门冬酰胺酶的制备与分析

重组天冬酰胺酶的制备 纯化与鉴定 赵雅嫱 黄妤璠 龙益如 王敏敏 白华山 1 原理 本实验主要是利用基因工程手段构建 L 天冬酰胺酶基因工程菌 L 天冬酰 胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性 特别是对非霍奇金淋巴瘤和 ALL 的有很强的抑制作用 目前适用于治疗黑色素瘤 非何杰金病淋巴瘤等 也可以用于治疗急性单核细胞性白血病 慢性淋巴细胞性白血病等 目前 我国虽已投入生产 L 天冬酰胺酶 但是较国外生产成本高 菌种产 酶活性低 提取纯化工艺落后 针对这些问题 本实验对大肠杆菌重组 L 天冬 酰胺酶的制备 纯化与鉴定进行了系统性的探究 意图改进重组 L 天冬酰胺酶 的表达 优化其纯化工艺 分析其鉴定方法与性质 本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建 表达与鉴定的摸索 酶 蛋白的诱导表达条件分析 酶蛋白分离纯化手段的比较和选择 如蔗糖溶液提 取 硫酸铵分级沉淀 CM Sephadex 和 DEAE Sepharose 离子交换层析以及亲 和层析 重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等 2 实验材料 实验仪器见表 1 1 型号和生产厂家根据实验室现有条件核定 表 1 1 实验仪器或装置 仪器名称型号生产厂家 超净工作台 PCR 扩增仪 恒温培养箱 超低温冰箱 台式离心机 恒温摇床 涡轮振荡器 高压灭菌锅 蛋白电泳仪 核酸电泳仪 凝胶成像仪 紫外分光光度计 高效液相色谱仪 扫描型紫外分光光度 计 制冰机 超声清洗机 实验试剂和材料见表 1 2 材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室 现有条件核定 表 1 2 试剂和材料 试剂或材料材质或规格来源 E coli 野生型菌株 CPU21009 实验室储存 pMD18 T50ng l 宝生物工程有限公司 pET 22b50ng l 宝生物工程有限公司 Nde 10U l 宝生物工程有限公司 Xho 10U l 宝生物工程有限公司 T4 DNA Ligase350U l 宝生物工程有限公司 DNA 纯化试剂盒离心柱型天根生化科技 北京 有限公司 Ni NTA 树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技 北京 有限公司 质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技 北京 有限公司 胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技 北京 有限公司 CaCl260mmol L 实验室储存 PBS50 x 实验室储存 NaCl 分析纯 Taq 酶 Mix分析纯 NH4 2S2O8 分析纯 C2H6OS 分析纯 CH4O 分析纯 冰乙酸分析纯 C2H6O 分析纯 氨基丁三醇分析纯 考马斯亮蓝分析纯 SDS 分析纯 Nessler s 试剂 Reagent ACS 美国 Spectrum 公司 酵母粉分析纯 L 天冬酰胺分析纯英国 OXOID 公司 蛋白胨分析纯 甘氨酸分析纯 琼脂糖分析纯 葡萄糖食品级 TEMED 优级纯 溴酚蓝分析纯 IPTG 优级纯 丙三醇分析纯 3 实验思路与步骤 本实验设计从大肠杆菌野生型菌株 CPU210009 中提取总 DNA 通过 PCR 扩增目的基因 ansB 随后对 PCR 产物进行纯化 后分别构建重组克隆载体和 表达载体 将克隆载体导入宿主中 筛选阳性克隆 再经双酶切和测序鉴定 后将构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养 利用 IPTG 诱导表达重组蛋 白 对重组蛋白进行提取纯化 再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度 SDS PAGE 电泳测定分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较 同时 实验 过程中以纳氏试剂法监控 L 天冬酰胺酶酶活力 并计算回收率 3 1大肠杆菌 L 天冬酰胺酶 II 基因 ansB 的获取 3 1 1 大肠杆菌 ansB 基因的选择与引物 从 NCBI 中查找获取大肠杆菌 ansB 的基因序列 其 Gene ID 为 947454 基因长度为 1047bp 序列如下 