细胞凋亡原理

流式细胞仪技术概述流式细胞仪技术概述 适当染色后其成分所发出的散射光和荧光 经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度 光源的焦点 当每个细胞经过焦点时 发出一束散射光 或荧光 它们经过过滤及光镜系统 收集到达一个光电检测器 光电倍增管或一个固态装置 光检测器把散射光定量转化成电 信号 经数字转换器进行数字化后而成整数 然后进行电子存储 以后数据可以调出显示 和进行分析 其优点如下 1 具有操作简便 只要将染色的单个细胞推入仪器中 就会得出数据 2 具有较高的灵敏度及测定速度 而且每次可测出许多数据 一般情况下 每秒可 测 5000 个细胞 能迅速分析和记数大量细胞 并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例 3 应用广泛 即可用于测定细胞活力 繁殖周期和细胞定型分析 也可区别死亡细 胞 分裂细胞和静止细胞群 既可测定 DNA 和 RNA 测凋亡峰 又可测蛋白含量 特别 是胞浆蛋白 一 样品的制备一 样品的制备 流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号 因此 细胞必须做成单个细 胞悬浮状态 不能聚集 也不允许有细胞碎片存在 所用染料必须特异 如特异单抗 而且不允许渗透至载液中 标本如果是属于淋巴细胞等血细胞 骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系 要经 Ficoll 分离 作单细胞分离处理 但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞 需采 用酶消化法 胰蛋白酶 胶原酶等 化学法 EDTA EGTA 和柠檬酸盐 消化分散液或洗 液最好用无钙 镁 PBS 柠檬酸盐的浓度为 40 mol L 并同时采用机械分散法 将经消 化处理的膨松组织 用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可 用 PBS 洗 2 3 次后重悬 最 好过一下尼龙或不锈钢网筛 100 m 和 20 m 细胞浓度要保证在 1 2 106 mL 若标本用于测定单个细胞 需加入 1 5 mg L 的 DNAase 将有助于阻止破碎细胞释放的 DNA 造成细胞再聚集 但是若分离 的细胞要作 DNA 含量测定之用时 则切勿加 DNAase 二 悬浮细胞的固定二 悬浮细胞的固定 上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析 如果染色和流式分析要拖后进行 或为 了提高染色效果 则要将细胞预固定 乙醇固定是常用的方法 1 固定方法 1 甲醛法 在细胞悬液中加入等量的 8 甲醛 用 Hank S 液配 4 下固定 12 18 小时 2 乙醇法 细胞悬于 PBS 中 缓慢加入 20 预冷的 95 乙醇 使终浓度为 70 冰浴 30 分钟 3 丙酮法 于细胞悬液中 缓慢加入冷丙酮 使终浓度为 85 2 实例 1 用预冷的无钙 镁含 0 5mmol L EDTA 的磷酸盐缓冲液 将细胞制成 1 106 细胞 的悬液 2 在 4 下逐滴加入 3 倍体积的 95 乙醇 连续搅拌使乙醇终浓度达 70 3 该细胞可在 4 下保存数日 4 分析前先用 1000r min 离心 10 分钟 弃去乙醇 再将细胞悬于 PBS 中或要求的 试剂中 三 流式细胞仪分析的应用三 流式细胞仪分析的应用 一 非染色细胞的光散射 一个粒子 如细胞 出现在一束光线中 立即会干扰该光束 造成该光束入射光的重分 布 该细胞所获能量则以衍散 折射 反射等复杂的参数形式重新发射出来 这些参数与 细胞体积 表面构象 内部结构形成函数关系 可测低角前面约 10 的光散射及 90 的光散 射 一般认为 90 位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响 而低 角前面 10 位置的光散射则主要代表细胞大小 光散射测量方法如下 1 将细胞悬浮于 HBSS 中 浓度介于 1 106 2 106 mL 浓度之间 2 以悬浮细胞平衡盐溶液 HBSS 充满含鞘液的细胞贮藏池 3 设定细胞流量为 500 个 S 秒 以获得最佳测定结果 二 染色法 1 细胞的碘化丙锭 propiolium iodide PI 染色 PI 和 EB 溴化乙锭 为同类物质 与 EB 一样 PI 嵌入 DNA 双螺旋中 可使荧光强度 增加约 20 倍 PI 的荧光强度约为 EB 