【毕业学位论文】（Word原稿）ESE中黄酮类物质稳定性研究-化学与环境保护工程

0 本 科 生 毕 业 设 计 (论 文 ) 题目： 黄酮类物质稳定性 研究 on 学单位 化学与环境保护工程学院 姓 名 _ _ 学 号 _ _ 年 级 _2008 级 _ 专 业 _ 制药工程专业 _ 指导教师 _ 职 称 _ 2012 年 05月 04 日 1 目录 摘要 3 引言 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 粉水解方法 7 7 7 7 8 8 8 8 8 9 9 9 10 10 10 3解反应数据 10 1解反应数据 10 11 11 11 解反应数据 11 11 11 12 12 12 2 参考文献 14 附录 16 16 18 器设备 21 致谢 22 3 黄酮类物质稳定性 研究 (西南民族大学 化学与环境保护工程学院，四川 成都 610041) 摘 要： 目的 探究不同水解条件下 方法 以黄酮类物质的保持率为考察指标，不同水解条件为手段， 采用水解温度、水解 酸度 以及水解时间为主要因素进行 三因素三水平正交试验，考察黄酮类物质 水解稳定性 。 薄层层析方法可作为鉴别 黄酮药粉水解产物的方法。 结果 水解酸度对黄酮类物质保持率的影响最大，其次是温度，水解时间 对黄酮保持率的影响最小。水解温度 37、水解时间 5h、人工肠液环境 下 ， 黄酮类物质保持率高达 该条件下黄酮类物质稳定性最佳。而对黄酮类物质稳定性影响最大的条件为水解温度 90、水解时间 1h、 10%盐酸溶液环境，此时黄酮类物质保持率仅有 关键词： 黄酮；水解；稳定性；正交试验 on 10041， To on of SE in by of in to of be to of of of of on of 7 of of in in up 0 of of 0%of 前言 黄酮类化合物 (广泛存在于自然界的一大类化合物，属于植物次级代谢产物，在植物的叶子和果实中小部分以游离形式，大部分与蔗糖合成苷类，以配基形式存在。以前这类化合物主要是指基本母核 2 苯基色原酮(2化合物，现在则是泛指 2个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物 (C C C )。 该类化合物以其生理活性的多样性引起国内外广泛 关注，研究进展很快。到目前为止，已经发现有 5 000多种植物中含有黄酮类化合物，主要是芸香科、唇形科、豆科、伞性科、银杏科与菊科等。 最初这类物质仅用于燃料方面，自 20世纪 20年代，槲皮素、芦丁等黄酮类物质用于临床后，黄酮类化合物的药用功效才引起了人们的广泛重视。 黄酮类化合物最常见的是黄酮醇类和黄酮类。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌 抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效， 对该类化合物的研究已成为国内外研究的热门课题。 日本市场已有不少预防骨质疏松症的 大豆异黄酮制品，如“丰年大豆异黄酮”、“ 。国外根据黄酮类的抗癌机制研制黄酮类抗癌原料药，还针对黄酮类生理功能特点研制对心血管疾病、肾脏病、糖尿病等多种慢性疾病的预防、治疗药物，并研究黄酮类的戒酒功效等。 近些年来随着科学技术的不断发展，科学家对黄酮类物质的研究取得了丰富的成果，但对黄酮类物质生理活性作用机理及成果转化等有待进一步分析研究，特别是在动物体内的消化、吸收、转运、代谢、分布及排泄等方面。 虽然 黄酮类物质具有丰富的生物活性功能的应用，在食品和药品行业的研发中已经取得一定的成果，但 这与黄酮类物质所具有的种类和丰富生物功能是不相 匹 配的，还要进行深入的研究。 在食品行业中，黄酮类物质作为具有保健功能的活性成分，其在抗氧化性、提高机体内分泌、提高学习记忆、清除自由基活性及在细胞信号传导途径中分子机制也在不断研究中，这将有助于进一步黄铜在抗癌、心血管保护等方面作为功能保健食品方面的进一步开发，具有广阔的发展空间。