1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca 61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac 121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg 181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc 241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat 301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc 361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc 421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat 481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt 541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct 601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc 661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat 721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc 781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg 841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc 901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac 961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag 1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa 根据该基因序列 使用 Primer 5 0 设计引物 并考虑到后续构建克隆载体和表 达载体的需求 在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列 获得引物如下 上游引物 P1 GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA 下游引物 P2 GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG 上游引物 P1 中包含一个 Nde 酶切位点 下游引物中包含一个 Xho 酶切位 点 所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成 3 1 2 大肠杆菌全基因组 DNA 的提取 使用大肠杆菌基因组 DNA 全提取试剂盒提取 E coli 全基因组 DNA 具体步 骤如下 1 从实验室斜面保存的 E coli 野生型菌株 CPU21009 上 取接种环 挑单菌落 转移到 50 mL 的液体 LB 培养基 在温度 37 180 r min 发酵过夜 2 取菌液 1 mL 至 1 5 mL 的离心管管中 离心机参数调至 12000 离心 2 min 离心 3 min 弃去上清液 3 加入 0 2 mL GA 缓冲液 用漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮 加入 4 L RNaseA 100mg mL 溶液 用涡旋振荡器振荡振荡 15 s 室温放置 5 min 4 加入 0 02 mL 蛋白酶 K 混合均匀 5 加入 0 02 mL GB 缓冲液 混合均匀 将水浴锅调到 70 把离心管放入 10 min 短暂离心除去离心管管盖和管壁的水珠 6 加入 0 22 mL 分析纯乙醇 在 15 s 内充分混匀 此时会出现絮状物 短暂 离心除去 EP 管盖和管壁的水珠 7 将 6 中所得絮状物和液体均加入安装进收集管的吸附柱中 离心机参数调 至 12000 离心 1 min 弃去柱底液体 安装好吸附柱 8 加 0 5 mL GD 缓冲液至吸附柱中 离心机参数调至 