苯酚传感器研制雷存喜1231,2?国励俞汝勤11(湖南大学化学生物传感与计?学国家重点实验室,长沙410082)(湖南城市学院化学与环境工程系,益阳413000)摘要将天然聚合物褐藻酸钠添加到无机硅溶胶2凝胶膜,获得一种新型的无机/有机杂化膜。 用此杂化膜包埋酪氨酸酶,制备电化学苯酚传感器。 研究表明:硅溶胶2凝胶/褐藻酸钠复合膜能有效克服纯无机溶胶2凝胶膜的脆性;避免膜的裂开;提供生物酶所适宜的微环境;有效保持所固定酶的生物活性。 所制备的传感器测定苯酚的线性响应范围为3.493.1mol/L,其线性回归方程i(A)=0.0774C(mol/L)+0.1616,r=019980。 检出限为1.33mol/L。 关键词褐藻酸钠,无机/有机杂化膜,酪氨酸酶,电化学苯酚传感器1引言基于生物酶对特定底物响应而构建的电化学酶传感器,具有灵敏度高、选择性好、?于微型化和自动化等优点,具有广泛的应用前景。 在电化学生物传感器的研制中,如何将酶稳定、高活性地固定到基体电极表面形成传感器的敏感响应膜是关键。 在各种酶固定技术中,多数利用特定膜将酶直接包埋到13电极表面,这是因为膜包埋技术具有成膜材?广泛?得以及膜的多孔性使得酶底物分子?于通透等优点。 常用的膜包括电聚合膜和人工涂膜两大类。 基于膜包埋法固定酶仍然存在一些问题,由于粘性?够,形成的膜?于从电极表面脱?;膜的孔径大小?匀,使得生物分子容?从大孔内泄?;膜的生物相容性差,?能提供生物材?所适宜的微环境等。 因此,发展新的成膜材?和成膜方法,增强固定生物酶的稳定性和有效保持固定酶的生物活性,以延长传感器使用寿命,仍是电化学生物传感器研究的热点1990?,Braun等54。 首次报道了硅溶胶2凝胶膜包埋蛋白质的可能性。 此后,溶胶2凝胶膜在生物传感器中的应用得到了迅速的发展。 溶胶2凝胶技术利用在适当条件下,金属或半金属烷氧化合物水解和聚合,形成多孔的无机凝胶膜。 这种凝胶膜具有良好的化学稳定性、热稳定性,在水溶液或有机溶剂中几乎?溶胀。 特别是膜具有多孔性,因而酶底物分子或媒介分子?于穿透此膜而与包埋的酶作用。 虽然无机溶胶2凝胶膜具有以上优点,但也存在?开裂及容?从电极表面剥离脱?等缺陷。 为解决这些问题,很多研究工作致?于改进无机溶胶2凝胶膜的性能,其中主要的方法是通过添加天然的或人工合成6的有机聚合物到无机溶胶2凝胶膜中,形成无机/有机杂化膜。 常用于添加的有机聚合物有壳聚糖、聚苯烯磺酸纳、硅氧烷及聚乙烯吡啶/聚乙烯醇接枝共聚物杂化膜能显著改进纯硅凝胶无机膜的性能。 Nafion78910等。 研究表明:无机/有机本研究尝试用褐藻酸钠作为有机添加剂,研制一种硅凝胶无机/有机杂化膜,并用此杂化膜包埋酪氨酸酶,制备检测苯酚的生物传感器。 苯酚是一个重要的水污染物,监测其含?是环境保护的重要指标。 经典的测定手段主要有光谱和气相色谱方法。 然而,这些方法通常存在费时、灵敏度低、需要贵重仪器等?足。 因此,基于酪氨酸酶的电化学生物传感器具有构造简单、价格低廉和灵敏度较高等优点,11,12是一种有发展前途的苯酚测定方法。 褐藻酸钠是天然多糖类聚合物,分子中含有羟基和负电性的羧基,在Ca存在下,可以自发形成凝胶膜。 因此,将褐藻酸钠掺杂到硅溶胶中,其分子中的羟基可以与硅烷化试剂水解后的羟基缩合,形成掺杂褐藻酸钠的硅凝胶复合膜,增强膜的柔韧性,有效避免膜裂xx205221收稿;xx208228接受本文系湖南省自然科学基金资助项目(No.04JJ4007)3E2mail:leicunxi163.2+?1994-xxChina AcademicJournal ElectronicPublishing House.All rightsreserved.ki.274分析化学第35卷开;同时,增加膜的粘结性,维持被包埋酶的生物活性,延长传感器的使用寿命。 2实验部分2.1仪器与试剂PAR283恒电位/恒电流仪(EG&G PrincetonApplied Research,Princeton,NJ,美国);电化学测?采用三电极系统:酶修饰电极为工作电极,铂片作对电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。 实验操作条件与数据贮存通过PAR M270电化学软件控制。 酪氨酸酶(EC.,2578U/mg)、甲基三甲氧基硅烷(MTMOS)和褐藻酸钠(99%)(Sigma公司,美国);三羟甲基氨基甲烷(Tris)、苯酚等其它试剂均为分析纯试剂(长沙市化玻公司)。 配制溶液均用二次蒸馏水。 测定酚的支持电解质为含1.0mmol/L CaCl20.1mol/L Tris2HCl缓冲溶液(pH7.0,Tris)。 