另外，在医药领域，由于黄酮的急性、亚急性毒性远远低于雌二醇，这就决定了其在医药中的发展潜力。总之随着科学技术的不断进步，对黄酮类物质的开发利用也将越来越广泛而深入，黄酮类物质必将在食 品药品等行业有更为广阔的前景 。 俄色树（ 是产于青藏高原东南缘的蔷薇科苹果属高原植物，生长在海拔 3000至3800米之间 ， 属于在无任何污染环境中自然生长的野生绿色无公害药、食两用树，为雪域高原地区独特的稀有树种。 现代研究表明， 含类黄酮，具有降血糖、降血脂 、降血压、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药理作用，无毒无害，对人类的三高疾病的治疗、辅助治疗及预防有重要意义。 6 1 材料与方法 料 试原料 黄酮药粉 要化学试剂 磷酸二氢钾 氢氧化钠 浓盐酸 黄酮水解产物标准品 去离 子水 甲醇 无水乙醇（ 0120208 成都金山化学试剂有限公司） 乙酸乙酯 石油醚 胃蛋白酶 胰酶 展开剂一（石油醚：乙酸乙酯 =1: 展开剂二（ =1:9: 薄层板吸附剂（硅胶 G） 要仪器与设备 （见附录） 法 解溶液配置 按照中国药典（ 2000年版 二部 附录 74）配置人工胃液 ： 取稀盐酸 水 800精密称取胃蛋白酶 10g，加入适量水使之完全溶解 ;将两溶液混合，加水定容 至 1000 按照中国药典（ 2000年版 二部 附录 74） 配置人工肠液： 精密称取 磷酸二氢钾 500 精密称取胰酶 10g，加入适量水使之完全溶解，将两溶液混合，加水定容至 1000 配置 10%盐酸溶液： 取 36%浓盐酸 璃 棒搅拌下缓缓加入到 800水定容至 1000 得。 7 酮药粉水解工艺流程 黄酮药粉水解粗水解产物抽虑烘干 称重 物理水提分离除杂水解产 物 抽虑 烘 干称重计算贮藏 交试验条件 黄酮类物质稳定性受多个因素影响，为了得到其在人体内的稳定性结论，本次 试 验将水解 环 境 、水解时间、水解温度作为考察对象设计三因素三水平的正交试验，以黄酮药粉的保持率为考察指标，进行 4)正交试验。水解上清液与黄酮药粉对照品进行薄层分析，水解沉淀与黄酮药粉水解沉淀标准品进行薄层层析分析。 (见附录： 表 1) 酮药粉水解方法 水解：每组试验均精密称取 00入水解溶液50指定温度下水解指定时间； 抽虑：趁热抽虑，滤渣烘干，滤液存于 50 取样：上清液取样，与药粉对照品点板，以确定是否水解完全； 物理水提洗涤沉淀：烘干后的沉淀称量，加入 (沉淀质量 /g 10)搅拌器上 80搅拌 12热抽虑，并一边用 80去离子水加以洗涤； 称量计算：取抽虑洗涤后的滤渣真空干燥，称量，计算保持率。 *保持率 =(药粉质量 100%（见附录：表 2） 复试验 根据 首次正交试验的数据分析， 选择保持率最低的两组数据 1 即 水解时间 5h、水解温度 70、 10%盐酸 溶液 环境 ，和 水解时间 1h、水解温度 90、 10%盐酸溶液 环境 进行再次选择 ，从中确定一组对 物质保持率的影响最大 的条件作 为终试最佳 条件。 最佳条件重复试验三次，查看其稳定性。重复试验证明，水 解时间 1h、水解温度 90、 10%盐酸 溶液 环 境的一组条件对黄酮类物质的水解稳定性影响 最大。 试放大试验 根据重复 试验所得出的结论 ，对 即 水 解时间 1h、水解温度 90、 10%盐 酸溶液环境的一组条件进行放大实验，同样以水解后黄酮类物质保持率为指标，探究其对 2 方法 与分析 8 交试验 交试验结果 正交试验结果 ,（ 见 附录： 表 2） 果分析 由极差可 以确定 CBA；即水解 酸度 水解温度 水解时间； 3种因素组合为 因此， 定性 最优条件为 水解时间 5h、水解温度 37、人工肠液环境。 而对黄酮类物质稳定性影响最大的条件为 水解温度 90、水解时间 1h、10%盐酸溶液环境。 