染色的 1 8 倍 以 488nm 波长激发 DNA PI 复合 物最大的发射波长约为 615nm 1 1 小鼠 Lewis 肺癌细胞 3LL DNA 含量测定方法 1 从 C57BL 6 小鼠上切除肿块 在培养皿内用 PBS 冲洗 2 去除结缔组织及脂肪 剪碎肿块 3 小碎片移入 1 20 38mm 注射针 加压使其通过 于 4 条件下重悬细胞于 HBSS 中 4 将 200 300 L 细胞悬液 5 105 细胞 mL 中加入 3mL PI 50 g mL 染色 3LL 细 胞 于 4 存放 20 30 分钟 5 测定 580 750nm 之间的发射荧光 以去除末结合 PI 产生的激发光与发射光谱线 之间的重叠部分 注 PI 染色液 0 1 柠檬酸钠 1000mL PI5mg 1 Nonide P40 水 1 2 培养细胞 DNA 的流式细胞仪分析 1 从培养皿中吸去培养基 以 HBSS 冲洗二次 2 加入 PI5mL 于培养皿中 在 4 放 10 分钟 3 用吸管反复次打细胞 使细胞破坏 胞核释放出来 再行流式细胞仪分析 1 3 完整细胞 DNA 的 PI 染色 1 70 乙醇固定的细胞悬液 离心 去固定液 2 室温条件下加入 PI 染色一批细胞 105 106 细胞 mL 时间为 30 分钟 然后 行流式细胞仪分析 1 4 光辉霉素和 PI 的 DNA 染色 在荧光抗生素光辉霉素和 PI 联合染色过程中 光辉霉素的供体分子被 PI 的受体分子 接受产生能量转移 该染色技术主要用于实体肿瘤组织 精子细胞及妇科标本 同时也适 用于体外培养的细胞 1 分离制备的细胞悬液即可使用 若用 70 乙醇固定可保存一周 2 以 PI 光辉霉素染色 4 1 小时 PI 为 10 mg L 光辉霉素为 10 mg L 3 染色后进样 以 100W 汞灯作为激光光源 使用 BG123nm 阻断滤片 叠加 K590 型高通滤法 one seep filter 2 DNA 和 RNA 的鉴别染色 利用吖啶橙的变色特性可鉴别 DNA 和 RNA 吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色 固定 非固定细胞核酸 或作溶酶体的一种标记 观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别 分裂细胞和静止细胞群体 虽然测定 DNA 和 RNA 含量时较难获得好的重复性结果 但该 方法已被许多实验室广泛采用 方法如下 1 试剂 溶液 A 低温保存 稳定期约 2 周 Triton X 100 0 1 0 1mL 1mol L HCL 8mL 1mol L NacL 15ml 蒸馏水 76mL PH1 5 100mL 溶液 B 稳定期数月 最好除菌以后 高压或过滤 贮存 0 01mol L EDTA10mL 1mol L Nacl15mL 0 4mol L Na2HPO4 31 5mL 0 2mol L 柠檬酸 18 5mL 蒸馏水 24mL 总体积为 99mL pH6 0 吖啶橙母液 用吖啶橙 蒸馏水配成 1mg mL 致癌物 应小心 吖啶橙应用液 0 1mL 母液加 9 9mL 溶液 B 稀释 注意 仪器鞘流系统应保持 4 氩激光激发波 488nm 红色荧光为 DNA F 600nm 绿色荧光为 RNA 或单链 DNA F 5 30nm 2 方法 用含 15 血清的 PBS 配制细胞悬液 取 0 2mL 8 106 细胞 mL 加入 0 4mL 溶 液 A 4 放置 45 60 秒 加 1 2mL 含吖啶橙的溶液 B 室温 2 分钟 应在加入溶液 B 后 10 分钟内进流式细胞仪分析 注意 细胞数保持恒定 核酸与吖啶橙的比例 染色时间及温度 三 染色法的应用 1 变性及双链 DNA 的鉴别染色 1 试剂 HBSS 内含 1000u mL RNA 酶 A 0 2mol L KCl pH1 35 吖啶橙用 0 1mol L 柠檬酸配成 5 mg L 16 7 m 0 2mol L Na2HPO4 缓冲液 pH2 6 2 106 细胞悬于 1mL HBSS RNase 液中 37 温育 1 小时 将 0 2mL 细胞悬液 含 4 105 细胞始终悬浮于 HBSS RNase 与 0 5mL 0 2mol L K Cl pH1 35 混匀 20 30 分钟 加 2mL 吖啶橙染色 2 分钟 绿色荧光 530nm 和红色荧光 600nm 分别代表细胞中单链及双链 DNA 含量 2 DNA 与癌基因探针双标记测定 这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物 