12000 离心 1 min 倒掉 柱底液体 并安装好吸附柱 9 加 0 6 mL PW 漂洗液至吸附柱中 离心机参数调至 12000 离心 1 min 倒 掉柱底液体 并安装好吸附柱 10 再加 0 5 mL GD 缓冲液 离心机参数调至 12000 离心 1 min 倒掉柱底液体 11 将吸附柱放入收集管中 离心机参数调至 12000 离心 2 min 倒掉柱底液体 在室温下静置 20 min 吸附柱 完全晾干漂洗液 使吸附材料干燥 12 将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中 悬滴 0 04 mL 双蒸水到吸附 膜的中间部分 在室温静置 5 min 离心机参数调至 12000 离心 2 min 收集溶 液 13 将 12 中收集的溶液吸净后加回吸附柱 放置 5 min 离心机参数调至 12000 离心 2 min 14 将提取后的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳鉴定 以便用于后续操作 3 1 3 PCR 扩增 ansB 基因 1 在 PCR 扩增仪上设计如下反应程序 模板 DNA 预变性 94 5 min 变性 94 条件下 45 s 退火 58 条件下 30 s 延伸 72 条件下 1 min 循环步骤 30 次 最后在 72 延伸 10 min 2 在 PCR 管建立整体为 0 05 mL 的 PCR 扩增反应体系 大肠杆菌总 DNA 模板 0 003 mL 上游引物 P1 0 001 mL 下游引物 P2 0 001 mL Taq 酶 Mix 0 025 mL ddH2O 0 02 mL 3 将样品混合后稍作离心 将反应管放入 PCR 扩增仪中进行 PCR 反应 4 结束 PCR 扩增 取 0 005 mL 溶液 进行 1 Agarose gel electrophoresis 鉴定 判断是否有基因片段存在于 PCR 中 以及其大小 3 1 4 PCR 扩增产物的纯化 1 将 0 04 mL PCR 扩增后体系用双蒸水调整至 0 1 mL 加入 0 5 mL 结合液 DB 充分混匀 2 将 1 中得到的溶液加入安装好的吸附柱 在室温下静置 1 min 离心机参数 调至 12000 离心 1 min 倒掉管底的液体 3 加入 0 5 mL 用于洗涤的溶液 离心机参数调至 12000 离心 1 min 倒掉管底 的液体 4 加入 0 5 mL 用于洗涤的溶液 离心机参数调至 12000 离心 1 min 倒掉管底 的液体 5 将吸附柱重新安装好 空管离心 2 min 尽最大可能得除去用于漂洗的液体 防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响 6 取吸附柱 悬滴 0 04 mL 双蒸水到吸附膜的中间部分 在室温静置 5 min 离心机参数调至 12000 离心 2 min 收集溶液 7 将离心管中的双蒸水 重新加入吸附柱中 室温放置 2 min 后 离心机参数 调至 12000 离心 2 min 8 将 PCR 纯化产物进行 1 Agarose gel electrophoresis 鉴定 以用于后续操作 3 2 重组克隆载体的构建 为了大量准确扩增目的基因片段 采用构建克隆载体的方法 由于 PCR 扩 增时采用的 DNA 聚合酶为 Taq 酶 故扩增序列带有一段 A 采用 TA 克隆连 接载体 载体选择 T 载体 且要求载体在宿主细胞内为高拷贝 能够稳定自主 表达 这里选用 pMD 18 T 载体 构建好的克隆载体导入宿主中后 要进行阳 性克隆筛选与鉴定 并用双酶切回收 3 2 1 目的基因与载体的连接 pMD18 T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物 TA Cloning 的专用载体 本 载体由 pUC18 载体改建而成 在 pUC18 载体的多克隆位点处的 Xba I 和 Sal I 识别位点之间插入了 EcoR V 识别位点 用 EcoR V 进行酶切反应后 再在两侧 的 3 端添加 T 而成 因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都有在 PCR 产物的 3 末端添加一个 A 的特性 所以可以大大提高 PCR 产物的连接 克隆效率 载体酶切图谱如图 1 1 本载体以 pUC18 载体为基础构建而成 所以它具有同 pUC18 载体相同的 功能 此外 高效连接液 Solution I 可以在短时间内 约 30 分钟 完成连接反 