盐酸氨溴索口腔崩解片在健康志愿者及生物等效性.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除盐酸氨溴索口腔崩解片在健康志愿者的生物等效性许艳华1，薛洪源1，杨汉煜2，贺文涛1，王宇奇1，贾丽霞1（1.白求恩国际和平医院 临床药理室，河北 石家庄 050082；2. 石药集团中奇制药技术有限公司，河北 石家庄 050011）摘要 目的: 研究盐酸氨溴索口腔崩解片的人体生物利用度和生物等效性。方法:采用随机交叉试验设计，20名健康男性志愿者单剂量口服试验制剂盐酸氨溴索口腔崩解片与参比制剂盐酸氨溴索片60 mg，用液相色谱-串联质谱法测定血浆中氨溴索的浓度，计算两药的药动学参数。结果:单剂量口服试验与参比制剂后氨溴索的Cmax分别为（84.729.3）和（81.228.2）ngmL-1，tmax分别为（1.70.5）h和（1.80.4）h，t1/2分别为（7.90.9）h和（8.31.0）h，AUC0-24h分别为（638.7180.8）nghmL-1和（591.4148.3）nghmL-1，试验制剂的相对生物利用度为（108.216.5）%。结论:试验制剂与参比制剂具有生物等效性。关键词 盐酸氨溴索；口腔崩解片；相对生物利用度；生物等效性；药动学；液相色谱-串联质谱法中图分类号 文献标识码 A 文章编号 10015217Bioequivalence of ambroxol hydrochloride orally disintegrating tablets in healthy volunteersXUE Hong-yuan1, YANG Han-yu2, HOU Yan-ning1, HE Wen-tao1, WANG Yu-qi1, JIA Li-xia1(1. Dep. of Pharmacology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, China; 2. Shijiazhuang Pharmaceutical Group Co. Ltd. Zhongqi Corporation, Shijiazhuang 050011, China)Abstract: OBJECTIVE To study the bioequivalence and relative bioavailability of ambroxol hydrochloride orally disintegrating tablets. METHODS A single oral adminstration of 60 mg test and reference tablets were given to 20 healthy male volunteers according to a randomized crossover design. The concentrations of ambroxol in plasma were determined by a HPLC/MS/MS method. The pharmacokinetic parameters and bioavailability of test tablets were compared with those of reference tablets. RESULTS After a single oral adminstration of 60 mg test and reference tablets, the pharmacokinetic parameters were as follows: Cmax were (84.729.3) and (81.228.2) ngmL-1, tmax were (1.70.5) and (1.80.4) h, t1/2 were (7.90.9) and (8.31.0) h, AUC0-24h were (638.7180.8) and (591.4148.3) nghmL-1, The relative bioavailability of tested tablets was (108.216.5) %. CONCLUSION The two preparations were bioequivalent.KEY WORDS: ambroxol hydrochloride; orally disintegrating tablet; relative bioavailability; bioequivalence; pharmacokinetics; HPLC/MS/MS盐酸氨溴索（ambroxol hydrochloride）为溴己新的活性代谢产物，能促进肺表面活性物质的分泌及气道液体分泌，促进黏痰溶解，显著降低痰黏度，增强支气管黏膜纤毛运动，促进痰液排出，改善通气功能和呼吸困难状况，主要用于急、慢性呼吸道疾病引起的痰液黏稠、咳痰困难等，为目前临床上常用的祛痰药。口腔崩解片是近几年出现的一种新剂型，它可利用普通片剂生产设备就可制作；其置入口腔内，不用水或用极少量水就可在口腔内吸收水分，迅速崩解成无沙砾感的细粉，随吞咽动作进入消化道，吸收后产生药理作用，因而具有广阔的研究发展前景。本试验采用液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的方法测定血浆中氨溴索的浓度，研究了国产盐酸氨溴索口腔崩解片与普通片在人体的相对生物利用度，观察并评价两种制剂的生物等效性，为盐酸氨溴索口腔崩解片的药代动力学质量评价和临床合理用药提供依据。1 仪器与试药质谱仪：API 4000型液相色谱三重四级杆质谱联用仪，配有电喷雾离子化源（ESI源），数据系统Analyst 1.4 软件，美国ABI公司；液相色谱输液泵：Agilent 1100系统：四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱，美国Agilent公司。