2.2M TMOS/褐藻酸钠溶胶及其复合膜包埋酶的传感器制备MTMOS/褐藻酸钠贮备溶胶制备方法如下:0.3mL甲醇+0.2mL MTMOS+0.2mL10g/L褐藻酸钠+0.2mL0.01mol/mL HCl在小称?瓶混合后,超声20min,得到均匀的溶胶。 溶胶贮备液应在酶电极制备前现配制。 玻碳电极(GCE,3mm,江苏电分析仪器厂)用作修饰酪氨酸酶的基体电极,GCE首先在W7 (05)#号砂纸上磨平,然后用粒度约0.05m湿润的Al2O3粉进?抛光处?,用水冲洗后,再分 3、别在11丙酮和水中各超声清洗5min后干燥备用。 在小称?瓶中,将2mg酪氨酸酶溶于0.1mL磷酸缓冲溶液(pH7.0),取5L酪氨酸酶溶液滴于GCE表面,并尽可能将溶液铺平,4干燥约2h后,再吸取鲜制备的5L MTMOS/褐藻酸钠贮备溶胶滴在酶修饰的GCE表面,再4干燥约2h,最后,将MTMOS/褐藻酸钠杂交膜包埋酪氨酸酶的玻碳电极插入0.1mol/L CaCl2溶液30min,使形成?加完整的凝胶网络,制备好的酪氨酸酶电极干态冷藏备用。 2.3实验方法循环伏安(CV)实验在空气饱和、静止的Tris中进?。 计时安培实验在空气饱和、搅拌的Tris中进?,待操作电压加上,背景电流达到稳定值后,迅速加入一定?的苯酚溶液到测?池中,相应的电流变化值作为测定响应信号。 电压均以SCE为参考标准,测?在室温条件下(25)进?。 3结果与讨论3.1硅凝胶/褐藻酸钠杂化膜包埋酪氨酸酶的传感器构造纯粹的无机溶胶2凝胶膜具有脆性,很容?开裂,导致被固定酶从电极表面泄?,影响传感器的使用寿命。 掺杂有机聚合物到无机溶胶2凝胶膜中,形成无机/有机杂化膜已被证明是避免其开裂的?之有效的方法。 褐藻酸钠是天然聚多糖类有机聚合物,在Ca存在下,可以形成稳定的凝胶膜。 褐藻13酸钠又是负电性聚合物,W ada等研究表明在固定酶系统中,负电荷聚合物的存在能有效避免酶的失活。 因此,实验采用褐藻酸钠来改进无机溶胶2凝胶膜的性能。 溶胶2凝胶膜制备条件拔性能具有较大影响,特别是硅烷化试剂与水的比例影响所形成膜的厚度及膜孔径的大小,如果硅烷化试剂/水比例过大,则形成的厚膜孔径很小,?利于底物或媒介分子的穿透;而该比例过小。 则形成的膜机械强度?够,容?破损。 本实验通过变化MTMOS与褐藻酸钠及稀HCl4-的体积比来形成?同的无机/有机杂化膜,用电活性物质(如Fe()6)在膜修饰电极上的CV?为来评价膜的性能。 结果表明:按2.2节所列比例形成的膜具有最优性能。 3.2苯酚在酪氨酸酶修饰电极上的循环伏安?为图1为酪氨酸酶修饰电极在空白或加入苯酚后的Tris溶液中的CV图。 在没有苯酚存在时(图1A),CV图观察?到氧化还原峰。 但当加入39.9mol/L苯酚后,CV图呈现明显的还原电流(图1B)。 当再加入39.9mol/L苯酚后,还原电流再增加(图1C)。 这一还原电流的产生源于在酪氨酸酶存在下,苯酚被溶解在Tris溶液中O2所氧化,首先形成邻苯二酚,邻苯二酚再在酪氨酸酶催化下,被氧化为邻苯醌,然后,邻苯醌在电极上迅速还原成邻苯二酚。 此过程可表示如下:?1994-xxChina AcademicJournal ElectronicPublishing House.All rightsreserved.ki.6102+第2期雷存喜等:基于硅溶胶2凝胶/褐藻酸钠复合膜包埋酪氨酸酶的苯酚传感器研制275苯酚还原电流随苯酚浓度的增加而增高,说明固定在硅凝胶/褐藻酸钠杂化膜内的酪氨酸酶维持良好的生物催化活性。 3.3苯酚酶传感器测定参数的优化影响基于酪氨酸酶的苯酚传感器测定响应大小的因素主要包括:支持电解质酸度、溶液中O2浓度和计时安培操作电压。 由于电解质中所溶解氧气有足够高的浓度,完全能够保14证催化过程所需的O2?。 无须额外补充2。 由于酶活性受溶液酸度影响很大,同时苯酚被酪氨酸酶催化氧化产生邻苯醌,其在电极上还原时,有质子参与。 因图1酪氨酸酶电极的循环伏安图此,基于酪氨酸酶传感器测定苯酚受到测定体系pH的影响。 Fig.1Cyclic voltammograms of the tyrosin2研究表明:用所制备的酪氨酸酶传感器计时安培测定苯酚时,ase electrode在pH7.0时,酶电极响应随pH升高而减小,这是因为酶活性逐渐下降,同时,溶液可提供的质子数明显减小;所以,酪氨酸酶电极最佳测定pH7.0。 考察苯酚传感器响应电流与计时安培操作电压关系。 响应电流值随着操作电压的减小而增加。 电压越低,电化学还原的驱动?越大,对苯醌越容?在电极上还原。 在-150mV后,再进一步降低操作电压,对电流响应值影响明显减小,而且增加O2在电极上还原的可能性,产生大的背景电流。 所以,选择-150mV用作计时安培工作电位。 