无菌检查操作规程2015-(1)

精品文档 1欢迎下载1欢迎下载1欢迎下载 无菌检查操作规程 1 目的 建立无菌检查标准操作规程 确保检查结果准确 可靠 2 使用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3 职责 质量部 QC 4 依据 2015 版 中国药典 通则 1101 GB T 19973 2 2005 ISO11737 2 1998 疗器械的灭菌 微生物学方法 第 2 部分 确认灭菌过程的无菌试验 GB T 14233 2 2005 医用输液 输血 注射器具检验方法 第 2 部分 生物学试验方法 5 内容 5 1 无菌检查环境保障 5 1 1 无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行 即无菌 检査应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域 内或隔离系统中进行 5 1 2 操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果 为了保证无菌检查 用洁净室 区 环境的稳定性 确保检查结果的可靠性 对洁净室 区 的环境定期监测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求 5 1 3 无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作 防止微生物污染 5 1 4 洁净区的温度 湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求 5 1 5 无菌检查操作还需要对检查环境进行监控 5 2 培养基 稀释液 缓冲液 5 2 1 硫乙醇酸盐流体培养基 市售培养基干粉 除另有规定 接种后应置 30 35 培养 5 2 2 胰酪大豆胨液体培养基 市售培养基干粉 接种后应置 20 35 培养 5 2 3 中和或灭活用培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体 精品文档 2欢迎下载2欢迎下载2欢迎下载 培养基的处方及制法 在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂 灭活 剂或表面活性剂 其用量同方法适用性试验 5 2 4 胰酪大豆胨琼脂培养基 市售培养基干粉 5 2 5 沙氏葡萄糖液体培养基 市售培养基干粉 5 2 6 沙式葡萄糖琼脂培养基 市售培养基干粉 5 2 7 PH7 0 氯化钠蛋白胨缓冲液 市售培养基干粉 5 2 8 0 9 无菌氯化钠溶液 5 2 9 培养基使用性检查 无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符培 养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求 本检查可在供试品的无菌检査或与供 试品的无菌检査同时进行 5 2 9 1 无菌性检查 每批培养基随机取 5 支 瓶 按各培养基规定的温 度下培养 14 天 应无菌生长 5 2 9 2 灵敏度检查 5 2 9 2 1 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过 5 代 从菌种 存中心获得的干菌种第 0 代 并采用适宜的菌种保藏技术进行保存 以证试验菌株的生物学特性 金黄色葡萄球菌 CMCC B 26 003 铜绿假单胞菌 CMCC B 10 104 枯草芽孢杆菌 CMCC B 63 501 生孢梭菌 CMCC B 64 941 白色念珠菌 CMCC F 98 001 黑曲霉 CMCC F 98 003 5 2 9 2 2 菌液制备 接种金色葡萄球菌 铜绿假胞菌 枯草芽孢杆菌的培养 物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上 接种生孢 梭菌的培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中 30 35 培养 18 24 小时 接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼 脂培养基上 20 25 培养 24 48 小时 上述培养后的新鲜培养物用 PH7 0 无菌化钠 蛋白胨缓冲液或 0 9 无菌化钠溶液制成每 lml 菌数 