交试验原始数据记录 解反应 数据 搅拌器加热至 37，称取黄酮药粉 00瓶，另加入人工胃液 50于搅拌器上搅拌水解 1h， 趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于50 搅拌器加热至 37，称取黄酮药粉 00瓶，另加入 10%盐酸溶液 50于搅拌器上搅拌水解 3h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于 50 搅拌器加热至 37，称取黄酮药粉 00瓶，另加入人工肠液 50于搅拌器上搅拌水解 5h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于50 搅拌器加热至 70，称取黄酮药粉 00瓶，另加入人工胃液 50于搅拌器上搅拌 水解 3h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于50 搅拌器加热至 70，称取黄酮药粉 00瓶，另加入 10%盐酸溶液 50于搅拌器上搅拌水解 5h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于 50 搅拌器加热至 70，称取黄酮药粉 00瓶，另加入人工肠液 50于搅拌器上搅拌水解 1h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于50 搅拌器加热至 90，称取黄酮药粉 00瓶，另加入人工胃液 50于搅 拌器上搅拌水解 5h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于50 搅拌器加热至 90，称取黄酮药粉 00瓶，另加入 10%9 盐酸溶液 50于搅拌器上搅拌水解 1h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于 50 搅拌器加热至 90，称取黄酮药粉 00瓶，另加入人工肠液 50于搅拌器上搅拌水解 3h，趁热抽虑，滤渣真空干燥，滤液存于50 样 9组水解上清液各等量取样一份，与黄酮药粉溶于 甲醇 的对照品一起 点样于 3 0- 7 5硅胶 G 板上 ， 以石油醚与乙酸乙酯的体积比为 1:展开剂展开，晾干，将色谱板置 于 紫外灯下观察，根据紫外灯下显示 兰色 荧光的相对位置， 考察上清液中是否还含有黄酮药粉，以此探究水解是否完全； 9组水解沉淀各等量取样一份并溶于等量 乙醇 (分析纯 )，与黄酮药粉溶于 甲醇 的对照品，以及黄酮药粉水解产物溶于 乙醇 (分析纯 )的标准品一起 点样于 3 07 5硅胶 G 板上 ， 以 的体积比为 1:9:干，将色谱板置 于 紫外灯下观察，根据紫外灯下显示 兰色 荧光的相对位 置， 考察水解所得沉淀是否是黄酮药粉水解沉淀以及沉淀中是否还含有黄酮药粉，以此进一步探究黄酮药粉水解是否完全。 点样 结果 ， 如 图 (见附录： 图 1、图 2) 样结论 从薄层板 1(图 1)中可以看出： 9组水解反应所得上清液中除 10% 盐酸 溶液的 3组中不含黄酮药粉以外，其余 6组均有未水解完的黄酮药粉 ，另外， 10%盐酸溶液上清液点样 结果中 有酸点存在 ； 从薄层板 2(图 2)中可以看出： 9组水解反应所得沉淀中只有 3h、 水解温度 90 、 10%盐酸溶液； 水解时间 5h、 水解温度 70 、10%盐酸溶液； 水解时间 3h、 水解温度 70 、人工胃液环境； 及水解时间 5h、 水解温度 90 、人工胃液环境下 所得 的 沉淀才是黄酮水解产物； 综合薄层板 1和薄层板 2所得结论： 9组水解反应中， 10%的盐酸溶液为水解环境，三种水平 下 均完全水解，但其中水解时间 3h、水解温度 37、 10%盐酸溶液条件下所得水解产物与黄酮水解产物标准品不属同一物质；以人工胃液为水解环境，除水解时间 1h、水解温度 37、人工胃液条件下 黄酮药粉不水解或很少水解以外，其余两种水平均为不完全水解；以人工肠液为水解环境，三种水平下黄 酮药粉均不发生水解。 