3.4酪氨酸酶电极对苯酚的响应图2为在优化测定条件下,酪氨酸酶电极对连续加入13.3mol/L苯酚的反应。 由图2可见,随着苯酚的加入,还原电流迅速增加,达到95%稳定状态,电流所需时间93.图2酪氨酸酶电极对连续加入13.3mol/L苯酚的反应Fig.2Typical current2time responsecurveof thebiosensor uponsuessiveadditions of13.3mol/L phenolE=-150mV(vs.SCE),pH7.0,v=100mV/s.1mol/L后,传感器响应达到饱和,符合酶催化的Michaelis2Menten响应机?。 按照Lineweaver2Burk方程,稳定状态电流的倒数与相应底16app物浓度的倒数具有线性关系,可以利用来求算酶电极的Michaelis2Menten常数(K m)。 所制备的酪氨酸酶传感器的K m为0.078mmol/L,较小的K m值意味着固定在褐藻酸钠改性的溶胶2凝胶膜内的酪氨酸酶对苯酚的氧化具有高的生物催化活性。 用酶电极对53.2mol/L苯酚重复测定8次,所得平均电流为4.7A。 测定结果的RSD为3.9%,说明该酶电极具有良好的测定重复性。 用同一支GCE按上述方法制备4支酪氨酸酶电极,其对53.2mol/L苯酚测定电流的RSD为3.7%,表明酶电极具有良好的重现性。 3.5酪氨酸酶电极的稳定性?1994-xxChina AcademicJournal ElectronicPublishing House.All rightsreserved.ki.app app276分析化学第35卷通过?定期测定53.2mol/L苯酚溶液的响应电流,考察传感器的贮存稳定性。 放置3星期后传感器还能保持70%的初始响应电流,说明传感器具有良好的稳定性。 这一方面归功于溶胶2凝胶方法-温和的固定条件,另一方面,掺杂褐藻酸钠后,在膜内有大?的OH,能与包埋的酪氨酸酶形成氢键,提供生物相容性的微环境,促进了固定酶的稳定性和保持生物活性。 同时,杂化的溶胶2凝胶膜?开裂、?从电极表面脱?,说明褐藻酸钠掺杂后,改进了硅凝胶膜的柔性和粘接性。 References1Zhang ZE,L iuH Y,Deng JQ.Anal.Chem.,1996,68 (9):163216382Zhao Changzhi(赵常志),Jiao Kui(焦奎),Feng Chunliang(冯春良).Chinese J.Anal.Chem.(分析化学),xx,33 (10):147614783Adeloju SB,Moline AN,B iosens.B ioelectron.,xx,16 (3):1331394Razola SS,Ruiz BL,D izeN M,Mark H.B,Jr,Kauffmann J2M.B iosens.B ioelectron.,xx,17 (11212):9219285B raunS,Rappoport S,Zusman R,Avnir D,O ttolenghiM.M ater.Lett.,1990,10 (122):156W angG,Xu JJ,Chen HY,Lu ZH.B iosens.B ioelectron.,xx,18 (4):3353437Kim MA,Lee WY.Anal.Chim.Acta,xx,479 (2):1431508Hu Z,Seliskar CJ,Heineman WR.Anal.Chem.,1998,70 (24):523052369Gill I,Ballester osA.J.Am.Chem.Soc.,1998,120 (34):8587859810W angB Q,L iB,Deng Q,Dong SJ.Anal.Chem.,1998,70 (15):3170317411Yu JH,L iuS Q,Ju HX.B iosens.B ioelectron.,xx,19 (5):50951412Rogers KR,Becker JY,Cembrano 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alginateastheadditive.0.3mL ofmethanol,0.2mL ofMTMOS.0.2mL of10g/L sodiumalginate,and0.2mL of0.01mol/L HClwere mixedin asmallweigh vialat roomtemperatureand thensonicated forapproximately20min toobtain auniform soil.Sequently,2mg oftyrosinase wasdissol