再生医学研究.ppt

王正国 再生医学研究 中国工程院院士第三军医大学教授 2 再生 regeneration 有生理性和病理性两种 生理性再生是指在生理过程中 一些细胞 组织不断老化 消耗 由新生的同种细胞不断补充 始终保持原有的结构和功能 如消化道上皮约1 2天就更新一次 嗜中性粒细胞只存活1 2天 子宫内膜周期性脱落 表皮角化细胞不断脱落 基底层细胞不断增生等 病理性再生是指病理状态下细胞 组织缺损后发生的再生 再生医学研究的对象是病理性再生 3 再生医学 regenerativemedicine RM 原先指体内组织再生的理论 技术和外科操作 现在 它的内涵已不断扩大 包括 组织工程 细胞和细胞因子治疗 基因治疗 4 组织工程 5 组织工程最初是用来描述组织体外构建的有关理论和技术 现在 它的内涵也在不断扩大 凡是能引导组织再生的各种方法和技术均被列入到组织工程范畴内 如干细胞治疗 细胞因子和基因治疗 并已广泛用于体内组织再生和体外的组织重建 6 国际再生医学基金会 InternationalFoundationRegenerativeMedicine IFRM 明确把组织工程定为再生医学的分支学科 sub discipline 但很多情况下 两者常混用 7 再生医学有很悠久的历史 组织工程学的出现 使得再生医学进入了一个新时代 组织工程被认为是继细胞生物学和分子生物学之后 生命科学发展史上又一新的里程碑 也是一场意义深远的医学革命 8 第一位提出 组织工程学 这一术语的是美藉华裔学者冯元祯 Y C Feng 教授 1987年美国国家科学基金会根据冯教授的建议 正式采用 组织工程学 这一术语来描述这一新兴的领域 并正式建立了这门新学科 9 10 从外科学的发展历程来看 先后经历了三个 R 阶段 即切除 Resection 修补 Repair 和替代 Replacement 组织工程学的出现 意味着外科学已进入 再生医学 RegenerativeMedicine 的新阶段 是第4个 R 11 切除Resection 修补Repair 替代Replacement 再生Regeneration 12 20多年来组织工程经历了两个阶段 前10年主要是证实利用细胞和生物材料构建组织的可行性 后10多年 20世纪90年代初至今 在研究内容 手段 临床试用等方面都有很大的发展 主要进展如下 13 构建组织不再局限于以裸鼠为代表的免疫缺陷型动物模型 而是更多采用与人体结构相近的具有免疫功能的大型哺乳动物模型 目前 组织工程化骨 软骨 皮肤 肌腱等组织已在猪 羊和犬等大型动物中成功构建 并修复了相应的组织缺陷 动物模型 14 不再局限于细胞生物学和动物实验技术 新技术如分子生物学技术 基因克隆技术 转基因技术 移植免疫学技术 干细胞技术 遗传工程技术 生物材料合成与改良技术 生物材料的编织技术 生物力学技术 三维打印技术 影像学技术和生物反应器技术等均用于组织工程研究 从而提高了研究水平 加快了研究速度 研究手段 15 种子细胞在体外培养扩增 但随着培养时间的延长 许多细胞会失去重要的表型特征 细胞生物学的发展使得培养条件能有利于细胞增殖 同时保留其表型特点 或是在扩增后恢复其已失去表型的基因表达 种子细胞表型特征的保存 16 已由同一种组织构建的种子细胞扩展至其他组织的细胞 例如构建骨组织的种子细胞可用骨髓间充质干细胞来代替成骨细胞 构建肌腱组织可用皮肤成纤维细胞来代替肌腱细胞 随着免疫学的发展 今后有可能创造出通用型种子细胞 种子细胞来源 17 对支架材料的要求应有微孔结构 所需的孔径 孔隙率及微孔分布与走向应随组织不同而变化 支架材料的化学组成对细胞的附着和浸入的细胞表型表达会产生影响 支架材料 18 支架材料在体内组织再生过程中有以下作用 在结构上加强缺损部位的强度 阻止周围组织长入 作为体外接种的细胞在体内扩增和增殖的支架 利用与细胞整合素以及受体的相互作用 作为一种可溶的细胞功能调节因子 作为细胞 生长因子和基因的生物载体 19 在支架材料的选择上 不仅用传统的单纯高分子可降解聚合物 而且也发展到用纯天然的脱细胞基质材料 