木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取 分离纯化及其生物学研究综述及实验方法木瓜蛋白酶的提取 分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13 生物技术第二大组第二小组生物技术第二大组第二小组 组员 王玓玥 组长 王子贺 王思瑶 王宇涛 王守鑫 谭国组员 王玓玥 组长 王子贺 王思瑶 王宇涛 王守鑫 谭国 栋栋 一 一 研究背景 研究背景 在经济飞速发展的今天 人们的生活水平已远远不只在于吃饱在经济飞速发展的今天 人们的生活水平已远远不只在于吃饱 穿暖 食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注 绿色穿暖 食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注 绿色 健康的生活也成为大家共同的追求 木瓜蛋白酶以它自身耐热健康的生活也成为大家共同的追求 木瓜蛋白酶以它自身耐热 及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业 如何分离纯化得到及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业 如何分离纯化得到 高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点 本小组高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点 本小组 便也以此为研究主题展开实验 便也以此为研究主题展开实验 二 二 木瓜蛋白酶基本介绍 木瓜蛋白酶基本介绍 木瓜蛋白酶 又称木瓜酶 是一种蛋白水解酶 木瓜蛋白酶是木瓜蛋白酶 又称木瓜酶 是一种蛋白水解酶 木瓜蛋白酶是 番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶 广泛地存在于番木番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶 广泛地存在于番木 瓜的根 茎 叶和果实内 其中在未成熟的乳汁中含量最丰富 瓜的根 茎 叶和果实内 其中在未成熟的乳汁中含量最丰富 木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸 属于巯基蛋白酶 它具有木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸 属于巯基蛋白酶 它具有 酶活高 热稳定性好 天然卫生安全等特点 这种蛋白水解酶 酶活高 热稳定性好 天然卫生安全等特点 这种蛋白水解酶 分子量为分子量为 2340623406 由一种单肽链组成 含有 由一种单肽链组成 含有 212212 个氨基酸残基 个氨基酸残基 至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位 他们分别是至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位 他们分别是 Cys25Cys25 His159His159 和和 Asp158Asp158 当 当 Cys25Cys25 被氧化剂氧化或与金属离被氧化剂氧化或与金属离 子结合时 酶的活力被抑制 而还原剂半胱氨酸 或亚硫酸盐 子结合时 酶的活力被抑制 而还原剂半胱氨酸 或亚硫酸盐 或或 EDTAEDTA 能恢复酶的活力能恢复酶的活力 木瓜蛋白酶是一种在酸性 中性 碱木瓜蛋白酶是一种在酸性 中性 碱 性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶 它的外观为白色至浅黄色性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶 它的外观为白色至浅黄色 的粉末 微有吸湿性 木瓜蛋白酶溶于水和甘油 水溶液为无的粉末 微有吸湿性 木瓜蛋白酶溶于水和甘油 水溶液为无 色或淡黄色 有时呈乳白色 几乎不溶于乙醇 