应 其连接液可以直接用于细菌转化 大大方便了实验操作 实验操作如下 1 在一个标准的 10 L 连接反应体系中加入 pMD18 T 载体 1 L PCR 纯化产物 1 5 L ddH2O 2 5 L Solution I 5 L 2 16 连接 2 h 图 1 1 克隆载体 pMD 18 T 的酶切图谱 3 2 2 大肠杆菌 Top 10 感受态细胞的制备 大肠杆菌 TOP10 菌株来源于 MC1061 菌株 是目前实验室最常用的基因工 程宿主细胞之一 基因型与 DH10B 高度类似 DH10B 为 galE15 型 而 TOP10 为 galU 型 具有链霉素抗性 其适用于高效的 DNA 克隆和质粒扩增 能保 证高拷贝质粒的稳定遗传 1 从实验室保存的大肠杆菌 Topl0 菌株斜面上 用接种环挑取单个菌落 转移 至液体的 50 mL LB 培养基中 37 下 180 r min 摇床过夜发酵 2 取 0 01 mL 菌液转移到液体的 50 mL LB 培养基中 37 下 150 r min 振荡 约 3 5 h 左右 至菌液对数期 3 将液体培养基全部移入 50 mL 离心管中并配平 4 下离心机参数调至 3000 离心 10 min 弃去上清液 4 添加 15 mL 预冷的氯化钙溶液轻轻吹打 4 下离心机参数调至 3000 离心 10 min 弃去上清液 5 添加 1 5 mL 预先冰浴的氯化钙 60 mmol L CaCl2 质量分数为 15 的甘油 pH 7 2 溶液 用枪轻轻吹至完全悬浮 分装至干净的 EP 管 每管 0 2 mL 放 在 80 超低温冰箱 3 2 3 重组克隆质粒的转化 1 含有 Ampicillin l00 mg mL 的 LB 培养基的制备 2 取一管 200 L 的大肠杆菌 Top l0 感受态细胞 在冰上化冻 加入重组质粒 的连接产物 10 L 轻轻用枪吹打混匀 3 另做一个宿主菌阴性对照 即 200 L 的感受态细胞 加 10 L 无菌水 混匀 4 冰浴 30 min 5 迅速放入在 42 下热击 90 s 再迅速放回冰中冰浴 3 min 6 加入到 1 mL 的液体 LB 培养基混合 37 150 r min 培养 1 h 细胞恢复正常 生长 并表达 Ampicillin 抗性基因 7 将上述菌液摇匀后 分别取 0 1 mL 0 2 mL 0 4 mL 在含有 Ampicillin 的 LB 培养基板上均匀涂布 8 将上述平板 37 倒置培养过夜 不超过 24 h 观察菌斑的出现效果 3 2 4 阳性克隆的筛选与鉴定 1 从 Ampicillin LB 培养基板上挑取单个的菌落 液体 Ampicillin LB 培养基 中振荡过夜 取 5 mL 过夜菌液加入离心管中 离心机参数调至 12000 离心 1 min 弃去上清废液 2 使用离心柱型质粒提取试剂盒 向菌体沉淀管中加入 0 5 mL Pl 溶液 含溶菌 酶 核糖核菅酸酶 用移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀 3 向离心管中加入 0 6 mL P2 溶液 翻转 6 8 次 充分裂解菌体 在这一点上 菌液变得澄清 黏黏的 时间不超过 5 min 以免损坏质粒 如果不澄清 可能 是由于过量加菌液 未能彻底裂解 应减少细菌生长量 4 向离心管中加入 0 6 mL P3 溶液 马上轻轻地翻转 6 8 次 混合彻底 会有 白色絮状物出现 离心机参数调至 12000 离心 10 min 后 离心管底有固体出现 加入 P3 立即翻转 避免局部沉淀 若上清液有微小白色固体 再离心取上清 5 将上清液加进平衡过的吸附柱中 吸附柱安装好 离心机参数调至 12000 离 心 2 min 小心地将离心管中的溶液分次加入原有吸附柱 安装好吸附柱 6 加入 0 6 mL PW 漂洗液 将台式离心机参数设置为 12000 离心 1 min 倒 掉管底废液 安装好吸附柱 7 加入 0 6 mL PW 漂洗液 将台式离心机参数设置为 12000 离心 1 min 倒 掉管底废液 安装好吸附柱 8 将台式离心机参数设置为 12000 将组件离心 2 min 除去吸附柱中的残留 的用于漂洗的液体 吸附柱在室温下静置 5 min 防止用于漂洗的液体中残留的 分析纯乙醇在下游反应中有影响 9 将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中 悬滴 0 04 mL 双蒸水到吸附膜 的中间部分 在室温静置 5 min 离心机参数调至 12000 离心 2 min 收集溶液 10 将 9 中收集的溶液吸净后加回吸附柱 