AG-135分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB3200型超声波清洗仪，上海音波声电科技公司。试验制剂：盐酸氨溴索口腔崩解片（T药），规格：30mg/片，石家庄四药有限公司生产，批号：041201；参比制剂：盐酸氨溴索片（R药，商品名沐舒坦），规格：30mg/片，上海勃林格殷格翰药业有限公司，批号：484060；盐酸氨溴索对照品，含量99.4%，批号：040801，河北省药品检验所提供；盐酸维拉帕米（verapamil hydrochloride）对照品，批号：02239601，中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯），Fisher化学公司；乙酸铵（色谱纯），Tedia化学公司；甲酸（分析纯），天津市光复精细化工研究所；水为娃哈哈饮用纯净水；其余试剂均为分析纯。2 方法与结果 2.1 研究对象 20名健康男性志愿者，年龄（23.31.9）岁，体重（67.05.4）kg，身高（1.740.05）m，体重指数（22.11.1）kg/m2；试验前经病史询问和体格检查，心电图、胸透、肝功、肾功、血尿常规等均为正常，且试验前2周及试验期间未服用任何药物并禁用烟酒及其它含咖啡因、柯柯碱、茶碱的饮料，避免剧烈运动。试验经医院医学伦理委员会审查、批准备案，所有志愿者均明确本试验的目的与要求，并在试验前自愿签署知情同意书。2.2 试验设计 采用两制剂双周期交叉试验设计，将志愿者随机分为两组，分别服用试验或参比制剂60 mg。志愿者于试验前12 h吃清淡晚餐后禁食，试验当日晨空腹口服药，试验制剂是将药片直接放于舌面，无须咀嚼，待药片迅速崩解后吞咽，参比制剂用温开水200 mL送服，服药后2 h允许饮水，4、10 h后进食统一标准餐。服药前及服药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h，分别从肘静脉取血3 mL，置肝素抗凝管中放置1 h后离心（3 000 rmin-1）10 min，分离血浆，-20 冻存、备用。7天后交叉服药，重复试验。2.3 血浆样品测定2.3.1 色谱条件 Restek Allure C18分析柱（5 mm，4.650mm），Restek公司； C18保护柱（4 3.0 mm）Phenomenex，Torrance，USA；流动相：甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液=55：5：40；流量：0.5 mLmin-1 ；柱温：20；进样量：5 L。质谱条件 离子源为电喷雾离子化（ESI）源；喷雾电压IS 为5 000 V；雾化温度为500 ；雾化气NEB（GAS 1）为40 Lmin-1；帘气CUR 为25 Lmin-1；碰撞气CAD为4 Lmin-1；辅助气AUX（GAS 2）为40 Lmin-1；检测方式为负离子；扫描方式为多离子反应监测（MRM），用于定量分析的离子反应分别为m/z 379.1 m/z 264.0（氨溴索），m/z 455.5 m/z 165.2 （内标，维拉帕米），碰撞诱导解离（CID）电压分别为25 V（氨溴索）和45 V（内标）；驻留时间（dwell time）均为200 ms。2.3.2 血样处理 取血浆样品100 mL，依次加入甲醇100 mL、5 ngmL-1内标溶液200 mL，涡旋振荡混匀20 s，10 000 rmin-1离心5 min后，取上清液，5 mL进样测定。氨溴索和内标的tR分别为1.48、1.74 min。在此条件下，空白血浆中的内源性物质不干扰氨溴索及内标的测定，结果见图1。2.3.3 标准曲线及线性范围 精取盐酸氨溴索对照品27.4 mg（相当于氨溴索25.0 mg），用甲醇稀释，得含氨溴索分别为500、400、150、50、15、5、2 ngmL-1的系列标准溶液。精取盐酸维拉帕米27.0 mg（相当于维拉帕米25.0 mg）用甲醇稀释成浓度为5 ngmL-1的内标工作液。取空白血浆100 mL，加入100 mL上述系列标准溶液，其余按“2.3.2”项下“加入甲醇100 mL”后操作，建立标准曲线。分别以氨溴索的浓度为横坐标，氨溴索与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法（W=1/X2）进行回归计算，求得直线回归方程，即为标准曲线。血浆中氨溴索浓度的线性范围为2.0500 ngmL-1，其直线回归方程为：Y = 0.906 3 C-0.003 1（r =0.999 8），定量下限为标准曲线的最低浓度点2.0 ngmL-1。图1 氨溴索与内标的HPLC-MS/MS色谱图A.空白血浆；B. .空白血浆中加入氨溴索和内标；C. 受试者服药1.0 h后血浆样品。1-氨溴索(m/z) 264.0；2-内标(m/z) 165.2Figure 1 Chromatograms of ambroxol and internal standard by multiple reaction monitoring ( MRM ) scan mode A. Blank plasma; B. Blank plasma spiked with ambroxol and verapamil; C .Plasma sample1.0 h after an oral dose of 60 mg ambroxol hydrochloride orally disintegrating tablets to a healthy volunteer; Peak1. Selected mass (m/z) 264.0 (ambroxol); Peak 2. Selected mass (m/z) 165.2 (verapamil)2.3.4 精密度与回收率 取空白血浆100 m L，按“2.3.3”项下制备低、中、高三个浓度点（5.0，50，400 ngmL-1）的质控样品（QC），每个浓度6份，每天制备并测定，随行两条标准曲线，连续测定4天，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，将测定结果进行方差分析，求算方法的精密度和方法回收率。