氯仿和乙醚等色或淡黄色 有时呈乳白色 几乎不溶于乙醇 氯仿和乙醚等 有机溶剂 木瓜蛋白酶是一种含巯基有机溶剂 木瓜蛋白酶是一种含巯基 SH SH 肽链内切酶 具有蛋肽链内切酶 具有蛋 白酶和酯酶白酶和酯酶 的活性 有较广泛的特异性 对动植物蛋白 多肽 酯 酰胺的活性 有较广泛的特异性 对动植物蛋白 多肽 酯 酰胺 等有较强的水解能力 但几乎不能分解蛋白胨 木瓜蛋白酶的等有较强的水解能力 但几乎不能分解蛋白胨 木瓜蛋白酶的 最适合最适合 PHPH 值值 6 6 7 7 一般一般 3 3 9 59 5 皆可皆可 在中性或偏酸性时亦有 在中性或偏酸性时亦有 作用 等电点 作用 等电点 pIpI 为 为 8 758 75 木瓜蛋白酶的最适合温度 木瓜蛋白酶的最适合温度 5555 65 65 一般一般 1010 85 85 皆可皆可 耐热性强 在 耐热性强 在 90 90 时也不会完时也不会完 全失活 受氧化剂抑制 还原性物质激活 全失活 受氧化剂抑制 还原性物质激活 另外六个半胱氨 另外六个半胱氨 酸残基形成了三对二硫键酸残基形成了三对二硫键 且都不在活性部位 纯木瓜蛋白酶制且都不在活性部位 纯木瓜蛋白酶制 品可含有 品可含有 1 1 木瓜蛋白酶 分子量 木瓜蛋白酶 分子量 2100021000 约占可溶性蛋白 约占可溶性蛋白 质的质的 10 10 2 2 木瓜凝乳蛋白酶 分子量 木瓜凝乳蛋白酶 分子量 2600026000 约占可溶性 约占可溶性 蛋白质的蛋白质的 45 45 3 3 溶菌酶 分子量 溶菌酶 分子量 2500025000 约占可溶性蛋白 约占可溶性蛋白 质的质的 20 20 及纤维素酶等不同的酶 因此在食品 医药 饲料 及纤维素酶等不同的酶 因此在食品 医药 饲料 日化 皮革及纺织等行业得到广泛应用 是一类巯基蛋白酶日化 皮革及纺织等行业得到广泛应用 是一类巯基蛋白酶 广泛地存在于番木瓜的茎叶和果实中广泛地存在于番木瓜的茎叶和果实中 未成熟的乳汁中含量最未成熟的乳汁中含量最 高高 因其含量高 稳定性好 蛋白水解能力强因其含量高 稳定性好 蛋白水解能力强 对多种蛋白质均对多种蛋白质均 具有很好的降解作用具有很好的降解作用 目前已被广泛应用于各个行业目前已被广泛应用于各个行业 在食品中在食品中 木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化 啤酒澄清和鱼类加工等工艺中木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化 啤酒澄清和鱼类加工等工艺中 由由 于此酶为纯天然产物于此酶为纯天然产物 其开发前景广阔其开发前景广阔 运用蛋白质分离纯化的运用蛋白质分离纯化的 一般方法可将其制备出来并进行活力鉴定 一般方法可将其制备出来并进行活力鉴定 三 三 木瓜蛋白酶的提取木瓜蛋白酶的提取 1 1 过去的常规提取方法 过去的常规提取方法 1 1 烘干法 烘干法 在番木瓜浆液中加入保护剂 然后将浆液离心 取上清液放置在番木瓜浆液中加入保护剂 然后将浆液离心 取上清液放置 于鼓风干燥箱中 在于鼓风干燥箱中 在 5555 60 60 烘干 粉碎后即得到粗酶制品 烘干 粉碎后即得到粗酶制品 乙引等用这种方法所获得的酶得率为乙引等用这种方法所获得的酶得率为 23 1 23 1 但此法不利于酶活 但此法不利于酶活 的保持 其酶活力仅为的保持 其酶活力仅为 0 16 105U g0 16 105U g 且产品的纯度较低 且产品的纯度较低 2 2 单宁沉淀法 乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶 先 单宁沉淀法 乙引等用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶 先 将番木瓜乳汁离心 于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液 将番木瓜乳汁离心 于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液 不断搅拌 使溶液中单宁达到一定浓度 静置 沉淀单宁不断搅拌 使溶液中单宁达到一定浓度 