放置 5 min 离心机参数调至 12000 离心 2 min 11 取 5 L 质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳 12 克隆载体中含有 Nde I 和 Xho I 两种限制性酶酶切位点 构建 10 L 双酶切 反应体系 Nde I 0 5 L Xho I0 5 L 10 H buffer 1 L pMDl8 T ansB 质粒 8 L 37 酶切 2 h 后 取 5 L 进行 1 琼脂糖凝胶电泳 3 3 重组表达质粒的构建 3 3 1 重组克隆载体质粒的提取 1 从相应的培养基上挑取含有重组克隆载体 pMDl8 T ansB 质粒 的菌种的单菌落 接种于含有氨苄青霉素的液体 LB 培养基 用 180 r min 的参 数 在 37 下培养 12 h 以上 在离心管中加 5 mL 收获的菌液 离心机参数调 至 12000 离心 l min 留下沉淀 pMDl8 T ansB 质粒提取过程同 1 3 2 4 的 2 11 2 5 L 质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳 其余 20 保存 3 3 2 重组克隆载体和表达载体的分别双酶切反应 1 Nde I Xho I 双酶切重组克隆载体 pMDl 8 T ansB 质粒反应体系 pMDl8 T ansB 质粒 40 L 10 H buffer 5 L Xho I 2 5 L Nde I 2 5 L 总体积 50 L 2 pET 22b Plasmid 酶切反应体系 pET 22b Plasmid 40 L 10 H buffer 5 L Xho I 2 5 L Nde I 2 5 L 总体积 50 L 3 分别将两个体系置于 37 水浴中酶切 2 h 后 取 5 L 此进行 1 琼脂糖凝胶 电泳 3 3 3 酶切片段的胶回收 1 经琼脂糖凝胶电泳确认酶切结果后 剩下的 45 L 酶切反应产物中均匀加入 5 L l0 上样缓冲液 再全加到大孔胶的上样泳道中 2 在 100 V 电压下电泳至条带跑至总胶长的 2 3 处 将胶块放入 EB 浓度为 0 5 g mL 的溶液中染色 大小为 1000 bp ansB 5000 bp pET 22b 左右 3 在紫外灯照射下 判定 DNA 位置 用干净的刀子分别切下的含有要回收 DNA 的胶块 4 取 1 5 mL EP 管 放到分析天平上称重后 加入切下的胶块再称重 计算胶 块的质量 5 每 100 mg 胶块加入 0 6 mL DB 溶胶液 按 4 中称取的重量加入相应体积的 DB 在 55 下反应 10 min 使胶块彻底溶于液体 安装好组件 离心机参数 调至 10000 离心 1 min 收集沉淀 6 安装好吸附柱 加 0 5 mL 用于漂洗的液体 离心机参数调至 10000 离心 1 min 重复漂洗 去除废液 离心 2 min 弃去废液 7 在室温下静置吸附柱 开启盖 待乙醇气味完全消失后放入干净的 EP 管 悬滴 0 04 mL 双蒸水到吸附膜的中间部分 在室温静置 5 min 离心机参数调至 12000 离心 2min 收集溶液 8 将 7 中收集的溶液吸净后加回吸附柱 放置 5 min 离心机参数调至 12000 离 心 2 min EP 管中的即为胶回收产物 9 胶回收产物 5 L 进行 1 Agarose gel electrophoresis 3 3 4 构建表达载体 pET 22b ansB 下图所示为表达载体 pET 22b 的酶切图谱 图 1 2 表达载体 pET 22b 的酶切图谱 pET 22b 是一种大肠杆菌表达载体 载体大小在 5500bp 左右 其含有多克 隆位点 其中就含有我们目的基因引物片段构建中引入的 Ned 和 Xho 两种 限制性酶切位点 它含有氨苄青霉素抗性标记 且含有 PelB 信号肽序列 能 够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔 1 取一支 1 5mL 的干净 EP 管 按如下加样后混匀 胶回收双酶切 pET 22b 质粒产物18 L 胶回收双酶切 ansB 片段6 L T4 DNALigase 3 L 10 Ligase buffer 3 L 总体积 30 L 2 用离心机甩一下 使溶液集中于底部 3 16 恒温连接 3 h 后 4 暂时保存 用于转化 BL21 感受态细胞 3 3 5 大肠杆菌 BL21 感受态细胞的制备 从实验室保存的大肠杆菌 Topl0 菌株斜面上 用接种环挑取单个菌落 转移至 50 mL 液体 LB 培养基 37 180 r min 隔夜发酵 感受态细胞的制备步骤同 1 3 2 2 的 2 5 3 3 6 表达载体 pET 22b ansB 的转化 1 含有 Ampicillin l00 mg mL 的 LB 培养基板的制备 2 取一管 200 L 的大肠杆菌 BL21 感受态细胞 在冰上化冻 加入 T4 DNA 连 接产物 10 L 轻轻用枪吹打混匀 3 另做一个宿主菌阴性对照 即 200 此的感受态细胞 加 10 L 无菌水 混匀 4 冰浴 30 min 5 迅速放入在 42 下热击 90 s 再迅速放回冰中冰浴 3 min 6 加入到 1 mL 的液体 LB 培养基混合 37 150 r min 培养 1 h 细胞恢复正常 生长 并表达 Ampicillin 抗性基因 7 将上述菌液摇匀后 分别取 0 1mL 在含有 Ampicillin l00 g mL 的 LB 培养基 板上均匀涂布 8 将上述平板 37 倒置培养过夜 不超过 24 h 观察菌斑的出现效果 3 3 7 阳性表达载体 pET 22b ansB 的筛选与鉴定 1 从 Ampicillin LB 培养基板上挑取单个的菌落 液体 Ampicillin LB 培养基中 振荡过夜 取 5 mL 过夜菌液加入离心管中 离心机参数调至 12000 离心 1 min 弃去上清废液 2 向菌体沉淀管中加入 0 5mL Pl 溶液 含溶菌酶 核糖核苷酸酶 用移液设备 彻底悬浮细菌细胞沉淀 3 向离心管中加入 0 6 mLP2 溶液 翻转 6 8 次 充分裂解菌体 在这一点上 菌液变得澄清 黏黏的 时间不超过 5 min 以免损坏质粒 如果不澄清 可能 是由于过量加菌液 未能彻底裂解 应减少细菌生长量 4 向离心管中加入 0 6 mL P3 溶液 马上轻轻地翻转 6 8 次 混合彻底 这时会 有白色絮状物出现 离心机参数调至 12000 离心 10 min 后 离心管底会有固体 出现 加入 P3 立即翻转 避免局部沉淀 如果上清液有微小白色固体 再离 心 取上清 5 将上一步获得的上清液加进平衡过的吸附柱中 吸附柱安装好 离心机参数 调至 12000 离心 2 min 小心地将离心管中的溶液分次加入原有吸附柱 安装好 吸附柱 6 加入 0 6mLPW 漂洗液 将台式离心机设置为 12000 离心 1 min 倒掉管底 废液 安装好吸附柱 7 加入 0 6 mLPW 漂洗液 将台式离心机设置为 12000 离心 1 min 倒掉管底 废液 安装好吸附柱 8 将台式离心机设置为 12000 将组件离心 2 min 除去吸附柱中的残留的用于 漂洗的液体 吸附柱在室温下静置 5 min 防止用于漂洗的液体中残留的分析纯 乙醇在下游反应中有影响 9 将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中 悬滴 0 04 mL 双蒸水到吸附膜 的中间部分 在室温静置 5 min 离心管参数调至 12000 离心 2 min 收集溶液 10 将 9 中收集的溶液吸净后加回吸附柱 放置 5 min 离心管参数调至 12000 离心 2 min 11 取 5 L 质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳 12 构建 10 L 双酶切反应体系 Nde 0 5 L Xho 0 5 L 10 H buffer1 L pET 22b ansB 质粒8 L 13 双酶切成功 委托华大基因测序 3 4 AnsB 蛋白的诱导表达与纯化 3 4 1 IPTG 诱导重组蛋白 AnsB 的表达 IPTG 诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白 并可 视载体构建情况翻译后续的标签序列 IPTG 广泛用于诱导表达系统 但是 IPTG 有一定毒性 有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适 因而也有用 乳糖代替 IPTG 作为诱导物的研究 1 在无菌环境下 用接种针挑取重组工程菌 pET 22b ansB 单菌落 转入 50 mL 液体 LB 培养基 终浓度为 100 g mL Ampicillin 中 在 37 恒温摇床中 150 r min 培养 12 h 以上 从上述细菌菌液中接种 0 1mL 到新鲜的 50 mL 终浓度为 100 g mL Ampicillin 的 LB 液态培养基中 在 37 摇床中 250 r min 恒温振荡约 4 h 至生长指数期 测定菌液在 600 nm 波长下吸光度值为 