或采用多孔可吸收的高分子人工合成材料与天然细胞外基质分子复合的新型材料 如合成的多聚物和钙磷材料 后者有可能成为未来组织工程的主导材料 20 在体外 通过模拟体内环境可以构建出多种不同的组织化工程组织 如皮肤 软骨组织等 其中 灌注型生物反应器 利用动物体表达外源性基因 的应用起到关键作用 体外构建组织 21 20世纪90年代 美国FDA已批准组织工程皮肤及自体软骨细胞移植修复关节软骨部分缺损用于临床 并已产业化生产 另有一些产品进入临床试用或临床前研究阶段 预计2010年前会有更多的产品上市 临床应用 22 我国的组织工程研究 23 我国的组织工程得到了国家有关部门的大力支持 20世纪90年代已有不少单位开展了组织工程的研究 1999年把 组织工程的基本科学问题 列入国家重点基础研究发展规划 973 项目 首席科学家为曹谊林教授 24 先后出版了 组织工程 基础与临床 杨志明主编 四川科技出版社 2000年 51万字 组织工程 杨志明主编 化学工业出版社 2002年 56 3万字 组织工程学 理论与实践 曹谊林主编 上海科技出版社 2004年 57万字 等专著 举办了多次专业会议 学术气氛十分活跃 25 国外仍主要集中在体外的研究 而我国可用大动物模型构建各种组织工程化组织 这方面的研究水平处于国际领先地位 26 在临床应用方面 国内成都华西医院杨志明教授领导的组织工程实验室运用组织工程已成功修复重建骨缺损 肌腱 韧带 治疗肌病 大多取得了不同程度的满意效果 27 一项863课题 组织工程皮肤 近期已通过国家食品药品监督管理局 SFDA 规定的临床试验 现已完成160例皮肤移植的实验 全部获得成功 其产品质量已达国际先进水平 与美国Organogenesis公司产品比 成本更低 1 6 保存时间更长 美国 1周 中国 3个月 治愈能力更强 28 组织工程需要研究的科学问题 29 自体细胞研究自体细胞简易培养 扩增技术 使其能在短时间内获得足够数量和功能很强的种子细胞 并能降低成本 则临床应用价值会更大 种子细胞 30 同种异体细胞经基因改造 建立无瘤倾向的标准细胞系才能进行产业化生产 要保证临床应用的安全性 其致瘤性 遗传物质的改变等应做出长期评价 31 胚胎干细胞 ESC 要研究形成组织的微环境及条件 定向分化功能细胞的条件及调控 形成组织的功能状态及最后结局 应用后的社会伦理等 异种细胞目前研究较多的是猪 必须解决排斥反应问题 32 快速扩增细胞的形态 功能检测要确认经快速扩增后仍能保持原代细胞的形态和功能时才能用于构建组织工程产品 细胞培养技术 33 支架材料 理想的支架材料应具备以下特点 生物相容性好 可降解 其降解产物对人体无害 有一定力学强度 可塑形 材料降解速度与细胞的功能发挥尽可能相匹配 材料本身具有引导或诱导组织再生的能力 34 目前所有支架均不完全具备上述要求 因此不仅要研究单一成分材料 更要研究复合材料及生物衍生材料 经去脂 去细胞 去抗原处理后 可能成为较好的细胞外基质用于临床 35 检测及评价 美国FDA批准用于临床的组织工程皮肤已有检测方法及评定标准 因不同组织采用的种子细胞和支架材料不同 检测方法及评定标准也不同 我国应制定自己的标准 作为今后制定国际标准的基础 36 干细胞研究 37 我国有关干细胞的研究也十分活跃 国家科技部于2001年批准19项 973 项目 其中有两项为干细胞研究 一项是 胚胎生殖嵴干细胞的分化与组织干细胞的可塑性研究 首席科学家为北大干细胞中心李凌松教授 另一项是 干细胞的基础研究与临床应用 首席科学家为上海第二医科大学的盛惠珍教授 在同一年度 同一领域批准两项 973 项目 以往从未有过 38 近期 国内又出版了许多专著 如2003年科学出版社出版的 干细胞生物学 裴雪涛主编 71 2万字 召开过多次学术会议 并已在血液病等疾病治疗上发挥了重要作用 39 干细胞在生命科学的基础研究与临床应用中起着越来越重要的作用 干细胞在细胞治疗 组织器官修复 发育生物学 药物学等领域有着广阔的应用前景 40 作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞如骨髓间充质干细胞在体内外能分化为肌肉细胞和神经细胞 