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第三章 细胞工程基本技术 1 实验室条件 1 1 实验室基本组成实验室基本组成 动物工程实验室一般来讲 应能进行以下六个方面的工作 无菌操作 培养 制备 清洗 消毒灭菌处理 储藏 实验室基本组成实验室基本组成 准备室 无菌操作室 更衣间更衣间 缓冲间缓冲间 操作间操作间 操作间 培养室 分析室 1 2 实验用品及主要设备实验用品及主要设备 超净工作台 超净工作台 laminar flow cabinet 侧流式 垂直式 侧流式 垂直式 外流式 水平层流式 外流式 水平层流式 倒置显微镜倒置显微镜 电热干燥箱电热干燥箱 electric drying oven 水纯化装置水纯化装置 冰箱冰箱 icebox 压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器 细胞计数板细胞计数板 hemocytometer 电子细胞计数仪电子细胞计数仪 electronic cell counter 过滤除菌装置过滤除菌装置 离心机离心机 1 2 动物细胞工程实验室的常用设备动物细胞工程实验室的常用设备 CO2 培养箱培养箱 培养箱培养箱 incubator 细胞融合仪 cell fusion system 程序化冷冻仪 programmed freezing machine 液氮容器 liquid nitrogen tank 细胞冷冻储存器 培养皿 培养瓶 培养板 旋转培养器 培养用器皿 手术器械手术器械 植物细胞工程实验室的常用仪器设备植物细胞工程实验室的常用仪器设备 光照培养箱 人工气候室 摇床 培养瓶 液体储存瓶 吸管 培养皿 培养瓶与培养板 烧杯 量筒 漏斗 注射器等 玻璃器皿 1 3 实验室的生物安全实验室的生物安全 培养物不受污染 培养物不会对实验人员和环境造成污染 不同危害群的微生物必须在不同的物理性防护条件下进行操作 物理性防护时有个力的设 备 实验室的设计及实验实施等三个方面组成 根据密封程度的不同分为四个安全等级 P1 P2 P3 和 P4 P1 实验室 与人类成人健康和疾病无关 P2 在人类所引起的疾病很少是严重的 而且通常有预防及治疗的方法 P3 在人类可以引起严重或致死的疾病 可能有预防和治疗的方法 P4 在人类可以引起严重或致死的疾病 但通常无预防和治疗的方法 如炭疽杆菌 本节需要掌握的内容 细胞工程实验室的基本组成 细胞工程实验室常用的仪器设备 2 无菌技术 2 1 1 玻璃器皿的清洗 一般玻璃器皿的清洗包括浸泡 刷洗 浸酸和冲洗浸泡 刷洗 浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿要求干净 透明 无油迹 且无任何残留物质 2 2 灭菌方法 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌 真菌和病毒等微生物的污染 污染主要是由于 操作者的疏忽而引起 常见的原因有操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不 合格或不彻底等 消毒方法分为物理灭菌法 化学消毒法 使用抗生素 2 2 1 物理灭菌法 应用范围应用范围 用于空气 操作台表面和不能使用其他方法进行消毒的培养器皿 作用机理作用机理 破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其灭活 间接作用是通过紫外线照射产生的 臭氧杀死微生物 1 紫外线消毒 效果效果 紫外线直接照射 方便 效果好 经一定的时间照射后可以消灭空气中大部分细菌 空气中 革兰氏阴性菌最为敏感 其次是革兰氏阳性蓖 再次是芽孢 真菌孢子的抵抗力 最强 注意事项注意事项 操作距离 对人体的伤害 2 湿热消毒 即高压蒸汽消毒 是一种使用最广泛 效果最好的消毒方法 湿热消毒时 消毒物品不能 装得过满 应保证其内气体的流通 以防止消毒器内气体阻塞而发生危险 应严格按照操作手册进行消毒操作 3 过滤除菌 将液体或气体用微孔薄膜过滤 使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留 从而达到除菌的目 的 应用范围 大多用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养用液 4 干热消毒 是将电热烤箱的物品加热到 160 C 以上 并保持 90 120MIN 以杀死细菌和芽孢 主要用 于消毒玻璃器皿 注意 消毒完后不能马上将烤箱门打开 以免温度骤冷而使玻璃器皿破裂 优点 消毒后的器皿干燥 易于储存 缺点 热传导慢 2 2 2 化学消毒法 化学消毒法是利用化学消毒剂来消毒那些不能用物理消毒等方法进行消毒的物品和场地 如无菌室的空气 台面 操作者的皮肤等 消毒剂主要是酒精 甲醛 环氧乙烷 氯已定 戊二醛 碘伏和磺酊 过氧乙酸 乳酸 2 煤 酚皂溶液等 最常见的是 75 酒精及 1 新洁尔灭 75 酒精主要用于操作者的皮肤 操作台面及无菌室内的壁面处理 且对其他灭菌剂有增 效或协同作用 1 新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦拭消毒 2 2 3 抗生素消毒 在细胞培养时 添加青霉素 cell wall 链霉素 protein 卡那霉素等抑制细菌 真菌等 污染 2 4 污染检测与控制 污染途径污染途径 空气 器材 操作 血清 组织标本 常见的污染细菌 芽孢杆菌 大肠杆菌 假单胞菌 白色葡萄球菌等 2 4 1 细菌污染 肉眼观察 接种观察 镜下观察 以预防为主 采用青霉素 链霉素可以预防细菌污染 常见的污染真菌 烟曲霉 黑曲霉 孢子霉 白念珠菌 酵母菌等等 2 4 3 支原体污染 支原体污染的检测 相差显微镜观察 荧光染色法观察 电镜检测 培养检测 2 4 6 污染的预防 1 培养操作前的准备 工作台 培养器皿 培养液 操作者 2 培养操作时的注意事项 超净工作台上物品的放置 开启 封闭瓶口时酒精灯灼烧 吸取液体时 专管专用 培养 液用时才打开 不用时立即封闭 不交谈 咳嗽 操作完毕后 工作台消毒 本节需掌握的内容本节需掌握的内容 无菌技术无菌技术 包括 清洗 灭菌 污染预防 无菌操作 包括 清洗 灭菌 污染预防 无菌操作 5 细胞分离 差速离心分离法 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠法 盖片分离法 6 1 细胞保存方法 传代培养保存 低温冷冻保存 低温保存 超低温保存 非玻璃化冷冻 玻璃化冷冻 6 1 1 冷冻保护剂 渗透性 甘油 二甲亚砜 乙二醇