实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌.ppt

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌 实验目的 学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法为下一步重组体筛选做准备 实验原理 遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状 分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞 使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力 从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来 这个过程就是转化 将重组质粒转化进受体细菌时 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 大肠杆菌细胞经过一些特殊方法 电击法 CaCl2等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞 Competentcells 转化 Transformation 是将外源DNA分子引入受体细胞 使之获得新的遗传性状的一种手段 它是微生物遗传 分子遗传 基因工程等研究领域的基本实验技术 0 1mol LCaCl2是一种低渗溶液 在0 低温处理大肠杆菌细胞时 细胞膨胀成球形 DNA可吸附在其表面 在短暂的热冲击 如42 下 细胞可吸收外源DNA 为了鉴定这些转化子 须利用质粒编码的筛选标记 这些标记赋予细菌新的表型 是成功转化的细菌很容易被筛选出来 pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因 Ampr 其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长 而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长 Ampr 氨苄西林抗性基因 内酰胺酶 多克隆位点 MCS 外源DNA片段的插入位点 Amps菌株 Ampr 涂布于含Amp的培养基上 可以生长 次日可见白色菌落 转化子 培养基上含有X Gal和IPTG时 可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子 pET32a pET32a 结构的三大要素 多克隆位点选择标记 耐药性 LacZ 复制起始位点种类 质粒噬菌体酵母人工染色体 YAC 反转录病毒载体表达载体等 pET 32aVector ThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE coli pET 32cloning expressionregion Vector pET 32a Genefragment SmPR10 pET32a SmPR10 材料 设备及试剂 材料E coliDH5 菌株 R M Amp 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 R M 它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代 pET32a SmPR10质粒DNA 浓度 2ng l 实验室自制设备恒温摇床 电热恒温培养箱 台式高速离心机 超净工作台 低温冰箱 恒温水浴锅 分光光度计 微量移液枪 12 可编辑 试剂1 LB固体和液体培养基LB培养基配方 单位g L 胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10琼脂粉 1 5 15g 注 LB液体培养基不加琼脂粉 按配方称量药品 加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml 用NaOH调节pH至7 0 121 湿热高压灭菌20分钟 待冷却至60 左右 在超净工作台中加入一定量的Amp储存液 使终浓度为100 g ml 摇匀后用培养皿铺板 2 Amp母液 称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中 0 22 m滤器过滤除菌 用1 5ml离心管分装后储存于 20 冰箱 3 0 1mol LCaCl2溶液 称0 56gCaCl2 无水分析纯 溶于50ml重蒸水中 定容至100ml 用0 22 m滤器过滤除菌或高压灭菌 EP管分装于4 冰箱储存 4 pET32a SmPR10质粒 实验室自制 操作步骤 一 受体菌的培养1 取 70 或 20 贮存的大肠杆菌DH5 菌种 在LB培养液中培养过夜 进行活化 2 取几微升活化后的菌液 取量视菌的密度而定 在LB平板上涂布 于37 培养箱中培养24h 从LB平板上挑取单菌落 接种于3 5mlLB液体培养基中 37 下振荡培养12小时左右 直至对数生长后期 3 将该菌悬液以1 100 1 50的比例接种于LB液体培养基中 37 振荡培养2 3小时至OD600 0 5左右 生长对数期 注 这一步非常关键 培养过度的菌液含有较多的 老 细胞 制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低 从而导致转化率降低 二 感受态细胞的制备 CaCl2法 1 将菌液转入1 5ml离心管中 冰上放置10分钟 然后于4 4000rpm离心10分钟 2 弃去上清 用预冷的0 1mol L的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞 冰上放置10分钟后 4 4000rpm离心10分钟 3 弃去上清 加入0 1ml预冷的0 1mol L的CaCl2溶液 轻轻悬浮细胞 每份100 l 注意悬液密度要均匀 冰上放置备用 4 暂时不用的感受态细胞可置于 80 保存 注 CaCl2处理后的细胞比较脆弱 尽量温柔操作 三 重组质粒DNA的转化质粒和感受态细胞混和 在100 l感受态细胞悬液中加入5 l重组质粒DNA pET32a SmPR10 轻轻混匀后冰上放置30分钟 热击 42 水浴中热击60秒 注 精确计算时间 热击过长将对细胞造成伤害 热击后马上置于冰上冷2 5分钟 复苏 向每管中加入800 lLB液体培养基 注 不含Amp 混匀后在37 150rpm轻摇培养1小时 使细菌恢复正常生长状态 并表达质粒编码的抗生素抗性基因 Ampr 思考 热击后的细胞已吸入外源质粒 如本实验中的pET32a 该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性 但是为什么复苏时用的LB培养液不加Amp 四 涂布平板筛选转化质粒将管中培养液摇匀后取100 l均匀涂布于含Amp的筛选平板上 注 将培养液摇匀后涂布 2 正面向上放置半小时 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿 37 温箱中培养过夜 次日观察实验结果 预期实验结果 感受态细胞 重组质粒 0 1MCaCl2 重组质粒 感受态细胞 无菌水 实验报告 思考题 1 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些 2 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落 你将如何解释这种现象 实验中要考虑的重要因素 为了提高转化效率 实验中要考虑以下几个重要因素 1 细胞生长状态和密度 不要用经过多次继代或储于 的培养菌 最好从 70 或 20 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好 可通过监测培养液的OD600来控制 DH5 菌株的OD600为0 5时 细胞密度在5 107个 ml左右 不同的菌株情况有所不同 这时比较合适 密度过高或不足均会影响转化效率 2 质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA cccDNA 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时 转化效率就会降低 10ng的cccDNA即可使100 l的感受态细胞达到饱和 一般情况下 DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 3 试剂的质量 所用的试剂 如CaCl2等均需是高纯度的 GR 或AR 并用超纯水配制