然后用 PI 标记 DNA 现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤 1 制备白血病细胞悬液 用 100 甲醇在 20 固定 10 分钟 2 取 50 l50mg L 的癌基因探针 Y13 25 它是一种广谱单克隆抗体 可特异性地直接 与 N ras Ki ras 和 Ha ras 三种癌基因编码的 21Kd 蛋白相结合 4 作用 30 45 分钟 3 用 PB 离心洗涤 2 次 重悬浮于 50 L HBSS 中 含 0 1 叠氮钠和 2 小牛血清 4 加入 50 L 1 200 兔抗鼠 IgG 4 放置 30 45 分钟 5 同 3 洗涤后加入 50 L 1 40 的 FITC 标记的羊抗兔 IgG 4 反应 30 45 分钟 6 同 3 洗涤后 细胞用 RNA 酶消化 室温 20 30 分钟 7 同 3 洗涤后 用 PI 染液染 20 分钟 8 同 3 洗涤后 用 488nm 激发波长测定 FITC 染色显示 ras 癌基因表达产物 PI 染色显示 DNA 含量 注意事项 制备样品时 离心次数不宜过多 防止细胞丢失和凝集 细胞固定时间不宜过长 不要用冰醋酸 乙醇 苦咪酸及汞固定剂 为了降低本底 应将细胞表面未结合的荧光染料洗净 进行双标记沉淀时 应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素 3 以溴化脱氧尿嘧啶 Brdu 和 Hoechst33258 染料进行细胞周期分析 1 试剂 用培养基配制 33 mg L Brdu 及脱氧细胞苷 26 4g mL 染色液 Hoechst33258 溶于 PBS 细胞染色 24 小时后进行分析 据报道染色的稳 定时间在 30 分钟至 24 小时之间 2 方法 将 Brdu 溶液按 1 10 加入细胞培养液中 根据细胞周期时间不同 选择不同时间培养的细胞 孵育后 摇散细胞以传代培养 直接用染液重悬细胞 进入流式细胞仪分析 Hoechst33258 荧光值在 410 580nm 之间 需用 330 360nm 紫外光激发 应特异 性结合腺嘌呤 胸腺嘧啶碱基对 因此 不仅特异性标记 DNA 亦可标记胸腺嘧啶 在细 胞周期分析时 在与细胞孵育过程加入 Brdu Brdu 可替代 DNA 中的胸腺嘧啶 因此 处 于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态 并在分裂后 G1 峰的半峰处产生一新峰 此 项技术可用于直接测定细胞 G2 期及分裂时间 4 Hoechst33342 染色活细胞 DNA 1 试剂 Hoechst 33342 用蒸馏水配成 0 25mol L 2 方法 制备 106 m 细胞悬液 以 Hoechst33342 染色 浓度为 5 10 mg L 室温下 20 分钟 分析前切勿洗涤细胞 Hoechst33342 可用作细胞 DNA 的活体染料 据信可在保持细胞活性的同时 呈现 出相当好的 DNA 化学计量关系 激发波在紫外范围 350 363nm 之间 发射波则在 450n m 处 5 以异硫氰酸荧光素 Fluorescein Isothiocyante FIFC 染色蛋白质 1 试剂 异硫氰酸荧光素 FIFC 用含 40 mg L RNase 的 PBS 配成 0 1 1 0 mg L 浓度 2 方法 染色前用终浓度 70 乙醇固定细胞 至少 18 小时 离心固定细胞 弃去固定液 室温下用 FIFC 染色细胞蛋白 30 分钟 流式细胞仪分析 使用氩激光 激发波长 488nm 荧光发射波长 515 535nm 也可于固定细胞中 以 18 mg L 0 1 柠檬酸盐配制 和 0 05 mg L FIFC 含 40 mg LRNase PBS 配制 染色 20 分钟以上可对 DNA 和蛋白质双重染色 分别呈现红色荧光 DNA 和绿色荧光 蛋白质 6 荧光素抗体的应用 该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞 可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体 处理上述细胞 也可用于测定胞浆中的蛋白质 如凋亡 BCL 2 蛋白 抗病毒蛋白 MXA 等 后者在细胞凋亡章节中已介绍从略 用磷酸盐缓冲液 Eagle sMEM 稀释 FIFC 连接的抗体内含 0 1 叠氮钠 2 牛血清 为判定 FIFC 抗体的最适度的稀释浓度 向微量滴定板的细胞中加入 50 L 不同浓度的稀释 液 再以荧光显微镜确认最佳染色浓度 