静置 沉淀单宁 酶复酶复 合物 调节合物 调节 pHpH 值 沉淀后进行真空干燥 得到酶制品 结果表值 沉淀后进行真空干燥 得到酶制品 结果表 明 这种方法生产的酶得率较低 仅有明 这种方法生产的酶得率较低 仅有 7 3 7 3 但酶活力较高 但酶活力较高 为为 3 53 105U g3 53 105U g 但是这种方法存在环境污染等问题 但是这种方法存在环境污染等问题 2 2 目前较为常见的提取方法 目前较为常见的提取方法 1 1 超滤法 谭晶等用超滤技术分离木瓜蛋白酶 先将中空 超滤法 谭晶等用超滤技术分离木瓜蛋白酶 先将中空 纤维超滤膜洗净 经过处理后 控制一定压力和流量 进行超纤维超滤膜洗净 经过处理后 控制一定压力和流量 进行超 滤 木瓜蛋白酶是大分子物质 在超滤过程中被截留 而水及滤 木瓜蛋白酶是大分子物质 在超滤过程中被截留 而水及 小分子杂质透过膜 从而达到分离和纯化的目的 实验结果表小分子杂质透过膜 从而达到分离和纯化的目的 实验结果表 明 超滤后木瓜蛋白酶的活力是超滤前的明 超滤后木瓜蛋白酶的活力是超滤前的 1 221 22 倍 蛋白质含量倍 蛋白质含量 为超滤前的为超滤前的 2 82 8 倍 说明超滤后木瓜蛋白酶的纯度有所增加 倍 说明超滤后木瓜蛋白酶的纯度有所增加 但由于木瓜蛋白酶属于大分子物质 在超滤过程中会在膜表面但由于木瓜蛋白酶属于大分子物质 在超滤过程中会在膜表面 聚积而产生浓差极化现象 使超滤速率逐渐下降影响酶得率 聚积而产生浓差极化现象 使超滤速率逐渐下降影响酶得率 2 2 盐析法 王丽彬等曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶 盐析法 王丽彬等曾用硫酸铵沉淀法分离木瓜蛋白酶 在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液进行盐析 然后调在粗酶液中加入一定浓度的硫酸铵溶液进行盐析 然后调 pHpH 值 值 离心取沉淀 干燥 得酶产品 实验结果表明 用该法制备的离心取沉淀 干燥 得酶产品 实验结果表明 用该法制备的 木瓜蛋白酶纯度相对较高 酶的比活力达到了木瓜蛋白酶纯度相对较高 酶的比活力达到了 1184U mg1184U mg 适宜 适宜 作为化妆品成分 但这种方法由于用了大量的盐 使酶中灰分作为化妆品成分 但这种方法由于用了大量的盐 使酶中灰分 增加 同时降低了木瓜蛋白酶的活性 因此 盐析法并不是理增加 同时降低了木瓜蛋白酶的活性 因此 盐析法并不是理 想的木瓜蛋白酶提取方法 想的木瓜蛋白酶提取方法 3 3 絮凝法 絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合 絮凝法 絮凝法是在木瓜乳胶水提取液中添加某种化合 物 该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物 从而使酶物 该化合物能与木瓜蛋白酶生成难溶性的复合物 从而使酶 从溶液中沉淀析出 何继芹等研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白从溶液中沉淀析出 何继芹等研究了用絮凝技术纯化木瓜蛋白 酶 实验结果表明 在适宜的条件下进行絮凝处理 可使木瓜酶 实验结果表明 在适宜的条件下进行絮凝处理 可使木瓜 蛋白酶在这步的收率达蛋白酶在这步的收率达 9595 97 97 但这种方法提取专一性不强 但这种方法提取专一性不强 制得的木瓜蛋白酶纯度不高 杂质含量较高 制得的木瓜蛋白酶纯度不高 杂质含量较高 4 4 超声波法 超声波提取法作为一种新型的提取技术已经 超声波法 超声波提取法作为一种新型的提取技术已经 比较广泛地应用于天然植物有效成分的提取 超声波产生的空比较广泛地应用于天然植物有效成分的提取 超声波产生的空 化效应 一方面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力 并强化细胞化效应 一方面赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力 并强化细胞 内外的质量传输 另一方面破坏细胞壁 