HIV病毒检测方法及其检测试剂盒

精品文档 1欢迎下载 54 54 发明名称发明名称 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测方法及其检测试剂盒 57 57 摘要摘要 本发明公开了一种 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测试剂盒及其检测方法 该检测方法是根 据 GenBank 公布的 HIV 病毒序列的保守区域设计 HIV RT LAMP LFD 反应系统所需引物与探 针 采用本发明人配制的 RNA 提取试剂提取 HIV 病毒 RNA 使用本发明建立的 RT LAMP 反应 体系进行检测 依据反应体系加入的检测探针 在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定 结果 同现在 HIV 病毒的常用检测技术相比 本发明有助于实现早期诊断 避免漏检 有助于提高检测的灵敏性 缩短检测时间 是 HIV 诊断方法持续发展的主要方向 1 一种 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测方法 其特征在于包括如下步骤 HIVHIV 病毒 病毒 RNARNA 的提取的提取 1 取 20 35mg 含有 HIV 病毒的血液组织 加入 300 500u L 裂解液匀浆 离心 2 取步骤 1 离心所得上清液 与等体积的 70 无水乙醇混合均匀后 将混合液与玻 璃纤维素膜结合 3 依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜 4 用 RNase free water 洗脱玻璃纤维素膜上吸附的 RNA 5 配制预反应液配制预反应液 所述预反应液体积为 15 20 u L 包括 1 5 2 0mmol L 引物 HIV FIP 1 5 2 0mmol L 引物 HIV BIP 0 2mmol I 引物 HIV F3 0 2mmol 1 引物 HIV B3 0 05 0 20umol L 探针 HIV FITC PROBE 15 30mmol L pH8 5 9 5 的 Tris HCl 10 25mmol I 氯化钾 10 25 mmol 1 硫酸铵 5 l5mmol I 硫酸镁 0 15 0 35 Triton X 100 0 4 0 9mo1 I 甜菜碱 1 5 1 8mmol I dNTP 1 3U 逆转录酶 AMV 5 15U BstDNA 聚合酶大片 段 引物 HIV FIP 序列见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序列 见 SEQ ID N0 5 6 在 16 25 u L 预反应液中加入 4 10 u L 步骤 4 所得 RNA 作为模板 控制反应体系总 体积为 20 25u L 然后在温度为 60 65 C 反应 15 65min LFDLFD 试纸检测试纸检测 7 取步骤 6 所得 LAMP 扩增反应产物 6 10 u L 滴到 LFD 试纸的点样处 然后在 点样处前端滴上 60 100 uL 缓冲液 5 20 分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果 2 根据权利要求 1 所述的 HIV RT LAMP LFD 检测方法 其特征在于 所述裂解液包括浓度 为 30 60mmol L 的 pH7 3 7 6 的 Tris HCl 浓度为 3 6mol L 的异硫氰酸胍 以及浓度为 5 10mmol L EDTA 3 根据权利要求 1 所述的 HIV RT LAMP LFD 检测方法 其特征在于 所述去蛋白液包括浓 度为 10 50mmol L 的 pH7 3 7 6 Tri s HCl 浓度为 0 4 0 6mol L 异硫氰酸胍 以及 体积浓度为 15 30 的无水乙醇 4 根据权利要求 1 所述的 HIV RT LAMP LFD 检测方法 其特征在于 所述漂洗液包括浓度 为 10 50mmol L 的 pH7 3 7 6 Tris HCL 55 150mmol LNaCl 以及体积浓度 75 的无水乙醇 5 根据权利要求 1 或 2 或 3 或 4 所述的 HIV RT LAMP LFD 检测方法 其特征在于 引物 HIV FIP 为 5 端生物素标记引物 探针 MIV FITC PROBE 为 5 端 FITC 标记探针 6 一种 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测试剂盒 其特征在于 包括 RT LAMP 扩增反应液 16 20u L 的 RT LAMP 