理水提法洗涤沉淀 为进一步计算黄酮类物质的保持率，对抽虑后真空干燥的滤渣 进行洗涤，目的是 为将水解沉淀与未水解的黄酮药粉沉淀分离开来。本试验利用黄酮类物质及其水解产10 物物理性质的不同进行分离： 取烘干后的沉淀称重，转移至 50淀质量 /g 10） 于搅拌器上 80下搅拌加热 12时在恒温水浴锅中准备 大量 80水 以及高温保温的布氏漏斗、 抽滤瓶 ，沉淀趁热抽虑 ，同时 不断用 80水洗涤 余下沉淀，取滤渣真空烘干得到洗涤过后的沉淀，最后一道滤液取样于 50瓶备用。 涤过后的沉淀记录及鉴定 洗涤沉淀记录 (见 附录： 表 3) 涤结论 洗涤后 发现，排除黄酮药粉中未溶于水的杂质 ，只有第 4组、第 5组 、 第 7组 、第 8组所得水解沉淀是黄酮水解产物。 为进一步考察沉淀是否洗净以及洗涤后的沉淀是否是水解产物，继续进行两次点样： 以上 4组沉淀的洗液取样，与黄酮药粉溶于 甲醇 的对照品一起 点样于 3 0 7 5硅胶 G 板上 ，以 体积比为 1:9:晾干，将色谱板置 于 紫外灯下观察，根据紫外灯下显示兰色荧光的相对位置判断最后一道洗液中是否还含有未水解的 黄酮药粉，考察沉淀是否洗净。 上清液 点样结果 （见附录： 图 3） 上清液 点样结论：洗涤过后的 4组上清液中均已不含未水解完全的黄酮药粉，证明沉淀均被洗涤干净。 以上 4组沉淀取样，少量溶于 甲醇 并与黄酮水解沉淀标准品一起 点样于 3 0- 7 5硅胶 G 板上 ，以石油醚 :乙酸乙酯体积比为 1： 展开剂展开，晾干，将色谱板置 于 紫外灯下观察，根据紫外灯下显示兰色荧光的相对位置以进一步确认洗涤后的沉淀是否是黄酮水解产物。 沉淀 点样结果（见附录： 图 4） 沉淀点样结论：洗涤过后的 4组沉淀是均洗净的黄酮水解产物。 复试验 原始数据记录 3解反应数据 搅拌器加热至 90，称取黄酮药粉 00加入人工胃液50于搅拌器上搅拌水解 5h，趁热抽虑，滤渣真空干燥， 称重， 物理水提洗涤沉淀， 得到 产物 1解反应数据 搅拌器加热至 90，称取黄酮药粉 100加入 10%盐 酸 11 溶液 50于搅拌器上搅拌水解 1h，趁热抽虑，滤渣真空干燥 ，称重， 物理水提洗涤沉淀， 得 到 产物 保持率计算 保持率 =(药粉质量 100% 保持率 =( 100%=保持率 =( 100%=佳方案重复试验 根据选择以上两组条件的试验数据，在此证明黄酮药粉在 即 水 解时间 1h、 水解温度 90、 10%盐酸溶液环境下稳定性受到的影响最大，选择该条件作为终试条件进行三次重复试验，取其平均值为影响数据 。（见附录：表 4） 大试验原始数据记录 大 水解反应数据 搅拌器加热至 90，称取黄酮药粉 50g 于 1000加入 10%盐酸溶 液 500于搅拌器上搅拌水解 1h，趁热抽虑，滤渣真空干燥， 称重，液取样备 用； 样 水解上清液取样少量 ，与黄酮药粉溶于 甲醇 的对照品一起 点样于 3 07 5硅胶 G 板上 ， 以石油醚与乙酸乙酯的体积比为 1:干，将色谱板置 于 紫外灯下观察，根据紫外灯下显示 兰色 荧光的相对位置， 考察上清液中是 否还含有黄酮药粉，以此探究水解是否完全；水解沉淀 取样少量 并溶于等量 乙醇 (分析纯 )，与黄酮药粉溶于 甲醇 的对照品，以及黄酮药粉水解产物溶于 乙醇 (分析纯 )的标准品一起 点样于 3 07 5硅胶 G 板上 ， 以 的体积比为 1:9:展开剂展开，晾干，将色谱板置 于 紫外灯下观察，根据紫外灯下显示 兰色 荧光的相对位置， 考察水解所得沉淀是否是黄酮药粉水解沉淀以及沉淀中是否还含有黄酮药粉，以此进一步探究黄酮药粉水解是否完全。 