使细胞内含物更易释内外的质量传输 另一方面破坏细胞壁 使细胞内含物更易释 放 从而强化了提取过程 超声波形成的微射流效应也是提高放 从而强化了提取过程 超声波形成的微射流效应也是提高 提取率的一个重要原因 肖贵平曾用超声波法提取木瓜蛋白酶 提取率的一个重要原因 肖贵平曾用超声波法提取木瓜蛋白酶 选择新鲜的番木瓜 清洗后切块破碎 称取果肉 打浆 果浆选择新鲜的番木瓜 清洗后切块破碎 称取果肉 打浆 果浆 在一定条件下进行超声波处理 离心 除杂 过滤后 上清液在一定条件下进行超声波处理 离心 除杂 过滤后 上清液 进行超滤浓缩 收集酶液样品 结果表明 超声功率进行超滤浓缩 收集酶液样品 结果表明 超声功率 300W300W 超 超 声时间声时间 200s200s 果浆质量分数 果浆质量分数 30 30 这时酶活力是未经超声波处 这时酶活力是未经超声波处 理的理的 1 711 71 倍 采用超声波提取工艺得到的粗酶液的含量较低 倍 采用超声波提取工艺得到的粗酶液的含量较低 含有较多杂质 经膜分离初步纯化浓缩后 还需作进一步纯化含有较多杂质 经膜分离初步纯化浓缩后 还需作进一步纯化 处理 这有待于进一步深入研究 以提高酶的活性和纯度 处理 这有待于进一步深入研究 以提高酶的活性和纯度 5 5 亲和膜色谱法 亲和膜色谱技术是一种 亲和膜色谱法 亲和膜色谱技术是一种 2020 世纪世纪 8080 年代年代 末发展起来的生物大分子分离纯化的新技术 把膜分离与亲和末发展起来的生物大分子分离纯化的新技术 把膜分离与亲和 分离结合起来 使之兼具膜分离与亲和分离的特点 聂华丽等分离结合起来 使之兼具膜分离与亲和分离的特点 聂华丽等 以尼龙膜为基质 键合壳聚糖进行表面改性处理 以降低尼龙以尼龙膜为基质 键合壳聚糖进行表面改性处理 以降低尼龙 膜的非特异性吸附 并偶联染料配体膜的非特异性吸附 并偶联染料配体 CibacronCibacron BlueBlue F3GAF3GA 得 得 到一种新型的亲和膜色谱材料 并用其对木瓜蛋白酶进行分离 到一种新型的亲和膜色谱材料 并用其对木瓜蛋白酶进行分离 结果表明 该亲和膜具有良好的色谱性能 对木瓜蛋白酶有较结果表明 该亲和膜具有良好的色谱性能 对木瓜蛋白酶有较 高的吸附量 高的吸附量 235 3mg g235 3mg g 使用该亲和膜对木瓜粉中的木瓜蛋 使用该亲和膜对木瓜粉中的木瓜蛋 白酶进行分离纯化 纯化倍数可达白酶进行分离纯化 纯化倍数可达 46 546 5 倍 亲和膜色谱与传统倍 亲和膜色谱与传统 的膜分离 亲和色谱相比 不仅具有纯化倍数高 压降小 分的膜分离 亲和色谱相比 不仅具有纯化倍数高 压降小 分 析时间短 生物大分子在分离过程中变性机率小 允许较快的析时间短 生物大分子在分离过程中变性机率小 允许较快的 加料速度等特点 而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离 加料速度等特点 而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离 6 6 双水相萃取 双水相萃取是利用物质在不相溶的两水相 双水相萃取 双水相萃取是利用物质在不相溶的两水相 间分配系数的差异进行萃取的方法 间分配系数的差异进行萃取的方法 SaroteSarote N N 等人用双水相法等人用双水相法 提取了木瓜蛋白酶 结果表明 用提取了木瓜蛋白酶 结果表明 用 8 8 的聚乙二醇和的聚乙二醇和 15 15 的硫酸的硫酸 铵组成的双水相体系对木瓜蛋白酶的提取效果最好 酶的比活铵组成的双水相体系对木瓜蛋白酶的提取效果最好 酶的比活 力可达力可达 1659U mg1659U mg 收率为 收率为 86 2 86 2 双水相萃取具有目标产物收 双水相萃取具有目标产物收 率高 易于连续化操作 不存在有机溶剂残留 分离过程经济率高 易于连续化操作 不存在有机溶剂残留 分离过程经济 等优点 在木瓜蛋白酶的制备中应有一席之地 但我国目前尚等优点 在木瓜蛋白酶的制备中应有一席之地 但我国目前尚 无这类报道 随着木瓜蛋白酶应用的不断开发 对木瓜蛋白酶无这类报道 随着木瓜蛋白酶应用的不断开发 对木瓜蛋白酶 的纯度要求也越来越高 