扩增反应液包括 1 5 2 0mmol L 引物 HIV FIP 1 5 2 0mmol L 引物 HIV BIP 0 2mmol I 引物 HIV F3 0 2mmol 1 引物 HIV B3 0 05 0 20umol L 探针 HIV 精品文档 2欢迎下载 FITC PROBE 15 30mmol L pH8 5 9 5 的 Tris HCl 10 25mmol I 氯化钾 10 25 mmol 1 硫酸铵 5 l5mmol I 硫酸镁 0 15 0 35 Triton X 100 0 4 0 9mo1 I 甜菜碱 1 5 1 8mmol I dNTP 1 3U 逆转录酶 AMV 5 15U BstDNA 聚合酶大片段 其余为 RNase firee water 引物 HIV FIP 序列见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序列见 SEQ ID N0 5 7 根据权利要求 6 所述的 HIV RT LAMP LFD 检测试剂盒 其特征在于 引物 HIV FIP 序列 见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序列见 SEQ ID N0 5 8 根据权利要求 6 所述的 HIV RT LAMP LFD 检测试剂盒 其特征在于 HIV 病毒 LAMP LFD 检测试剂盒还配有 LFD 试纸用的缓冲液 阳性对照样品和阴性对照样品 其中 LFD 试纸用 的缓冲液为 1xTAE 缓冲液 阳性对照样品为 HIV 基因组病毒 RNA 阴性对照样品为无核酸 的 RNase firee water HIVHIV 病毒病毒 RT LAMP LFDRT LAMP LFD 检测方法及其检测试剂盒检测方法及其检测试剂盒 技术领域技术领域 000l 本发明涉及哺乳动物病毒检测领域 特别涉及一种人体 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测 方法及其检测试剂盒 背景技术背景技术 0002 HIV 即人类免疫缺陷病毒 Human Immunodeficiency Virus HIV 顾名思义它会 造成人类免疫系统的缺陷 1981 年 人类免疫缺陷病毒在美国首次发现 它是一种感染人 类免疫系统细胞的慢病毒 Lentivirus 属反转录病毒的一种 至今无有效疗法的致命性 传染病 该病毒破坏人体的免疫能力 导致免疫系统失去抵抗力 从而导致各种疾病及癌 症得以在人体内生存 发展到最后 导致艾滋病 获得性免疫缺陷综合征 0003 研究表明 人类免疫缺陷病毒直径约 120 纳米 大致呈球形 病毒外膜是类脂包膜 来自宿主细胞 并嵌有病毒的蛋白 gp120 与 gp41 gp41 是跨膜蛋白 gp120 位于表面 并 与 gp41 通过非共价作用结合 向内是由蛋白 p17 形成的球形基质 Matrix 以及蛋白 p24 形成的半锥形衣壳 Capsid 衣壳在电镜下呈高电子密度 衣壳内含有病毒的 RNA 基 因组 酶 逆转录酶 整合酶 蛋白酶 以及其他来自宿主细胞的成分 其序列已测定并其序列已测定并 在在 GenBankGenBank 上登录上登录 登录号分别为登录号分别为 AY222839 AY222839 AY222840 AY222840 目前该病毒的检测方法有电镜法 RT PCR 检测法 TAS FLTSA 检测法等 但在实际检测工作中 现有的检测技术存在以下问 题 一是灵敏度小 无法检测到潜伏感毒样品 二是容易产生假阳性 对模板质量要求高 三 是操作繁琐 对实验条件要求高 0004 RT LAMP 是一种新型的核酸等温扩增检测技术 即依据环介导等温核酸扩增技术的 原理 针对靶基因的特定区域设计 4 条特异性引物 利用一种具有链置换特性的 DNA 聚合 酶和 AMV 逆转录酶的同时作用下 使 RT 和 LAMP 反应在同管中同时进行 简化了操作步骤 在等温条件下就可以高效 高特异地扩增靶序列 LAMP 产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电 泳 浊度观察 荧光染料观察等方法 0005 侧向流层析试纸 lateral flow dipstick LFD 是一种检测产物的新方法 利用反 应体系中的 FITC 标记的探针与生物素标记的 LAMP 扩增产物特异性杂交 减少了电泳环节 染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题 LFD 检测相对于其他检测 精品文档 3欢迎下载 手段 有操作简便且安全的特点 LAMP LFD 反应结果可以直接肉眼观察 LFD 试纸上有质 控带和检测带 