冠心病痰瘀证候与Ｅ选择素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系研究

医学论文医学论文 冠心病痰瘀证候与 选择素 及 基因多冠心病痰瘀证候与 选择素 及 基因多 态性的关系研究态性的关系研究 作者 洪永敦 朱会英 陈宇鹏 吴辉 莫鸿辉 黄衍寿 史成军 摘要摘要 目的 从基因多态性角度探讨冠心病痰瘀证的实质 方法 入选 例研究对 象 其中正常组 例 冠心病组 例 应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 核苷酸分型技术检测血清E选择素 E sel ectin 及 基因型 同时采用酶联免疫吸附法测定血清E selectin浓 度 结果 冠心病痰瘀证组E selectin 的 基因型 等位基因 E selectin 的 基因型 等位基因频率高于正常组 但经过统计学分析 两者之 间差异无显著性意义 冠心病痰瘀证型组患者血清E selectin水平 高于正常组 结论 冠心病痰瘀证可能与 选择素 的 等位基 因 选择素 的 等位基因有一定的相关性 关关键词键词 冠状动脉疾病 痰证 血瘀 E选择素 血液 冠心病是严重影响人类健康生活的疾病之一 炎症在冠心病的形成发展过程中 起着重要作用 遗传流行病学研究显示冠心病的发病有遗传因素的作用 目前相 继发现一些基因多态性影响脂质代谢 炎症反应 血栓形成及血管收缩与舒张等 病理生理过程 与冠心病发生的危险性增加关系密切 痰瘀证候是冠心病的常见 证候 本研究采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性方法 检测冠心病痰瘀证候患者的血清 选 择素 E selectin 及 基因型 以期发现其中的内在联系 现将结果 报道如下 1研究研究对对象象 1 1资料来源研究对象均来源于 年 月 年 月在广州中医药大学 第一附属医院心内科临床确诊为冠心病心绞痛和急性心肌梗死的住院病例 部分 病例经冠状动脉造影明确诊断 同时设立正常组作为对照 正常组为健康志愿者 所有研究对象均为汉族广东省常住人口 1 2诊断标准诊断标准参照 年国际心脏病学会及世界卫生组织关于缺血性 心脏病的诊断 辨证标准参照中华人民共和国中医药行业标准 年 中 医病证诊断疗效标准 中的胸痹心痛辨证分型及沈绍功等 中医心病诊断 疗效标准与用药规范 具体中医辨证标准如下 痰浊证组 胸脘闷痛痞满 口 黏乏味 纳呆脘胀 苔腻或黄或白滑 脉滑或数 血瘀证组 胸脘刺痛固定 面 晦唇青 怔忡不宁 舌质紫暗或见紫斑或舌下脉络紫胀 脉涩或结代 痰瘀证 组 胸痛 心前区痛或痛引肩背 或胸脘痞满 舌质紫暗 或有瘀点 瘀斑 舌苔厚 腻 脉弦或滑 同时具备以上四大主症者可辨证为痰瘀证 1 3一般资料入选研究对象共 例 其中正常组 例 男 例 女 例 平均 年龄为 岁 体质量指数为 kg m2 冠心病组 例 其中痰瘀证组 例 男 例 女 例 平均年龄为 岁 体质量指数为 kg m2 血瘀证组 例 男 例 女 例 平 均年龄为 岁 体质量指数为 kg m2 痰浊证 组 例 男 例 女 例 平均年龄为 岁 体质量指数为 kg m2 各组在年龄 性别 体质量指数方面比较差异无显著性意义 具有可比性 2研究方法研究方法 2 1标本收集选择血清 全血作为观察样本 病人入院后次日凌晨 时进行采血 标本放置于冰箱 并于当日对所需血清标本进行以3000r min离心10min 取上 清液 置于 冰箱保存 全血标本置于 冰箱保存 2 2检测指标及方法E selectin浓度采用酶联免疫吸附法测定 试剂盒由美国R 外周血白细胞 的提取 操作方法按照试剂的说明书进行 全部受试者均取外周静脉血2mL 抗凝 采用Qiagen DNA抽提试剂盒提取基因组 步骤如下 取 mL离心管 注明名字及 编号 管底加ProteaseK 20 L 全血 L Buffer AL 200 L 混匀后 水浴 min 取无水乙醇 L加入管中 混匀 转移入Sp in Column 8000r min离心 min 弃滤液 Spin Column转移入清洁收集管中 加 液 L 8000r min离心 min 弃滤液 Spin Column转移入另一清洁管中 加 液 L 8000r min离心 min 弃滤液 Spin Column转移入已标名字的 mL离心管中 加Buffer AE或蒸馏水 L 8000r min离心 min 保存备用 聚合酶链反应 引物序列 引物序列参考文献 并结合Pr imer Express Software 2 0版设计 引物序列见表 全部引物由Invitrogen 公司合成 反应体系 倍PCR Buffer L mmoldNTPs L 上下游引物各 pmol Taq酶 膜板 L 加无菌 去离子水至 L 反应条件 min预变性 0s 各外显子参照上述 退火温度 共 个循环 2 延伸 min 反应后检测 取 L 扩增产物用 