为治疗肌萎缩 脑萎缩 帕金森病等退行性疾病带来希望 41 探讨胚胎发育的调控机制生命最大的奥秘就是探讨一个受精卵如何发育成复杂的生命体 受精卵进入子宫后无法接近 因而人胚胎干细胞系的建立将有助于了解胚胎发育工程中不同时空的分化细胞间基因表达的差异 以及胚胎发育与分化的分子机制 42 作为疾病基因治疗的载体骨髓间充质干细胞易于外源性基因的导入和表达 可作为一种理想的基因治疗靶细胞 43 利用胚胎干细胞体外整合外源性基因 研究基因功能 利用胚胎干细胞与基因定位整合技术 可将一些在发育过程中特定的基因敲除 进行基因缺乏的研究 44 药物筛选平台的建立 药理研究与新药开发干细胞经体外诱导 可用于药物筛选 鉴定 并有助于人类疾病细胞模型的建立及新药开发 45 QUESTIONS 干细胞研究中未解决的科学问题 46 维持胚胎干细胞未分化状态的机制 干细胞定向诱导分化的调控机制 获得大量和高浓度的分化细胞 为组织工程提供种子细胞 是否具有形成复杂器官的能力 47 用干细胞作替代治疗的移植排斥问题 临床应用的安全性 归巢 homing 游离干细胞定向迁移过程 的调控机制 相关的伦理和社会学问题 成体干细胞可塑性机制 干细胞治疗前景 48 上世纪90年代后期 Nature Science等杂志报道 脏器中特异性的祖细胞 progenitor 和干细胞可发生跨系和跨胚层的转分化或横向分化 transdifferentiation 成体干细胞的可塑性 49 间胚层组织类型干细胞转分化为同胚层另一组织类型细胞 间胚层组织类型干细胞转分化为内胚层组织类型细胞 间胚层组织类型干细胞转分化为外胚层组织类型细胞 由此认为 成体干细胞有较大的可塑性 50 研究还表明 骨髓来源的干细胞在特定环境中可向肝脏 胰腺 肌肉及神经细胞分化 肌肉 神经干细胞也可向造血细胞分化 51 造血干细胞 hematopoieticstemcell HSC 既可分化为成熟的造血细胞 也可分化为成熟的皮肤表皮细胞 肺和胃肠道细胞 Krause Cell 2001 105 369 377 52 但是 不少学者对干细胞跨系 跨胚层的分化提出了质疑 甚至完全否定 Orkin将成体干细胞转分化实验称之为 干细胞炼金术 stemcellalchemy 认为我们所面临的许多生物现象尚难以解释 更多的是 像是 而非真实 moreapparentthanreal OrkinSH Nat Med 2000 6 1212 1213 53 跨胚层干细胞 是否就是典型的组织特异的干细胞 这些细胞的发育分化潜能是否接近于胚胎干细胞的一些亚群的干细胞 成体干细胞在体外培养过程中因环境因素的改变可能会表现出一定的可塑性 但在体内是否也能同样的特性 问题 Chaudry BioTeach 54 推断 可能有一些较为原始的 有多种分化潜能的干细胞存留于许多组织中 与更具有组织特性的干细胞并存 而这些细胞正是成体组织内严格谱系干细胞的基础 或是在发育过程中移至此处的一种有多种分化潜能和完全 独立历史 的细胞 WeissmanIL Stemcell 2000 100 157 168 55 有人明确否定转分化的存在 认为这是一种 离奇 的推论或结论 是缺乏实践证明的虚幻空想 唐佩弦 56 证实或推断 在成体组织中仍然残留胚胎发育过程中各胚层定向和组织定向的各类干细胞 在胚胎发育的各个阶段 有少部分干细胞中止参与胚胎发育 并转入G0期 这些细胞既不增殖又不分化 仍然保持干细胞的基本特性 证实或推断 57 58 出生后随年龄的增长 体内组织中保留的各类成体干细胞基本特征不变 但是 在体外一定细胞因子诱导刺激下 它可以从G0静止期转入细胞周期而增殖 并分化为某种组织定向细胞 59 组织干细胞分化的可塑性是很有限的 它只能沿着本组织各支系纵向分化 如造血干细胞的多向分化 仅限于髓系和淋巴系的造血细胞各支系的纵向分化 不能跨越本组织定向的限制 更不能突破胚层的界限 在生物界或人类医学史上也从未出现过因横向分化所至的疾病或怪胎 60 跨胚层转分化可能的原因是 骨髓中成体干细胞不仅包括造血干细胞 间质干细胞 而且还有其他各胚层来源的干细胞及其分化的后代 