无菌检验方法学验证.doc

6VP-2F02-2北京康辰药业有限公司公司无菌检查方法学验证资料文件起草： 日期： 文件审核： 日期： 文件批准： 日期： 无菌检验方法学验证 第 14 页 共 15 页1.方法概述及方案说明1.1方法概述：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检查条件下未发现微生物污染。我公司无菌检查法采用薄膜过滤法，通过供试品对每一试验菌抑菌活性的检查，并于阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌生长良好，并和阳性对照容器内的培养结果相似，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用消除，供试品可按该法进行无菌检查。若含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。应选择无抑菌作用或抑菌作用消除的检验条件作为供试品的无菌检查方法。1.2 确认目的依据2010版中华人民共和国药典对注射用尖吻蝮蛇血凝酶的无菌检验方法进行再验证，确认该方法适合于该产品的无菌检查，并确认合适的检验条件，以保证无菌检查方法的科学性和检验结果的准确性。1.3方案实施的条件1.3.1验证所需检测仪器 验证所需主要检测仪器及设备表仪器设备要求生化培养箱完好且校验合格电脑恒温培养箱完好且校验合格1.3.2相关文件：确定验证依据 验证依据表名称要求药品生产质量管理规范（2010年修订）化学工业出版社中国药典（2010年版二部）2.菌种及培养基来源确认2.1菌种来源菌种名称菌种代码菌种来源金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003中国生物制品检验所枯草芽胞杆菌CMCC(B)63501铜绿假单胞菌CMCC(B)10104白色念珠菌CMCC(B)980012.2培养基来源 ：中国生物制品检验所3.培养基灵敏度验证3.1培养基灵敏度验证：为证明硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基适合于细菌，真菌的无菌检查，对硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基灵敏度检查。3.2.参照标准：2010版中国药典二部附录XI H无菌检查法。3.3.试验材料：3.3.1. 被验证培养基：品名：硫乙醇酸盐流体培养基 规格： 250g/瓶 批号： 090827 生产厂家：北京三药科技开发公司 品名：改良马丁培养基 规格： 250g/瓶 批号： 090605 生产厂家：北京三药科技开发公司 3.3.2. 仪器设备：3.3.2.1.压力蒸汽灭菌器 3.3.2.2.净化工作台 3.3.2.3.电热鼓风干燥箱 3.3.2.3.3.生化培养箱 (2328)3.3.2.3.4.恒温培养箱(3035)3.3.3. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液3.3.3.3. 验证用培养基：名称生产厂家批号营养琼脂培养基北京三药科技开发公司100506玫瑰红钠琼脂培养基北京三药科技开发公司0806113.4.菌液制备：3.4.1.取经培养1824小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至小于100cfuml的菌悬液备用。3.4.2.取经培养2448小时的白色念珠菌的改良马丁培养物1ml加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至小于100cfuml的菌悬液备用。3.5.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿）分别取上述制备的金黄色葡萄糖球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各1ml加入培养皿，每种菌液平行做2皿，注入不超过45营养琼脂培养基1520ml，置3035培养箱培养二天，取上项制备的白色念珠菌菌液1ml加入培养皿，平行做2皿，注入不超过45的玫瑰红钠琼脂培养基约1520ml，置2328培养箱培养三天。3.6.无菌培养基的无菌性检查3.6.1培养基的配制硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基29.25g，加1L蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。 营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基18g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基28.5g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到到试管中，每只试管装量9ml。3.6.2培养基的培养硫乙醇酸盐流体培养基和营养肉汤培养基置于3035的培养箱中培养14天；改良马丁培养基置于2328的培养箱中培养14天，每天观察培养基浑浊情况。将结果填写于培养基无菌性检查记录中。3.7.培养基灵敏度检查3.7.1.硫乙醇酸盐流体培养基等灵敏度检查至少应进行3次独立的平行试验。