点样结果，如图 (见附录： 图 5、图 6) 样结论 在水 解时间 1h、水解温度 90、 10%盐酸溶液环境下，黄酮药粉完全水解沉淀与 水解产物标准品系同一物质 12 理水提法洗涤沉淀 取烘干后的沉淀 转移至 50010搅拌器上 80 下 搅拌加热 12时在恒温水浴锅中准备大量 80水以及高温的布氏漏斗和抽滤瓶，沉淀趁热抽虑 ， 并不断用 80水洗涤余下沉淀，取滤渣真空烘干得到洗涤过后的沉淀，称重，得到产物 持率计算 放大 保持率 =(50 100%=3 结论和总结 此次 正交试验得出结论： 影响因素 的 大小顺序为： CBA；即水解酸度 水解温度 水解时间； 3种因素组合为 因此， 定性 最优条件为 水解时间 5h、水解温度 37、人工肠液环境，而稳定性最差的条件为 水解时间 1h、水解温度 90、 10%盐酸溶液环境。 的稳定性较差 , 为保证产品的 质量 , 在 制备 加 工过程中应尽量减少高温和强酸处理； 低温条件有利于提高 酮 类物质 的酸稳定性 ，黄酮稳定性受时 间的影响较小 ； 进一步研究黄酮类物质在 人体中的代谢提供了一定依据； 人工胃液试验：试验最初用不加胃蛋白酶的环境进行水解， 证明在 37的人 体 温 度 环境下水解 1h 并未得到黄酮水解产物。之后加入胃蛋白酶仍然 未 对水解反应产生明显影响。考虑到药品在人体胃液中停留时间为 2至 3小时，于是 再 做附加试验将人工胃液环境， 37体温条件下水解 2浊液 样 品溶于甲醇 分别与 黄酮药粉对照品和黄酮水解沉淀标 准 品点样，未发现水解迹象。继续反应至 3h 取悬浊液样品溶于甲醇分别与黄酮药粉对照品和黄酮水解沉淀标 准 品 点样，仍未发现水解迹象。故得出结论：在人工胃液环境下，影响黄酮保持率的主要因素不是 水解时间； 人工胃液试验：试验最初用不加胰酶的环境进行水解，证明 在 37的 人 体 温 度 环境下水解 5，之后 加入胰酶 ， 仍然未对水解反应产生明显影响。考虑到药品在人体肠液中停留时间为 4至 5小时，于是 再 做附加试验将人工肠液环境， 37体温条件下水解 4样，未发现水解迹象。继续反应至 5 品点样，仍未 发现水解迹象。 故得出结论：在人工肠液 环境下，影响黄酮保持率的主要因素不是水解时间。 另外还发现，不加胰13 酶与加胰酶的水解现象有所不同，不加胰酶时体温水解后得到沉淀为棕红色 (洗涤前 )，加入胰酶后 ，人 体温 度 水解所得沉淀呈土黄色 (洗涤前 )； 洗涤沉淀方法探讨： 试验过程经历了多次寻找可 以将水解产 物和黄酮药粉分离开的有机溶剂，但都因为放大试验后无法有效 地 将两者分离而失败。黄酮药粉经多次试验在高温下能完全溶于水，而水解产物是在高温下才产生的，故想到将两者的混合沉淀加入高温纯水中搅拌分离，此时黄酮药粉完全溶于水而水解产物不 溶，趁热抽虑 ， 即可将两者分离开来。最初在 70条件下加热搅拌 30虑到搅拌时间不宜过长，否则 水解产物也可能部分溶解，故改为 80条件下搅拌 12酮药粉全部溶于水中并且水解产物在此时几乎不溶。最后利用这种物理方法成功将两者分离开来，分离的产物得到验证已经洗涤干净。 14 参考文献： 1 董彩军 ,李锋 A,农产品加工学刊 ,2010(2)： 652 彭程程 ,王青山 ,赵国祥 ,等 进展 A,农产品加工学刊 ,2010(5)383 3 张雁 A,华南师范大学学报 ( 自然科学版 ),2001,59(4):594 李超 ,王卫东 ,王乃馨 ,等 A,技术 食品工程 ,2010(9):1405 孟志芬 ,郭雪峰 ,蒋莹 A,光谱实验室 ,2008,25(4):6556 赵莹 ,张建平 ,赵永光 ,等 A,河北科技 师范学院学报 ,2008,22(3):307 蒋大海，田娟娟，宋宏哲 ,等 A,粮食与食品工业 ,2008， 15(1)：258 张嫦 ,刘东 ,王晓玲 正交试验法优化香柏 (变种 )中总黄酮提取工艺 ,食品研究与开发 ,2012,33(1)： 479 陈丽 ,刘密 ,南希 正交设计优选菟丝子中总黄酮的提取工艺 A,药学研究 ,2011,24(4):45210 李洪福 ,刘明生 ,张小坡 ,等 A, 海南医学院学报 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