两条带都显色表示阳性 只有质控带而检测带未显色表明检测结果为阴性 该方法具有安个 快捷 高效 高灵敏度且无高的实验条件要求 适合应用推广 目 前 该技术在艾滋病病毒 HIV 的检测中未见报道 发明内容发明内容 0006 本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸 来检测艾滋病病毒 HIV 的方法 特异性强 敏感率高 0007 本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒 该试剂盒特异性强 敏感率高 而且操作简便快捷 克服现有检测方法不能在检查中直接应用的问题 适合艾 滋病病毒 HIV 的筛查与预防 0008 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 一种艾滋病病毒 HIV RT LAMP LFD 检测方法 包括如下步骤 病毒 RNA 的提取 1 取 20 35mg 含有 HIV 病毒的血液组织 加入 300 500 裂解液匀浆 离心 2 取步骤 1 离心所得上清液 与等体积的 70 无水乙醇混合均匀后 将混合液与玻 璃纤维素膜结合 3 依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜 4 用 RNase free water 洗脱玻璃纤维素膜上吸附的 RNA 所述预反应液体积为 15 20 u L 包括 1 5 2 0mmol L 引 物 HIV FIP 1 5 2 0mmol L 引物 HIV BIP 0 2mmol I 引物 HIV F3 0 2mmol 1 引物 HIV B3 0 05 0 20umol L 探针 HIV FITC PROBE 15 30mmol L pH8 5 9 5 的 Tris HCl 10 25mmol I 氯化钾 10 25 mmol 1 硫酸铵 5 l5mmol I 硫酸镁 0 15 0 35 Triton X 100 0 4 0 9mo1 I 甜菜碱 1 5 1 8mmol I dNTP 1 3U 逆转录酶 AMV 5 15U BstDNA 聚 合酶大片段 引物 HIV FIP 序列见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序列见 SEQ ID N0 5 6 在 16 25 u L 预反应液中加入 4 10 u L 步骤 4 所得 RNA 作为模板 控制反应体系总 体积为 20 25u L 然后在温度为 60 65 C 反应 15 65min LFD 试纸检测 7 取步骤 6 所得 LAMP 扩增反应产物 6 10 u L 滴到 LFD 试纸的点样处 然后在 点样处前端滴上 60 100 uL 缓冲液 5 20 分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果 0009 本发明的检测方法是根据 GenHank 公布的艾滋病病毒 HIV 序列的保守区域设计了 HIV 病毒 RT LAMP LFD 反应系统所需引物与探针 病毒 RNA 提取病毒 RNA 使用本发明建立 的 RT LAMP LFD 反应体系进行检测 依据反应体系中加入的检测探针 在反应结束后利用 核酸快速检测试纸判定结果 结果显示在 61 30min HIV 病毒 RNA 获得了高效特异性扩 增 同现在 HIV 病毒的常用检测技术相比 本发明有助于实现早期诊断 避免漏检 有 助于提高检测的灵敏性 缩短检测时间 是 HIV 诊断方法持续发展的主要方向 0010 作为优选 所述裂解液包括浓度为 30 60mmol L 的 pH7 3 7 6 的 Tris HCl 浓度 为 3 6mol L 的异硫氰酸胍 以及浓度为 5 10mmol L EDTA 0011 作为优选 所述去蛋白液包括浓度为 10 50mmol L 的 pH7 3 7 6 Tri s HCl 浓度 为 0 4 0 6mol L 异硫氰酸胍 以及体积浓度为 15 30 的无水乙醇 0012 作为优选 所述漂洗液包括浓度为 10 50mmol L 的 pH7 3 7 6 Tris HCL 55 150mmol LNaCl 以及体积浓度 75 的无水乙醇 0013 作为优选 引物 HIV FIP 为 5 端生物素标记引物 探针 HIV FTIC PROBE 为 5 精品文档 4欢迎下载 端 FTIC 标记探针 0014 一种 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测试剂盒 其特征在于 包括 RT LAMP 扩增反应液 16 20u L 的 RT LAMP 扩增反应液包括 1 5 2 0mmol L 