3.7.2培养基的配制硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基29.25g，加1L蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。 营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基18g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基28.5g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到到试管中，每只试管装量9ml。3.7.3.培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu/ml的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。3.7.3.3.结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。将结果填写于附表2培养基灵敏度检查表中。4.无菌检验方法验证4.1试验要求：连续做3次。4.2培养基制备及菌液接种：4.2.1制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌等4种对照菌液，取流乙醇酸盐流体培养基12g，加水400ml,加热煮沸使溶解，分装至7支试管中，每支50ml。用牛皮纸包裹捆好后，121灭菌20分钟。取改良马丁培养基5.8g，加水200ml,加热煮沸使溶解。分装至3只试管中，每支50ml.用牛皮纸包裹捆好后，121灭菌20分钟。在流乙醇酸盐流体培养基中金黄色葡萄球菌菌液/铜绿假单胞菌菌液/枯草芽胞杆菌菌液各1支，每支接种量1ml(含菌小于100cfu)，另一只不接种作为空白对照。改良马丁培养基中接种白色念珠菌菌液1支，每支接种量1ml(含菌小于100cfu)，另一支不接种作为空白对照。4.2.2 供试液制备：取本品20瓶，每瓶加灭菌注射用水1ml，摇匀。用注射器吸取所有供试品溶液，注入一0.45m薄膜过滤器中，过滤。用0.9%氯化钠缓冲液冲洗滤膜3次，每次100ml。取出滤膜，等分成3份，分别加入1支装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的试管和1支装有50ml改良马丁培养基的试管中，培养。4.2.3阳性对照：3支装有不同菌液50ml流乙醇酸盐流体培养基的试管，1支装有白色念珠菌菌液50ml改良马丁培养基的试管。阳性对照液的制备：取金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003新鲜斜面培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，3035培养1824小时，用0.9无菌氯化钠溶液制成1ml含10100cfu的菌液。4.2.4阴性对照：用薄膜过滤器，0.45m水系膜过滤，过滤氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，然后取出，分别接种至空白流乙醇酸盐培养基和空白改良马丁培养基中，分别给以相应条件培养。4.3操作方法（薄膜过滤法）4.3.1.操作前准备：各试验器具等，去除牛皮纸外包装，放入传递窗中。供试品、培养基管用75%乙醇棉球擦拭外表面后，放入传递窗中。开启超净工作台的风机及紫外灯；开启操作间的风机并提前进行臭氧消毒2小时。操作人员洗手液清洗双手，再用75%乙醇棉球擦拭双手后，换无菌服进入无菌室。4.3.2薄膜过滤法操作：将试验器具、样品及培养基由传递窗移入超净工作台，开启样品的塑料件，并过火焰3次。用灭菌镊取出注射器，在火焰旁安装上针头，并将针头迅速通过火焰3次。取规定量的供试品，用注射器吸取1 ml的稀释剂使供试品复溶，再用注射器吸取全部复溶后的溶液，注入薄膜过滤器中，滤过。取规定20瓶供试品，用注射器直接吸取全部供试品溶液注入薄膜过滤器中，滤过。用稀释剂冲洗滤膜，每次100ml，共冲洗3次。如确认供试品没有任何抑菌性，可不用冲洗。用无菌镊取出滤膜，置空培养皿中，用无菌剪刀将滤膜分成三份，分别放入装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的2支试管和装有50ml改良马丁培养基的1支试管中。在上述1支硫乙醇酸盐流体培养基中，接种1ml阳性对照液，作为阳性对照。将一定体积（复溶所用稀释液的体积）的稀释液注入另一薄膜过滤器中，滤过。用稀释液冲洗滤膜，每次100ml，共冲洗3次。用无菌镊取出滤膜，置空培养皿中，用无菌剪刀将滤膜分成两份，分别放入装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的1支试管和装有50ml改良马丁培养基的1支试管中，作为阴性对照。另取改良马丁培养基、硫乙醇酸盐流体培养基各1管，直接培养，作为本底对照。4.3.3培养硫乙醇酸盐流体培养基管置3035培养，样品管及阴性管对照培养14天，阳性管培养4872h（细菌培养48小时，真菌培养72小时）；改良马丁培养基管置2328培养14天。4.3.4观察培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长，填写记录检查表。如加入供试品后，或在培养过程中培养基出现浑浊，培养14日后不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量，接种于同种新鲜培养基或斜面上，继续培养，细菌48h，真菌72h，观察有无菌生长；或用接种环取培养液涂片、染色、镜检，进行判断。