使用抗人 LEU I 抗体分析时 应稀释成 5mg L 或 0 25 mg L 无论鼠或人细胞在 2 107 浓度时其存活率应在 90 以上 方法 1 于微量滴定板加入 50 L 抗体稀释度 再加入 50 L 细胞悬液 混匀 2 冰浴 45 分钟 离心滴定板 1500r min 10 分钟 3 弃上清 以培养基 100 L 洗涤细胞沉淀 2 次 每次洗涤后用 1500r min 10 分钟 弃上清 4 以 1ml 预冷的培养基配成 1 106 细胞 mL 的已染色细胞悬液 进样前持续保持冷 环境 4 目前流式细胞仪 FCM 已在各学科中获得应用 细胞生物学 定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞 分析生物大分子 如 DNA RNA 抗原 癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系 进行染色体核型分 析 并可纯化 X 或 Y 染色体 肿瘤学 DNA 倍体含量测定是鉴别良 恶性肿瘤的特异指标 近年来已应用 DNA 倍体测定技术 对白血病 淋巴瘤及肺癌 膀胱癌 前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测 用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞 免疫学 研究细胞周期或 DNA 倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系 进行免疫 活性细胞的分型与纯化 分析淋巴细胞亚群与疾病的关系 免疫缺陷病如艾滋病的诊断 器官移植后的免疫学监测等 血液学 血液细胞的分类 分型 造血细胞分化的研究 血细胞中各种酶的定量分 析 如过氧化物酶 非特异性酯酶等 用 NBT 及 DNA 双染色法可研究白血病细胞分化成 熟与细胞增殖周期变化的关系 检测母体血液中 Rh 或抗 D 抗原阳性细胞 以了解胎儿 是否可能因 Rh 血型不合而发生严重溶血 检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫 性疾病 如红斑狼疮等 药物学 检测药物在细胞中的分布 研究药的作用机制 亦可用于筛选新药 如化 疗药物对肿瘤的凋亡机制 可通过测 DNA 凋亡峰 Bcl 2 凋亡调节蛋白等 流式细胞仪检测细胞凋亡 PI 单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞 亚细胞和分子水平上所发生的特征 性改变 这些改变包括细胞核的改变 细胞器的改变 细胞膜成分的改变和细 胞形态的改变等 其中细胞核的改变最具特征性 主要包括以下几个方面 1 细胞核的改变 由于凋亡细胞核的改变 造成各种染色体荧光染料对凋亡细 胞 DNA 可染性发生改变 研究表明 用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细 胞进行染色 其 DNA 可染性降低 许多学者把这种 DNA 可染性的降低认为是凋 亡细胞的标志之一 2 光散射特性 凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性 在流式细胞仪 上 前散射光与细胞的大小有关 而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用 与细胞内的颗粒多少有关 在细胞凋亡时 细胞固缩 体积变小 故前散射光 降低 这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一 此外细胞凋亡时由于染色 体降解 核破裂形成 细胞内颗粒往往增多 故凋亡细胞侧散射光常增加 细 胞坏死时 由于细胞肿胀 其前散射光增大 侧散射光在细胞坏死时也增大 因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞 但需要注意的是 根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性 和核胞浆比率影响很大 因此在某些淋巴细胞凋亡中 用光散射特性检测凋亡 的可靠性较好 而在肿瘤细胞凋亡中 其可靠性就较差 根据光散射特性检测 凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起 来 用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型 也可用于活细 胞的分类