精品文档 3欢迎下载3欢迎下载3欢迎下载 小于 100cfu 菌落形成 的菌悬液 接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄 糖琼脂面培养基上 20 25 培养 5 7 天 加人 3 5 ml 0 05 ml ml 聚山梨酯 80 的 pH7 0 无菌化钠 蛋白胨缓冲液或 0 9 无菌氯化钠溶液 将孢子洗脱 然后 采用适宜的方法吸出孢子悬液 至无菌试管内 用 0 05 ml ml 聚山梨醋 80 的 pH7 0 无菌化钠 蛋 白胨缓冲液或 0 9 无菌氯化钠溶液制成每 lml 孢子数量小于 100cfu 的孢子悬液 菌悬液若在室温下放置 应在 2 小时内使用 若保存在 2 8 在 24h 内使用 黑曲霉孢子悬液存在 2 8 在验证过的贮 存期内用 5 2 9 2 3 培养基接种 取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基 7 支 分别接种小于 100cfu 的色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌各 2 支 另 1 支不接种作为空白对照 培养 3 天 取每管装量为 9ml 的胰 酪大豆胨液体培养基 7 支 分别接种小于 100cfu 的草芽孢杆菌 白 色念珠菌 黑曲霉各 2 支 另 1 支不接种作为空白对照 培养 5 天 逐日观察结 5 2 9 2 4 结果判定 空白管应无菌生长 加菌的管生长良好 说明该培养基 灵敏度符合规定 5 3 方法试用性试验 进行产品无菌检查时 应进行方法适用性试验 以确认所采用的方法适 合于产品的无菌检查 若检验程序或产品发生化可能影响检验结果时 应 重新进行方法适用性试验 方法适用性试验按 5 4 供试品的无菌检查 的 规定及下列要求进行操作 对每一试验菌应逐一进行方法 5 3 1 菌种及菌液的制备 大肠埃希菌 CMCC B 44 102 外 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉的菌株及菌液制同 5 2 9 2 培养基灵敏度检查 大肠埃希菌的菌液制同金黄色葡萄球 菌 5 3 2 薄膜过滤法 每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤 冲 洗 在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu 试验菌 过滤 加硫乙醇酸 盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内 另取一装有同体积培 精品文档 4欢迎下载4欢迎下载4欢迎下载 养基的容器 加入等量试验菌 作为对照 置规定温度下培养 培养时 间不得超过 5 天 各试验菌同法作 5 3 3 直接接种法 取符直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基 6 管 分别接入小于 100cfu 的金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌 各 2 管 取符直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基 6 管 分别接入小于 100cfu 的枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉各 2 管 其中 1 管接入每支培养基规定的供试品接种量 另 1 管作对照 置规定 的温度培养 培养时间不得超过 5 天 5 3 4 结果判断 与对照管比较 如供试品各容器中的试验菌均生长良好 则 说明供试品的检验量在检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不 计 照此检査方法和检查条件进行供试品的无菌检查 如供试品的任一 容器中的试验菌生长微弱 缓慢或不生长 则说明供试品的检验量在检 验条件下有抑菌作用 应采用增加冲洗量 增加培养基的用量 用中和 剂或灭活剂 更换滤膜品种等方法 消除供试品的抑菌作用 并重新进 行方法适用性试验 方法适用性试验与供试品的无菌检查同时进行 5 4 供试品无菌检查 无菌检査法括薄膜过滤法和直接接种法 只要供试品性质允许 应采用 薄膜过滤法 供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用 性试验确认的方法相同 