6氨基移换反应及其产物的鉴定.doc

专业： 姓名： 孙程珂 学号： 3150100531 日期： 地点： 装 订 线实验报告课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 成绩： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2、学习纸层析的原理和操作技术。二、实验内容和原理1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性较高。GPT催化下的转氨基反应为：L谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L谷氨酸氧化脱NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L谷氨酸。本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。2. 纸层析原理： 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。装 订 线P.2实验名称：_ _姓名： 学号： 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=X/Y 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。3. 茚三酮的显色原理： 所呈现的颜色随反应的条件(酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等)不同而异，本实验中其颜色的深浅主要与谷氨酸/丙氨酸的浓度有关。三、实验材料和主要仪器1、实验材料： 动物肝脏(牛蛙肝或猪肝）2、实验试剂： 0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）； 0.1mol/L丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）； 0.1mol/L酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）； 0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）； 展层溶剂酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）； 10三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； 0.25%碘乙酸（抑制L谷氨酸脱氢酶活性）； 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。3、 实验仪器 研钵； 试管及试管架； 恒温水浴箱（37、100）； 铅笔、尺和圆规； 毛细管（直径0.5mm)； 新华定性滤纸（直径11cm）； 剪刀和镊子； 电吹风； 滴管； 康氏皿； 喷雾器。四、实验方法和步骤1、转氨酶液的制备 取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按表1操作3、层析 准备：取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)。另取2cm3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。 点样： 用毛细管依次点标准丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次，其余14号管样液各点23次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。 展层、显色： 将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中, 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，用电吹风热风吹干显色3min。5、 实验数据记录和处理6、 实验结果和分析1号反应管：虽然有两种底物，但是转氨酶提前100变性失活了，也没有发生氨基移换反应。只有一条丙氨酸的显色带。2号反应管：只有单一底物丙氨酸，没有发生氨基移换反应。所以只有一条丙氨酸的显色带。 3号反应管：只有单一底物酮戊二酸，没有发生氨基移换反应。所以没有出现显色带。但仔细观察可以发现有极少量谷氨酸的显色带，可能是由于滤纸“灯芯”遭到1号反应管中样品的污染或者酶液中本身存在的少量谷氨酸。 4号反应管：部分丙氨酸将氨基转移给酮戊二酸，生成了谷氨酸，所以有丙氨酸和谷氨酸两条显色带。 5号丙氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色（半径较大）显色带6号谷氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色（半径较小）显色带。 7、 实验讨论和心得1、 整个操作过程中勿用手直接接触层析用的定性滤纸和纸质灯芯，需要带手套操作。 2、 点样时，要待前次点样干燥后方可再次点样，点样点尽量小而圆，直径不超过0