0g L的琼脂糖凝胶进行电泳 产物在 0g L琼脂糖中电泳检测后 保存备用 结果 产物经 0g L琼脂糖凝胶电泳鉴定 片段大小符合 预先设计 限制性片段长度多态性分析 HphI反应体 系 PCR 反应混合物 10 L 约1 g of DNA 10倍NEB Buffer2 L HphI 1 L 加水 无核酸酶试剂至20 L 温和震荡 短暂离心数秒 酶切过夜 取1 0 L酶切产物用 0g L琼脂糖凝胶进行电泳 PstI反应体系 PCR 反应混合物 10 L 约 1 gof DNA 倍H Buffer L PstI 1 L 加水 无核酸酶试剂至 L 温和震荡 短暂离心数秒 酶切4h 取10 L酶切产物用 0g L琼脂糖凝胶进行电泳 表1PCR引物序列 Table 1PCR primer sequence基因PCR 引物 5 3 退火温度 长度 bp G98TTGCCCAAAATCTTAGGATGCAAGC CCAGGGAAGAACACAT59332S128RAGTAATAGTCCTCCTCATCATGACCA TCTCAAGTGAAGAAAGA55186 2 统计学方法采用 软件包进行分析 分类资料的组间比较采用 2检验 计量资料采用 s表示 两组以上均数的组间比较采用One way ANOVA检验 用Bonferroni方法进行两两比较 基因型和等位基因频率采用直接 计数法统计 研究对象与Hardy Weinberg平衡的符合程度 基因型和等位基因频 率的组间比较采用 2检验 3结结果果 各组E selectin水平比较表 结果显示 冠心病各证型组患者血清E selectin 水平均高于正常组 但各证型组间比较 差异无显著性意义 表2各组E selectin水平比较 与正常组比较 2各组E selectin G98T及 基因型比较将符合纳入标准且资料完备的 例应用 测定基因型 其中正常组 例 痰瘀组 例 血瘀组 例 痰浊组 例 因血 瘀组和痰浊组检测例数较少 故将其合并 例 为非痰瘀组 以与痰瘀互结证候 的痰瘀组区别 再进行统计分析 1E selectin的 酶切结果见图 3 2 2E selectin的S128R酶切结果见图2 3 2 3各组E selectin的G98T基因型和等位基因的频率分布表3结果显示 冠心 病痰瘀组GG基因型 G等位基因频率高于正常组 GT基因型 T等位基因频率低 于正常组 并符合Hardy Weinberg平衡 但两者之间差异无显著性意义 各组之间的基因型分布 等位基因频率比较差异无显著性意义 HphI酶切 GG 194 138 GT 332 194 138 TT 332 1 2为GT基因型 3 4 5 6 7为GG基因型 8为 PCR产物 未见TT型图1E selectin G98T酶切结果 Figure 1Digestion of E selectin G98T with enzyme PstI酶 SS 123 63 SR 186 123 63 RR 186 1为PCR产物 2 3 5 7为SS基因型 4 6为 SR基因型 N为阴性对照 未见RR基因型图2E selectin S128R酶切结果 Figure 2Digestion of E selectin S128R with enzyme表3各组E selectin的 基因型和等位基因的频率分布 Table 3The frequency of genotype and allele of E selectin G98T s p 组别 基因型 等位基因 正常组1611 68 8 5 31 2 27 84 4 5 15 6 痰瘀组 非痰瘀组 3 2 4各组E selectin的S128R基因型和等位基因的频率分布表 结果显示 冠心 病痰瘀组 基因型 等位基因频率高于正常组 基因型 等位基因频率低 于正常组 并符合Hardy Weinberg平衡 但两者之间差异无显著性意义 各组之间的基因型分布 等位基因频率比较差异无显著性意义 表 各组E selectin的 基因型和等位基因的频率分布 讨论讨论 冠心病属中医胸痹心痛范畴 主要病机为痰瘀互结 心脉痹阻 其病位在心脉 发病多与肝 脾 肾三脏功能失调有关 如肾虚 肝郁 脾失健运等 病理变化主 要表现为本虚标实 虚实夹杂 以痰瘀痹阻为标实的特点 曹洪欣等 研究认 为冠心病的病机为本虚标实 本虚以心阳虚为主 标实除血瘀 痰浊 气滞外 痰 瘀互结与冠心病直接相关 痰瘀互结证是冠心病的常见证候 痰瘀互结是冠心病 发病的重要病理因素 痰瘀同治法是治疗冠心病的常用法则 本课题组的临床研 究共收集冠心病 例 其中痰瘀证占 是冠心病的主要证型 这与文献 报道的资料相符合 冠心病是一种多因素 多基因遗传疾病 且与环境因素 密切相关 遗传因素在冠心病人群中可能起着不可忽视的重要作用 近年来 越 来越多的证据表明 炎症在冠心病的发生 发展和预后过程中起着重要的作用 炎症反应的激活可能是引起斑块不稳定而导致急性冠脉综合征的主要因素 E s