引物 HIV FIP 1 5 2 0mmol L 引 物 HIV BIP 0 2mmol I 引物 HIV F3 0 2mmol 1 引物 HIV B3 0 05 0 20umol L 探针 HIV FITC PROBE 15 30mmol L pH8 5 9 5 的 Tris HCl 10 25mmol I 氯化钾 10 25 mmol 1 硫酸铵 5 l5mmol I 硫酸镁 0 15 0 35 Triton X 100 0 4 0 9mo1 I 甜菜碱 1 5 1 8mmol I dNTP 1 3U 逆转录酶 AMV 5 15U BstDNA 聚合酶大片段 其余为 RNase firee watero 引物 HIV FIP 序列见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序列见 SEQ ID N0 5 0015 作为优选 引物 HIV FIP 为 5 端生物素标记引物 探针 HIV FTIC PROBE 为 5 端 FTIC 标记探针 0016 作为优选 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测试剂盒还配有 LFD 试纸用的缓冲液 阳性对 照样品和阴性对照样品 其中 LFD 试纸用的缓冲液为 1 x TAE 缓冲液 阳性对照样品为 HIV 病毒基因组 RNA 阴性对照样品为无核酸的 RNase firee water 0017 本发明的有益效果是 1 本发明所采用引物组是根据 HIV 衣壳蛋白基因的六个不同区域设计的 又有 RNA 的特异性探针相结合 特异性比常规 PCR 强 0018 2 本发明的检测试剂盒检测灵敏度高 是常规 PCR 的 102 103倍 0019 3 本发明的检测试剂盒检测时间短 可以在 30 60min 内获得检测结果 比常规 PCR 节约 3 5 4 5 小时 0020 4 本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低 不需要普通 PCR 所用的 PCR 仪 凝 胶电泳和成像系统 0021 5 本发明中的病毒 RNA 提取方法简单快捷 而且不用到氯仿 巯基乙醇等有害 物质 0022 6 本发明的检测试剂盒操作步骤简单 结果直观易判定 0023 7 本发明的检测试剂盒对人和环境较安 整个过程不使用有毒物质 0024 附图说明附图说明 0025 0025 图图 1 1 为扩增温度对为扩增温度对 RT LAMPRT LAMP 反应的影响图 反应的影响图 M 100bpM 100bp DNADNA LadderLadder Marker TaKaRaMarker TaKaRa 公司公司 泳道泳道 1 61 1 61 恒温条件下扩增结果恒温条件下扩增结果 泳道泳道 2 2 63 63 温度条件下扩增结果温度条件下扩增结果 泳道泳道 3 65 3 65 温温 度条件下扩增结果 度条件下扩增结果 0026 0026 图图 2 2 为为 MrNVMrNV RT LAMPRT LAMP 特异性实验结果 特异性实验结果 M l00bpM l00bp DNADNA LadderLadder Marker TaKaRaMarker TaKaRa 公公 d d 泳道泳道 1 1 罗氏沼虾野田村病毒罗氏沼虾野田村病毒 泳道泳道 2 2 南美白对虾白斑综合症病毒 南美白对虾白斑综合症病毒 WSSV WSSV 泳道泳道 3 3 草鱼呼肠孤病毒 草鱼呼肠孤病毒 GORV GORV 泳道泳道 4 4 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 IHHNV IHHNV 泳道泳道 5 5 对对 虾桃拉病毒虾桃拉病毒 TSV TSV 泳道泳道 6 6 阴性对照 阴性对照 0027 0027 图图 3 3 为本发明的检测方法检测感染为本发明的检测方法检测感染 MrNVMrNV 样品实验结果图 样品实验结果图 M M 100bp 100bp DNADNA ladderladder Marker TaKaRaMarker TaKaRa 公司公司 左侧泳道左侧泳道 1 1 MrNVMrNV 样品样品 RT LAMPRT LAMP 反应反应 30min 30min 检测结果 检测结果 左侧泳道左侧泳道 2 MrNV2 MrNV 样品样品 RT LAMPRT LAMP 反应反应 45min45min 检测结果检测结果 NT NT 为阴性对照样品检测结果为阴性对照样品检测结果 右侧为右侧为 LFDLFD 试纸试纸 检测显色结果 检测显色结果 0028 0028 图图 4 4 为本发明的检测方法检测为本发明的检测方法检测 MrNVMrNV 