0 8 至 1 0 之间 2 取 5 mL 的上述重组工程菌 pET 22b ansB 发酵液保存 以便进行后续 SDS PAGE 凝胶电泳对照实验 3 向剩余发酵液中加入异丙基硫代半乳糖苷使浓度至 0 6mmol L 3 下 250 r min 引诱重组 AnsB 蛋白表达 5 h 3 4 2 蔗糖溶液提取 L 天冬酰胺酶 大肠杆菌能产生两种天冬酰胺酶 无抗癌活性的天冬酞胺酶 存在于细胞 质中 有抗癌活性的天冬酞胺酶 则分泌到细胞周质中 以往对 L 天冬酰胺酶 的提取纯化常采用丙酮破碎细胞 有机溶剂反复分级沉淀的方法 酶活力损失较 大 据中国药科大学刘景晶等研究报道 用蔗糖溶液抽提细胞 主要是提取位 于细胞周质中的酶 提取结束时 多数细胞并未发生破裂 因此提取液粘稠度 不大 可以用 8000r min 离心除去细胞 并且该法的提取收率高于超声波破壁 法 冷丙酮干燥破壁法及反复冻融法 向菌体细胞中加入 5 倍体积的蔗糖抽提液 蔗糖 40 溶菌酶 200mg L EDTA 10 mmol L pH 7 5 在 30 振荡 2 小时 8000r min 离心 30 分钟 收集上 清酶液 3 4 3 硫酸铵分级沉淀和透析 为了保护酶的活性在固相分离沉淀时采用较为温和的硫酸铵分级沉淀 具 体方法为用蔗糖溶液提取法获得的酶液 加入硫酸铵至 55 饱和度 调 pH 至 7 0 室温搅拌 1 小时 离心除去沉淀 上清液中加入硫酸按到 90 饱和度 离 心收集沉淀 实验验证破壁液中酶浓度高于 378 IU ml 时 酶易与杂质 起沉淀 回 收率下降 但过低时 虽然回收率增高 但杂质的去除率必定会下降 故应选择 378 IU ml 左右进行沉淀 在 pH 为 4 9 时 盐析的沉淀效果最好 回收率达 89 1 沉 淀物用 50mmol L pH7 0 磷酸缓冲液溶解并透析 3 4 4 离子交换层析 1 CM Sephadex 层析柱纯化 将酶液过用 10mM pH6 0 的磷酸缓冲液平衡 的 CM Sephadex 层析柱 用 50mM pH8 8 的磷酸缓冲液洗脱 收集 OD280 大 于 0 1 的含有 L 天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液 2 DEAE Sepharose 层析柱纯化 将洗脱液调 pH7 0 过用 10mM pH7 0 的 磷酸缓冲液平衡的 DEAE Sepharose 层析柱 用 50mM 的磷酸缓冲盐洗脱 收 集 OD280 大于 0 1 的含有 L 天门冬酰胺酶活性成分的洗脱液 3 4 4 亲和层析 1 连接组件 将数控层析冷柜 核酸蛋白检测仪 自动部分收集器以及 Ni NTA Sefinose Resin Kit 层析试剂盒中的相应组件正确组装好 并通好电源 设定层析柜温度 为 4 2 柱平衡 实验室已配置好的柱子 用将母液稀释后的 1 PBS buffer 使柱平衡 3 调零 向柱中流加 1 PBS 缓冲液进行调零 并调节核酸蛋白仪检测仪至波长 280 nm 透过率 T 为 100 灵敏度为 0 2 A 4 上样 用移液器吸取粗酶液进行上样 5 洗涤杂蛋白 上样后 用含有 5 mmol 甘恶啉 0 5mol 氯化钠 20 mmol 氨基丁三醇 pH8 0 的 WB 洗脱液洗掉柱子上的杂蛋白 同时收集 A280下各示数的穿透液 当核酸蛋白检测仪示数在 A280下降到不再变化时结束 结束洗涤过程 6 洗脱 AnsB 蛋白 用含有 60 mmol 咪唑 0 5 mol 氯化钠 20 mmolTris pH 8 0 的洗脱液通过 层析柱洗脱吸附在柱子上的 AnsB 蛋白 同时自动采集 A280下不同数值的 WB 当一直在 A280下降的示数不再变化 收集相应示数下的蛋白洗脱液 7 柱处理 向柱中加入 5 个柱容积的 1 PBS 缓冲液 再加入 3 个柱体积的纯度为 0 2 的酒精 柱子保存在冰箱冷藏室中 3 4 5 AnsB 蛋白浓缩除盐 将 Pall 超滤管进行预处理 并使用它对 AnsB 蛋白洗脱液浓缩除盐 向 Pall 管内加入 20 mL 蛋白洗脱液 在 4000 r min 下离心 60 min 使浓缩液约 为 2 mL 取出超滤装置 将样品储层的浓缩样品转移到干净 EP 管中 置于 80 保藏 3 5 AnsB 蛋白的鉴定 3 5 1 Bradford 测定 ansB 蛋白浓度 6 支试管 编号 加试剂 配方见表 1 3 加好后混匀 向试管 1 6 内 加 入考马斯亮蓝 G250 试剂 各 3 0 mL 混匀 静置在室温中 5 min 测定 595 nm 波长下的吸光度值 以 1 