electin参与多种白细胞 包括粒细胞 巨噬细胞 单核细胞等 以 记忆性 细 胞亚群的黏附与聚集 它在免疫 炎症及动脉粥样硬化的形成过程中起着重要作 用 杨立森等 的研究表明 冠心病患者血清E selectin水平增高 反映了病情 的严重程度 可作为可疑胸痛患者的辅助鉴别诊断手段 有研究证实E selectin 基因第 和第 外显子分别存在 和 多态性 这两种多态性可能影响E selectin基因表达和功能 并可能与心血管疾病 尤其是与冠心病发病有密切关系 文献报道 在人粥样硬化斑块处 E selectin的表达增加 冠心病患者 血清可溶性E selectin也有不同程度的升高 通常认为E selectin水平的变 化反映了细胞表面成分的翻转和蛋白质的水解 可作为疾病活动的标志 林帆等 研究显示了E selectin 多态性与冠心病的发生有关 等位基因可能是冠心病的危险因素 李 艳等 研究表明E selectin 基因多态性与冠心病的发病有关联 并可影响血清E selectin水平 等 位基因可能是冠心病发病的遗传易感基因 E selectin基因 多态性在冠心 病发病中可能不起直接作用 E selectin 经 扩增产物片段大小为 bp 根据限制性内切酶PstI酶切片段的 情况 基因型有3种 型 bp两条带 型 bp三条 带 型 bp一条带 本研究结果显示 E selectin 的基因型为 基因型 基因型 未发现 基因型 其中正常组 基 因型携带者占 基因型携带者占 等位基因频率为 等位基因频率为 冠心病痰瘀组 基因型携带者占 基因型携带者占 等位基因频率为 等位基因频率为 冠心病痰瘀组E selectin 的 基因型 等位基因频率高于正常组 并符合Hardy Weinberg平衡 但两者之间差异无显著性意义 E selectin 经 扩增产物片段大小为 bp 根据限制性内切酶HphI酶切片段的 情况 基因型为 型 8bp两条带 型 bp三条带 型 bp一条带 本研究结果显示 E selectin 的基因型为 基因型 基因型 未发现 基因型 其中正常组 基因 型携带者占 基因型携带者占 等位基因频率为 等位基因频率为 冠心病痰瘀组 基因型携带者占 基 因型携带者占 等位基因频率为 等位基因频率为 冠心病痰瘀组E selectin 的 基因型 等位基因频率高于正常组 并符合Hardy Weinberg平衡 但两者之间差异无显著性意义 目前 关于冠心病与E selectin 及 基因多态性的研究报道不少 但尚未能形成统一的意见 这可 能与冠心病为多基因遗传疾病存在一定的关联 不同基因的多态性在冠心病的 发病过程可能有着直接或间接的联系 然而 关于冠心病中医证型与E selectin 及 基因多态性的研究报道尚未发现 本研究初步探讨了冠心病痰 瘀证与E selectin 及 基因多态性的关系 推测冠心病痰瘀证可能与E selectin 的 等位基因及E selectin 的 等位基因有关 因本研究样本量少 未得出统计学差异 但这将为冠 心病痰瘀证的研究提供了新的思路 参考文献参考文献 国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组 缺血性 心脏病的命名和诊断标准 中华心血管病杂志 中华人民共和国中医药行业标准 中医病证诊断疗效标准 南京 南京大学出版社 沈绍功 王承德 闫希军 中医心病诊断疗效标准与用药规范 北京 北 京出版社 曹洪欣 张华敏 痰瘀互结与冠心病发病机理辨识 中医药学刊 洪永敦 黄衍寿 吴辉 等 冠心病中医证候与炎症因子关系的临床研究 广州中医药大学学报 Blann A D McCollum C N Lip G Y Relationship between plasma marker of endothelial cell integrity and the Framingham cardiovascular disease risk factor scores in apparently healthy individuals Blood Coagulation Fibrinolysis 2002 13 513 Shyu K G Chang H lin C C et al Circulating intercellular adhesion molecule 1 and E selectin in patients with acute coronary syndrome Chest 1996 109 1627 杨立森 林媛豪 石学宁 等 可溶性 选择素对冠心病心绞痛的诊断意义 临床心血管病杂志 Zheng F Chevalier J A Zhang L Q et al An Hphl polymorphism in the E selectin gene is associated with premature coronary artery disease Clin