即各类非造血组织的干细胞 如神经干细胞 肝脏干细胞等 61 所谓成体干细胞多向分化的可塑性 其实是胚胎发育期存留于造血组织等部位的各胚层干细胞的自然属性 如肌肉匀浆中不仅含有肌细胞 脂肪组织中不仅含有脂肪细胞 其中还有各种成体干细胞 它们的分化过程并没有跨越组织定向的限制 62 对于转分化的不同看法 其根本原因是至今尚无可能用绝对纯化的正常组织干细胞克隆来证明组织定向干细胞可向非自身组织的方向分化 63 已证明 正常人和啮齿类动物 可能还有其他哺乳动物 出生后组织中存在一群原始细胞 其单个细胞具有多潜能分化和大量增殖的潜力 称为多潜能成体祖细胞 multipotentadultprogenitorcell MAPCs C M Verfaillie MAPCs是体内固有的还在培养条件下形成的 至今还不清楚 64 赵春华证实 在人体胚胎发育过程中 多种组织还存留具有多系分化潜能的亚全能干细胞 它们在胚胎发育成熟后逐渐失去部分原始干细胞表型 但在胚胎发育为成体后仍具有亚全能基因组 其中的组织特异性基因在适当的微环境下可以被激活 因各自所处的微环境不同而向不同的组织分化 能够全方位地选择分化为各种组织细胞 65 赵春华实验室在单克隆细胞水平上通过体内实验证实 亚全能干细胞能够向三个胚层多系统分化为各种组织细胞 这在一定程度上有助于澄清成体干细胞的可塑性问题 66 总之 有关可塑性问题还需不断进行深入研究 要用更先进的手段 获取更充分而精确的科学证据 据此才能来提出或支持相应的论断 67 Bj klund和Svendsen指出 我们现在所看到的意味着一门新的生物学已经出现 从长远看 这是新的再生医学的诞生 68 1999年 Science杂志编者Bloom 干细胞给人类提供了极大的可能性 用干细胞修复病损的脏器和细胞缺损 他还说 最终可能用干细胞制成像肾 肝这样复杂的器官 干细胞治疗的现状和前景 69 源于胚胎干细胞的细胞已能或可能治疗许多疾病 治疗 70 成体干细胞中 造血干细胞 包括骨髓 脐血和外周血中的干细胞 已用于治疗重度白血病和某些遗传性血液病 71 可经诱导向软骨细胞分化 并能分泌特异性 型胶原基质 因此可望成为工程化软骨的种子细胞 分化为肌细胞 可能成为肌萎缩 肌营养不良时促进肌组织再生的靶细胞 骨髓间充质干细胞 mesenchymalstemcell MSC 72 与基因治疗结合 可强化治疗效果 对某些基因突变所致的遗传性疾病 可分离其自体的间充质干细胞 体外进行改造 敲除突变基因 导入正常基因 然后重新输入体内 既纠正了遗传缺陷 又避免发生移植反应 73 新近的研究表明 成体非心脏来源的干细胞 如骨髓 脑 骨骼肌 脂肪组织 肝脏和外周血干细胞 通过自然迁移或实验植入心脏均可分化为心肌细胞 提示成体干细胞可成为心肌梗死后再生的心肌细胞 目前已很快进入临床研究 74 成体干细胞及其子代细胞移植或动员脑组织内的干细胞治疗神经退行性疾病已获初步成效 动物实验证实移植的神经元可替代修复已损坏的神经通路 临床试验也证实细胞替代治疗可使症状缓解 75 帕金森病的主要病变是黑质纹状体中多巴胺能神经元的退行性变 给病人纹状体内移植胎儿中脑组织的结果显示 移植的神经元可以存活并恢复对纹状体的神经支配达10年 由于伦理 来源等问题 大量临床应用有困难 76 用干细胞和生长因子修复骨折 可加速愈合 动物实验显示 从骨髓提取干细胞能改善治疗效果 用干细胞治疗瘫痪病人 已有成功病例的报告 分离出的毛囊干细胞与 诱导 的真皮细胞结合可产生新的毛囊 77 有人将干细胞当成 未来疾病治疗的新希望 也有人怀疑 干细胞治疗 是新希望还是错误开端 理由是不同的实验结果无法证实骨髓来源的单核细胞可分化为心肌细胞 78 有些经冠脉注入自体骨髓细胞治疗心肌梗死的临床试验结果 初期显示功能改善 但以后与对照组无明显差别 经冠脉注入的骨髓源性单核细胞仅一小部分停留在心脏内 其疗效至今仍不能得出明确的结论 79 将人胚胎干细胞注入患鼠大脑内帮助改善帕金森病症状 结果显示症状确有减轻 但与此同时 一些干细胞并不释放多巴胺 而是继续分裂 其生长方式类似早期的肿瘤细胞 最终可能会形成一种脑内肿瘤