上述3个浓度点的血浆样品的峰面积与其标准溶液经同倍数稀释后直接进样峰面积的比计算提取回收率。本法测定3个浓度血浆样品中氨溴索的平均提取回收率为101.1 %，内标的提取回收率为101.4 %，3个浓度日内RSD2.61 %（n=24）、日间的RSD7.68 %（n=4）及方法平均回收率为98.103.88 %（n=24）。2.3.5 样本稳定性考察 考察氨溴索在血浆中（5.0，400 ngmL-1）室温放置4 h和血浆样品处理后室温放置4、24 h以及3次冷冻解冻循环的稳定性。结果表明，氨溴索在上述条件下均稳定，RE均15%。2.3.6 数据的质量保证 测定受试者血样时，每个分析批随行标准曲线，并制备低、中、高三个浓度的多份质控（QCs）样品，质控样品数大于未知样品总数的5%；以该批标准曲线计算质控样品的浓度，RE均15%。如果分析过程中由于操作错误或仪器问题使数据产生偏差，则对当日所有样品进行复检，并弃去原值；对于某一批的质控样品不符合规定的，则此批重做；对于测试过程中的异常点进行复检；对于测得值与根据药时曲线所估计的值相差较大的样品进行复检。如果复检值与原值的偏差在15 %以内，取原值；如果复检值与原值的偏差大于15 %以上，进行第二次复检。本试验没有进行复检的样品。2.3.7 数据处理 使用DAS 1.0统计软件进行数据处理。将20名受试者的经时血药浓度录入该程序，分别得到两制剂氨溴索的AUC0-24h、AUC0-、t1/2、tmax、Cmax等药代动力学参数。tmax进行非参数秩和检验，Cmax、AUC0-24h、AUC0-经对数转换后做方差分析，并进行双向单侧t检验。结果表明，两制剂的tmax、Cmax、AUC0-24h、AUC0-均无显著性差异；试验制剂的Cmax的 90%可信限落在参比制剂的70%-143%之间，AUC0-24h、AUC0-的90%可信限落在参比制剂的80%125%范围内，以AUC0-24h计算受试制剂的相对生物利用度为（108.216.5）%，故认为两制剂生物等效。20名受试者口服单剂量两制剂后的平均血药浓度-时间曲线及主要药代动力学参数见图2、表1、表2。表1 20名健康受试者单剂量口服60mg盐酸氨溴索口腔崩解片后的主要药动学参数（S）Table 1. Main pharmacokinetic parameters and relative bioavailability of ambroxol after a single oral at the dose of 60 mg in 20 volunteersParameterTestReferenceCmax（ngmL-1）84.729.381.228.2tmax （h）1.70.51.80.4t1/2（h）7.90.98.31.0AUC0-24h （nghmL-1）638.7180.8591.4148.3AUC0- （nghmL-1）717.5211.1671.1173.2Fr（%）108.216.5图2 20名健康志愿者口服单剂量60mg盐酸氨溴索口腔崩解片后的平均药时曲线Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of ambroxol after a single oral dose of 60 mg in 20 healthy volunteers (n=20, meanSD)表2 双向单侧t检验结果 (=0.05)Table 2 The result of the two one-side t-testst1t2t1-0.05(18)90% confidential interal (%)Ln (AUC0-24h)9.324.911.73101.47113.13Ln (AUC0-)9.185.401.73100.47111.73Ln (Cmax)7.816.381.7395.00113.153 讨 论氨溴索血药浓度的测定方法有HPLC法1, 2、GC-ECD法3、毛细管区带电泳法等4，在使用HPLC法时，样品预处理步骤繁琐1, 2；再者，血浆中的药物浓度较低，受试者服药剂量多超过常用量。本试验受试者的服药剂量为60mg，不仅符合处方及新编药物学的要求，而且为临床用药提供可行的参考，在试验过程中未见有临床意义的不良反应发生。本试验采用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中氨溴索的浓度，仪器灵敏度高，最低检测浓度可达2.0 ngmL-1，测定时间仅为2.2 min，两日既可完成全部血样的测定；血浆样品采用直接沉淀蛋白法，操作简单，准确度、精密度均好。本文所测每种制剂的个体间Cmax、AUC0-24 h均有高度统计学差异，而个体间的tmax无统计学差异，例如参比制剂Cmax变化范围为49.1145.0 ngmL-1、AUC0-24 h为350.3919.0 nghmL-1。本文所测参比制剂Cmax值（60mg，81.228.2 ngmL-1）与文献1（90mg，127.236.2 ngmL-1）接近，低于文献 2（90mg，201.623.8 ngmL-1）；比较2篇文献1, 2（受试者数量分别为10、8名），二者出自同一实验室，仪器、药品、试验方法均相同，但同种参比制剂Cmax、AUC0-24 h值存在明显差异，tmax无显著差异。由上述结果可见，盐酸氨溴索在人体内代谢的速度无明显差异，但其代谢程度存在显著差异，这可能与其主要在肝脏代谢，受肝药酶的影响有关，国内文献未见相关报道。故在人体生物等效性评价时需增加受试者数量，在临床应用时应注意个体化给药。本试验两制剂的t1/2约为8