的灵敏度比较图和的灵敏度比较图和 LFDLFD 试纸显色对比图 试纸显色对比图 M M 100bp100bp DNADNA ladderladder Marker TaKaRaMarker TaKaRa 公司公司 左侧泳道左侧泳道 1 6 1 6 模板分别为模板分别为 1010 1 1 10 10 2 2 10 10 3 3 10 10 4 4 10 105 5 10 106 6倍稀释的基因组倍稀释的基因组 RNA RNA 泳道泳道 7 7 无模板无模板 右侧右侧 1 7 1 7 为左侧实验结果的为左侧实验结果的 LFDLFD 试纸检测图 试纸检测图 精品文档 5欢迎下载 具体实施方式 0029 下面通过具体实施例 并结合附图 对本发明的技术方案作进一步的具体说明 0030 本发明中 若非特指 所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的 下述实施例中的方法 如无特别说明 均为本领域的常规方法 0031 本发明实施如下 一种艾滋病病毒 HIV RT LAMP LFD 检测方法 包括如下步骤 病毒 RNA 的提取 1 取 20 35mg 含有 HIV 病毒的血液组织 加入 300 500u L 裂解液匀浆 离心 12000rpm 离心 1 2min 0032 所述裂解液包括浓度为 30 60mmol L 的 pH7 3 7 6 的 Tris HCl 浓度为 3 6mol L 的异硫氰酸胍 以及浓度为 5 10mmol L EDTA 其余为 RNase free water 0033 2 取步骤 1 离心所得上清液 与等体积的 70 无水乙醇混合均匀后 将混合液 与玻璃纤维素膜结合 将混合液与玻璃纤维素膜结合具体操作为 将混合液转入带有玻璃 纤维素膜的吸附柱中 12000rpm 离心 1 2min 弃掉废液 这样混合液与玻璃纤维素膜就结 合 0034 3 依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜 0035 去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为 向吸附柱中加入 400 600 u L 去蛋白液 室温静 1 2min 12000rpm 离心 30 60s 弃掉废液 0036 所述去蛋白液包括浓度为 10 50mmol L 的 pH7 3 7 6 Tri s HCl 浓度为 0 4 0 6mol L 异硫氰酸胍 以及体积浓度为 15 30 的无水乙醇 0037 漂洗液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为 向吸附柱中加入 400 600 u L 漂洗液 12000rpm 离心 30 60s 弃掉废液 重复该步骤一次 0038 所述漂洗液包括浓度为 10 50mmol L 的 pH7 3 7 6 Tris HCL 55 150mmol LNaCl 以及体积浓度 75 的无水乙醇 0039 4 用 RNase free water 洗脱玻璃纤维素膜上吸附的 RNA 具体操作为 在吸附 柱 中加入 30 50u L RNase free water 市售 室温放置 1 2min 12000rpm 离心 1 2min 重复 该步骤一次 增加 RNA 洗脱量 0040 RT LAMP 扩增反应 5 配制预反应液 所述预反应液体积为 15 20 u L 包括 1 5 2 0mmol L 引 物 HIV FIP 1 5 2 0mmol L 引物 HIV BIP 0 2mmol I 引物 HIV F3 0 2mmol 1 引物 HIV B3 0 05 0 20umol L 探针 HIV FITC PROBE 15 30mmol L pH8 5 9 5 的 Tris HCl 10 25mmol I 氯化钾 10 25 mmol 1 硫酸铵 5 l5mmol I 硫酸镁 0 15 0 35 Triton X 100 0 4 0 9mo1 I 甜菜碱 1 5 1 8mmol I dNTP 1 3U 逆转录酶 AMV 5 15U BstDNA 聚 合酶大片段 0041 引物 HIV FIP 序列见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序列见 SEQ ID N0 5 0042 HIV RT LAMP 引物 探针设计与筛选 本发明所述的引物是根据 GenBank 公布的 RNA2 序列 由在线软件 PrimerExplorer V4 http primerexplorer jp e 设计和手工修改后获得 利用不同引物的反应结果进行 筛选 由其中选出两对引物和一条探针 0043 引物 HIV F3 SEQ ID N0 3 GATACAACAACTATTCCATTGATTG 0044 引物 HIV B3 SEQ ID N0 4 TGTAGGATTAATTTGTGGCATG 精品文档 6欢迎下载 0045 引物 HIV FIP SEQ ID NO 1 GCAAGAGGTAAAATACACCCTGTT TACTATACTGGTCAAGATAAAGAGA 0046 引物 HIV BIP SEQ ID NO 2 AGTGGTGAAGCCATTACAAATGA GAAAATCCACAGACCCAATC 0047 探针 HIV FITC PROBE SEQ ID N0 5 CTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAA 0048 其中 HIV FIP 为 5 端生物素 biotin 标记引物 HIV FITC PROBE 为 5 端 FITC 标记探针 0049 6 在 16 25 u L 预反应液中加入 4 10 u L 步骤 4 所得 RNA 作为模板 控制 反应体系总体积为 20 25u L 然后在温度为 60 65 C 反应 15 65min 0050 LFD 试纸检测 7 取步骤 6 所得 LAMP 扩增反应产物 6 10 u L 滴到 LFD 试纸的点样处 然后在点样 处前端滴上 60 100 uL 缓冲液 5 20 分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果 当仅出 现质控带时表明反应结果为阴性 当质控带和检测带同时出现时 表明 反应结果为阳性 0051 一种 HIV 病毒 RT LAMP LFD 检测试剂盒 其特征在于 包括 RT LAMP 扩增反应液 16 20u L 的 RT LAMP 扩增反应液包括 1 5 2 0mmol L 引物 HIV FIP 1 5 2 0mmol L 引 物 HIV BIP 0 2mmol I 引物 HIV F3 0 2mmol 1 引物 HIV B3 0 05 0 20umol L 探针 HIV FITC PROBE 15 30mmol L pH8 5 9 5 的 Tris HCl 10 25mmol I 氯化钾 10 25 mmol 1 硫酸铵 5 l5mmol I 硫酸镁 0 15 0 35 Triton X 100 0 4 0 9mo1 I 甜菜碱 1 5 1 8mmol I dNTP 1 3U 逆转录酶 AMV 5 15U BstDNA 聚合酶大片段 其余为 RNase firee water 0052 引物 HIV FIP 序列见 SEQ ID N0 1 引物 HIV BIP 序列见 SEQ ID N0 2 引物 HIV F3 序列见 SEQ ID N0 3 引物 HIV B3 序列见 SEQ ID NO 4 探针 HIV FITC PROBE 序 列见 SEQ ID N0 5 0053 RT LAMP 扩增反应液装于 RT LAMP 核酸反应管中 RT LAMP 核酸反应管中添加有 稳定液 稳定液为液体石蜡油 稳定液滴加在 RT LAMP 核酸反应管中 用于液封 稳定液 用量在 5 10 u L 0054 检测试剂盒还配有 LFD 试纸用的缓冲液 阳性对照样品和阴性对照样品 其中 LFD 试纸用的缓冲液为 1x TAE 缓冲液 阳性对照样品为 HIV 病毒基因组 RNA 阴性对照样品为 无核酸的 RNase free water 0055 本发明的上述方案在其范围内都是可以实施的 以下以一个典型实施方案来具体 说明本发明的具体操作步骤 0056 典型实施方案 1 材料 被感染的人体 HIV 病毒细胞采集自宁波第一医院 所用引物与探针由上海生工生物公司 合成 Bst DNA 聚合酶大片段购自 New England BIPolabs 公司 逆转录酶 AMV dNTP 购自 takara 公司 甜菜碱 硫酸镁等购自 sigma 公司 0057 2 罗氏沼虾样品病毒 RNA 的提取 1 取 20mg 被感染的人体 HIV 病毒细胞组织 加入 500 u L 裂解液后用一次性研磨 棒研磨 等彻底匀浆后 12000rpm 离心 2min 吸取上清液至新的离心管 2 向装有上清液的新的离心管中加入等体积 与上清液等体积 的 70 无水乙醇后 混合均匀 精品文档 7欢迎下载 3 将混合液体转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中 吸附柱置于收集管中 12000rpm 离心 l min 弃掉废液 4 向吸附柱中加入 550 u L 去蛋白液 室温静置 1min 12000rpm 离心 30s 弃掉废 液 5 加入 600 u L 漂洗液 12000rpm