号管为空白对照 绘制标准曲线 用 595 nm 波长 下的吸光度值作为纵坐标 横坐标为标准蛋白含量 制作标准曲线 表 1 3 标准蛋白液配制成分表 3 支试管 向每支加入 20 L 浓缩液 80 L 双蒸水 混合均匀 向装有样 品的 3 支试管中 各加入染色试剂 3 0mL 混合均匀 在室温下静置 5 min 测 595 nm 波长下的吸光度 用上表试管 1 为调零溶液 取三个重复样品中蛋白含 量的平均值 通过标准曲线方程计算出标准蛋白的量 3 5 2 SDS PAGE 定性分析 AnsB 蛋白 1 制胶板安装后 加入少量水 静置 20 min 液面无变化 以防实验时胶液 泄漏 用吸水纸吸净水 2 分离胶的配制和加入 表 1 4 SDS PAGE 分离胶的配方 按上表所示 按顺序依次加入各试剂配制分离胶 加入 10 AP 和 TEMED 后立即进行混匀 将配置好的分离胶沿边缘缓慢加入到制胶板中 以防产生气 泡 分离胶的位置在前玻璃板顶端向下 1 5 cm 左右 在分离胶上笼盖一层 ddH2O 封住胶面 平整凝胶表面 静置 30 min 聚合的凝胶 需要仔细看分离 胶和双蒸水层分离的界面 以检测是否凝固胶 还需要轻微地倾斜一下模具 3 用滤纸除去上面的双蒸水水层 不留一点残余液体 4 浓缩胶的配制和加入 按下表所示 按顺序依次加各试剂配制 3 mL 的浓缩凝胶 迅速把配制好的 胶液用移液枪加到聚合的分离胶之上 插入梳子 前玻璃板顶端不能超过梳子 齿底部 小心避免混入气泡 将胶板固定在电泳槽上置于室温下 等待 30 min 可见聚合的凝胶 表 1 5 SDS PAGE 分离胶的配方 5 AnsB 蛋白样品处理 取 5 倍浓度的蛋白上样 buffer 0 02mL 与 0 08 mL 的样品混匀 沸水浴 5 min 快速离心一次 迅速切断离心机电源 取 1 3 4 2 6 中收集的诱导前样品按上述操作处理 6 电泳 在电泳槽中放入聚合后的胶块 将其沉没在 1 电极 buffer 中 安装好电泳 仪组件 两手按住电泳槽两侧 迅速拔出梳子 以防加样孔破裂 电泳槽的加 样孔中加蛋白 Marker 作为蛋白大小的 标尺 依次加入处理后的诱导前蛋白样 品和处理后的 ansB 样品 打开电泳仪电源 上槽下槽分别接负 正极 设定开 始的电流大小为 20 mA 开始的电压为 80 V 等四溴苯酚磺酞前端穿过浓缩胶 后 调整电泳仪通过电流大小为 30 mA 调整电压为 100 V 待溴酚蓝前沿到达 电泳槽底部时 切断电源 从电极上拔掉电极插头 取出玻璃板 7 染色与脱色 停止电泳 取出胶板 取下凝胶 此工程需要带手套进行 用清水洗胶 将分离胶放入考马斯亮蓝 R 250 染色液中缓慢摇动 40 r min 染色 30 min 小 心不要将胶撕破 染色后 取出胶 回收染色液 将胶漂洗 然后放入脱色液 中缓慢摇动 40 r min 当胶由蓝色变成无色后 条带清楚的显示出来 用凝胶 成像仪拍照并做分析 3 5 3 肽图谱分析 肽图分析是 rDNA 产品质控的重要手段之一 通过肽图分析 可从一级结构 研究重组产品与天然品的同质性 本文用 RP HPLC C8 法检测重组产品与天然 产品经胰蛋白酶裂解后的肽图谱 若重组产品与天然产品具有相同的指纹图谱 则它们具有相同的一级结构 进一步验证了它们的同质性 1 样品的处理 样品经脱盐 冻干 1 NH4HCO3溶解至 1 0 mg ml 按 1 30 W W 加入 胰蛋白酶 37 0 5 保温 16 h 50 冰醋酸终止反应备用 2 色谱条件 流动相 A 为 0 1 TFA 水 B 为 0 1 TFA 乙腈 水 80 20 梯度 0 60 min B 0 30 60 120 min B 30 38 120 175 B 38 80 流速 0 2 ml min 上样量 自动进样 50 l 检测波长 210 nm 3 5 4 紫外扫描图谱 取比活力为 220 U mg 1的 L 天门冬酰胺酶 溶解于蒸馏水中 在 200 400 nm 测定吸光度 得到紫外吸收图谱 分析最大吸收所在位置 3 5 5 等电点的测定 取比活力为 220 U mg 1的 L 天门冬酰胺酶样品 10 g 进行等电聚焦电泳 测定重组蛋白的等电点 3 6 L 天冬酰胺酶纯化过程中的酶活力监控 3 6 1 酶活力测定方法 采用纳氏 Nessler s 试剂显色法进行 L 天门冬酰胺酶的活力测定 分别取 0 2 mL 经蔗糖溶液提取并处理而得到的粗酶液 加入 0 5 mL 浓度为 0 04mol L 的 L 天冬酰胺溶液 0 3 mL Tris HCL 缓冲液 在 37 下水浴 20 min 加入 1 mL l5 的三氯乙酸终