4.3.5结果判断若供试品管均澄清，或虽浑浊，但经确证无菌生长，判断供试品符合规定。若供试品管中任何1管显浑浊，并确证有菌生长，判断供试品不符合规定。属于下列条件之一的，本次实验无效。试验若经确认无效，应重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。阴性对照管有菌生长。供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品或无菌操作技术不当引起的。4.3.6注意事项供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用无菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。否则可能导致微生物繁殖或死亡而影响结果。阳性对照菌液的制备及阳性对照管的制备，均应在阳性接种室内进行。当经过验证确认供试品无抑菌性时，可不用稀释液对滤膜进行冲洗。4.4验证周期 当供试品或检验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应对无菌检查方法进行再次确认。附表1 培养基的无菌性检查表培养基名称管数培养时间（天）备注1234567891011121314硫乙醇酸盐流体 培养基12345营养肉汤培养基12345改良马丁培养基12345结论操作人： 日期： 年 月 日复核人： 日期： 年 月 日注：“+”为生长，“-”为不生长附表 2 培养基灵敏度检查表菌种类型培养基装量（ml）培养基管数（支）硫乙醇酸盐流体培养基（天）备注123金黄色葡萄球菌121121枯草芽孢杆菌121121铜绿假单胞菌121121空白对照121菌种类型培养基装量（ml）培养基管数（支）营养肉汤培养基（天）备注123金黄色葡萄球菌121121枯草芽孢杆菌121121铜绿假单胞菌121121空白对照121菌种类型培养基装量（ml）培养基管数（支）改良马丁培养基（天）备注12345白色念珠菌9191空白对照91结论注：“+”为生长，“-”为不生长 附表3 无菌检查记录（一）仪器名称医用型洁净工作台薄膜过滤器电热恒温培养箱生化培养箱型号编号试剂及培养基名称硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基0.9%氯化钠缓冲液配制批号阳性对照菌液菌种名称菌液浓度制备时间金黄色葡萄球菌工作台环境沉降菌数：左 个，中 个，右 个供试品处理1取供试品批号为 ， 瓶，每瓶加灭菌注射用水 ml，摇匀。2用注射器吸取所有供试品溶液，注入一 m薄膜过滤器中，过滤。3用0.9%氯化钠缓冲液冲洗滤膜 次，每次 ml。4取出滤膜，等分成 份，分别加入 支装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的试管和 支装有50ml改良马丁培养基的试管中，培养。阴性对照品处理1取灭菌注射用水 ml注入一 m薄膜过滤器中，过滤。2用0.9%氯化钠缓冲液冲洗滤膜 次，每次 ml。3取出滤膜，等分成 份，分别加入 支装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的试管和 支装有50ml改良马丁培养基的试管中，培养。4另取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各 支，直接培养，做本底对照。取阳性对照菌液 ml，接种至供试品处理中的 支硫乙醇酸盐流体培养基试管中检验结果硫乙醇酸盐流体培养基，培养温度 培养天数（天）1234567891011121314供试品阴性对照本底对照阳性对照改良马丁培养基，培养温度 培养天数（天）1234567891011121314供试品阴性对照本底对照异常及偏差分析结果判定符合规定 不符合规定检验人：年 月 日复核人：年 月 日 无菌检查记录（二）仪器名称医用型洁净工作台薄膜过滤器电热恒温培养箱生化培养箱型号编号试剂及培养基名称硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基0.9%氯化钠缓冲液配制批号阳性对照菌液菌种名称菌液浓度制备时间金黄色葡萄球菌工作台环境沉降菌数：左 个，中 个，右 个供试品处理1取本品 ， 瓶，每瓶加灭菌注射用水 ml，摇匀。2用注射器吸取所有供试品溶液，注入一 m薄膜过滤器中，过滤。3用0.9%氯化钠缓冲液冲洗滤膜 次，每次 ml。4取出滤膜，等分成 份，分别加入 支装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的试管和 支装有50ml改良马丁培养基的试管中，培养。阴性对照品处理1取灭菌注射用水 ml注入一 m薄膜过滤器中，过滤。2用0.9%氯化钠缓冲液冲洗滤膜 次，每次 ml。3取出滤膜，等分成 份，分别加入 支装有50ml硫乙醇酸盐流体培养基的试管和 支装有50ml改良马丁培养基的试管中，培养。4另取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各 支，直接培养，做本底对照。取阳性对照菌液 ml，接种至供试品处理中的 支硫乙醇酸盐流体培养基试管中检验结果硫乙醇酸盐流体培养基，培养温度 培养天数（天）1234567891011121314供试品阴性对照本底对照阳性对照改良马丁培养基，培养温度 培养天数（天）12345678910