无菌试验过程中 若需用面活性剂 灭活剂 中和剂等试剂 应证明其 有效性 且对微生物无毒性 5 4 1 检验数量 除另有规定外 按表 1 规定 5 4 2 检验量 即接种量 除另有规定外 按表 2 规定 5 4 3 阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌 无抑菌作用及抗革兰氏 阳性菌为主的供试品 以金色葡萄球菌为对照菌 抗革兰氏阴性菌为主 的供试品 以大肠埃希菌为对照菌 抗厌氧菌的供试品 以生孢梭菌为 对照菌 抗真菌的供试品 以白色珠菌为对照菌 阳性对照试验的菌液 制同 5 2 9 2 培养基灵敏度检查 加菌量小于 100cfu 供试品用量 精品文档 5欢迎下载5欢迎下载5欢迎下载 同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量 阳性对照管培养 72 小时 内应生长良好 5 4 4 阴性对照 供试品无菌检查时 应取相应溶剂和稀释液 冲洗液同法操 作 作为阴性对照 阴性对照不得有菌生长 5 4 5 供试品的处理及接种培养基 操作时 用适宜的消毒液对供试品容器面进行彻消毒 如供试品容器内 有一定的真空度 可用适宜的无菌器材 如带有除菌过滤的针头向容器内导 入无菌空气 再按无菌操作启开容器取出内物 5 4 5 1 薄膜过滤法 薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤 无菌检査用 的滤膜孔径应不大于 0 45um 直径约 50mm 根据供试品及其溶剂的特 性选择滤膜材质 使用时 应保证滤膜在过滤前后的完整性 5 4 5 1 1 水溶性供试品 水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤 以 润湿滤膜 取规定量 直接过滤 或混至含不少于 100ml 适宜的稀释 液的无菌容器中 混匀 立即过滤 如供试品有抑菌作用 须用冲洗 液冲洗滤膜 冲洗数一般不少于 3 次 每滤膜每次冲洗量一般为 100ml 且冲洗量不得超过 1000ml 以避免滤膜上的微生物受损伤 所用的冲洗量 冲洗方法同方法适用性试验中确定的 除生物制品外 一般样品冲洗后 1 份滤器中加人 100ml 硫乙醇酸盐流体培养基 1 份滤器中加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基 5 4 5 1 2 非水溶性供试品 取规定量 直接过滤 或混合溶于适量含聚山梨 酯 80 或其他适宜乳化剂的稀释液中 充分混合 立即过滤 用含 0 1 1 聚山梨酯 80 的冲洗液冲洗滤膜至少 3 次 加入含或不含聚 山梨酯 80 的培养基 接种培养基照水溶液供试品项下的方法作 5 4 5 1 3 具有导管的医疗器具 输血 输液袋等 供试品 取规定量 每个 最小装用 50 100ml 冲洗液分别冲洗内壁 收集冲洗液于无菌容器中 然后照水溶液供试品项下方法作 同时应采用直接接种法进行装中所 配带的针头 针管的无菌检査 5 4 5 2 直接接种法 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检査的 供试品 即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰 精品文档 6欢迎下载6欢迎下载6欢迎下载 酪大豆胨液体培养基中 除生物制品外 一般样品无菌检查时两种培养 基接种的瓶或支数相同 除另有规定外 每个容器中培养基的用量不得 大于接种到该容器中的供试品体积的 10 倍 同时 硫乙醇酸流体培养 基每管装量不少于 15ml 胰大豆胨液体培养基每管装量不少于 10ml 供试品检査时 培养基的用量和髙度同方法适用性试验中确定的 5 4 5 2 1 灭菌医用器具供试品 取规定量 必要时应将其拆散或切成小碎段 等量接种于各管以浸没供试品的适量培养基中 5 4 6 培养及观察 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的 温度培养 14 天 培养期间应逐日观察并记录是有菌生长 如在加入供试 品后或在培养过程中 培养基出现浑浊 培养 14 天后 不能从外观上判 断有无微生物生长 可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中 培养 3 天 观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊 或取培养液涂片 染色 镜检 判断是否有菌 5 4 7 结果判断 5 4 7 1 阳性对照管应生长良好 阴性对照管无菌生长 供试品管都无菌 生长 则供试品符合规定 5 4 7 2 阳性对照管应生长良好 阴性对照管无菌生长 供试品管中有任 意一管有菌生长 则供试品不符合规定 5 4 7 3 阳性对照管应生长良好 阴性对照管无菌生长 供试品管浑浊 经确凿无菌生长 则供试品符合规定 经确证有菌生长 则供试品不符 合规定 5 4 7 4 有以下情况的 判试验无效 5 4 7 4 1 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查 法的要求 5 4 7 4 2 回顾无菌试验过程 发现有可能引起微生物污染的因素 并且已经 确证 5 4 7 4 3 供试品管中生长的微生物经鉴定后 确证是因无菌试验中所用的物 品和 或 无菌操作技术不当引起的 5 4 7 5 试验若经确认无效 则应重试 重试时 重新取同量供试品 依法 精品文档 7欢迎下载7欢迎下载7欢迎下载 检查 若无菌生长 判供试品符规定 若有菌生长 判供试品不符规定 6 相关文件 洁净区尘埃粒子监测操作规程 洁净区沉降菌监测操作规程 实验室洁净区清洁 消毒操作规程 洁净区环境监测管理规程 ZW 型集菌仪使用 维护操作规程 SPX 150 型生化培养箱使用 维护操作规程 MJK 150 型霉菌培养箱使用 维护操作规程 SW CJ 系列洁净工作台使用 维护规程 阳性菌种管理规程 7 记录 无菌检查原始记录 精品文档 8欢迎下载8欢迎下载8欢迎下载 附表 表 1 批出厂产品的最少检验数量 供试品批产量 接种每种培养基的最少检 验数量 100 10 或 4 件 取较多者 100 N 500 10 件医疗器具 5002 或 20 件 取较少者 注 表中最少检验数量不包括阳性对照用的供试品数量 表 2 供试品的最少检验量 供试品供试品装量 每支供试品接入每种培养 基的最少量 外科用敷料棉花及纱布取 100mg 或 1 3cm 缝合线 一次性医用材料整个材料 注 带导管的一次医疗器具二分之一内表面积 医疗器具 其他医疗器具 整个器具 注 切碎或拆 散开 注 如果医疗器械体积过大 培养基用量可再 2000ml 以上 将其整个完全浸没 精品文档 9欢迎下载9欢迎下载9欢迎下载 无菌检查原始记录 薄膜过滤法 检验编号 产品名称型号规格产品数量 产品批号灭菌批号灭菌有效期 来源检品数量检验日期年 月 日 完成日期年 月 日检验依据 无菌检查标准操作规程 检验结果检验结果 培养基 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 配制批号 胰酪大豆胨液体培养基 配制批号 稀释液 冲洗液 稀释液 冲洗液 0 1 蛋白胨水溶液 PH7 0 氯化钠 蛋白胨缓冲液 0 9 无菌氯化钠溶液 其他 配制批号 阳性对照菌菌液 阳性对照菌菌液 取对照菌新鲜培养物 接种至适量的 0 9 无菌氯化钠溶液中 取 1ml 进行 10 倍系列稀释 取稀释液作为对照菌液 对照菌名称 代数 计数结果 cfu ml 仪器设备 仪器设备 ZW 808A 型集菌仪 仪器编号 MJX 150 霉菌培养箱 20 25 仪器编号 SPX 150 生化培养箱 30 35 仪器编号 无菌集菌器 无菌集菌器 批号 生产厂家 净化工作台环境监测净化工作台环境监测 温度 湿度 沉降菌标准 培养温度 30 35 1cfu 皿 碟号 培养时间 123 结果判断 培养 48h 菌落数 培养天数 培养基 1234567891011121314 样品 阳性 硫乙醇酸盐 流体培养基 30 35 阴性 样品 胰酪大豆胨 液体培养基 20 25 阴性 注 逐日观察 集菌器中有菌生长则填 无菌生长则填 结果判定结果判定 本品按 无菌检查标准操作规程 依法检查 结果 精品文档 10欢迎下载10欢迎下载10欢迎下载 检验人 日期 复核人 日期 精品文档 第 1 页 共 2 页1欢迎下载 无菌检查原始记录 直接接种法 检验编号 产品名称型号规格产品数量 产品批号灭菌批号灭菌有效期 来源检品数量检验日期年 月 日 完成日期年 月 日检验依据 无菌检查标准操作规程 检验结果检验结果 第一页 第一页 培养基 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 配制批号 胰酪大豆胨液体培养基 配制批号 稀释液 冲洗液 稀释液 冲洗液 0 1 蛋白胨水溶液 PH7 0 氯化钠 蛋白胨缓冲液 0 9 无菌氯化钠溶液