因此迫切需要特异性更大的制备木瓜的纯度要求也越来越高 因此迫切需要特异性更大的制备木瓜 蛋白酶的方法 开发双水相萃取技术 作为有效的高纯度木瓜蛋白酶的方法 开发双水相萃取技术 作为有效的高纯度木瓜 蛋白酶的分离提取方法 是很有意义的 蛋白酶的分离提取方法 是很有意义的 四 木瓜蛋白酶在食品工业中的应用 四 木瓜蛋白酶在食品工业中的应用 1 作为肉类嫩化剂 作为肉类嫩化剂 老龄畜禽肉煮熟后 口感粗糙 坚硬 而加入嫩肉粉后 肉质就老龄畜禽肉煮熟后 口感粗糙 坚硬 而加入嫩肉粉后 肉质就 会变的松软 嫩化 嫩肉粉的主要成分之一是木瓜蛋白酶 一方会变的松软 嫩化 嫩肉粉的主要成分之一是木瓜蛋白酶 一方 面因为木瓜蛋白酶是一种半胱氨酰基蛋白酶 能降解肌原纤维和面因为木瓜蛋白酶是一种半胱氨酰基蛋白酶 能降解肌原纤维和 结缔组织的蛋白酶 它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成小分子的结缔组织的蛋白酶 它将肌动球蛋白和胶原蛋白降解成小分子的 多肽甚至氨基酸 令其肌丝和筋腱丝断裂 使肉类变得嫩滑爽脆 多肽甚至氨基酸 令其肌丝和筋腱丝断裂 使肉类变得嫩滑爽脆 从而使肉类蛋白质因结构简化而易于消化吸收 另一方面 由于从而使肉类蛋白质因结构简化而易于消化吸收 另一方面 由于 嫩化剂比较充分的发挥作用是在肉品被蒸煮的期间 温度较高 嫩化剂比较充分的发挥作用是在肉品被蒸煮的期间 温度较高 而木瓜蛋白酶最适合温度而木瓜蛋白酶最适合温度 55 60 热稳定性强 在 热稳定性强 在 90 时也时也 不会完全失活 因此常用于生产嫩肉粉 雷昌贵等人以新鲜牛肉不会完全失活 因此常用于生产嫩肉粉 雷昌贵等人以新鲜牛肉 为原料 研究了木瓜蛋白酶对牛肉肌原纤维小片化指数 为原料 研究了木瓜蛋白酶对牛肉肌原纤维小片化指数 MFI 及剪切力的影响 结果表明浓度为及剪切力的影响 结果表明浓度为 0 007 的木瓜蛋白酶溶液对的木瓜蛋白酶溶液对 牛肉的嫩化效果最佳 主要是由于木瓜蛋白酶促进牛肉的嫩化效果最佳 主要是由于木瓜蛋白酶促进 Z 线的裂解 线的裂解 使肌原纤维小片化指数 使肌原纤维小片化指数 MFI 发生显著性增加 剪切力随着贮 发生显著性增加 剪切力随着贮 藏时间的延长显著降低 藏时间的延长显著降低 B M Naveena 等人曾研究了各类植物蛋等人曾研究了各类植物蛋 白酶对水牛肉的嫩化作用 结果表明 利用木瓜蛋白酶处理过的白酶对水牛肉的嫩化作用 结果表明 利用木瓜蛋白酶处理过的 水牛肉 其肌原纤维蛋白溶解度显著增加 剪切力值显著减少 水牛肉 其肌原纤维蛋白溶解度显著增加 剪切力值显著减少 木瓜蛋白酶由于其良好的蛋白水解能力 可将其用于多方面 在木瓜蛋白酶由于其良好的蛋白水解能力 可将其用于多方面 在 海洋捕捞中低值鱼和小杂鱼占有很大的比例 如不好好利用就会海洋捕捞中低值鱼和小杂鱼占有很大的比例 如不好好利用就会 造成很大的浪费 我们可以利用木瓜蛋白酶生产浓缩水解蛋白 造成很大的浪费 我们可以利用木瓜蛋白酶生产浓缩水解蛋白 而且这样得到的蛋白优于整鱼肉或鱼蛋白浓缩物 具有水溶性好 而且这样得到的蛋白优于整鱼肉或鱼蛋白浓缩物 具有水溶性好 低脂 低灰分 高蛋白等特点 木瓜蛋白酶还可以用于由于阻止低脂 低灰分 高蛋白等特点 木瓜蛋白酶还可以用于由于阻止 食品的褐变 回收屠宰的动物骨头中残存的碎肉等 食品的褐变 回收屠宰的动物骨头中残存的碎肉等 2 作为啤酒品质改良剂 作为啤酒品质改良剂 主要用于改良啤酒品质 木瓜蛋白酶能水解啤酒内的蛋白质 部主要用于改良啤酒品质 木瓜蛋白酶能水解啤酒内的蛋白质 部 分水解一些已形成的复合物 产生更多的多肽或氨基酸 保证啤分水解一些已形成的复合物 产生更多的多肽或氨基酸 保证啤 酒在冷冻过程中的高清澈度 同时改善啤酒口感及原有多肽和氨酒在冷冻过程中的高清澈度 同时改善啤酒口感及原有多肽和氨 基酸的组成和比例 有效地改良啤酒品质 据报道 对冷冻贮存基酸的组成和比例 有效地改良啤酒品质 据报道 对冷冻贮存 过程中的啤酒加入浓度为过程中的啤酒加入浓度为 0 08mg 100mL 的木瓜蛋白酶时澄清效的木瓜蛋白酶时澄清效 果最佳 能提高游离氨基酸含量 可使浑浊度降低果最佳 能提高游离氨基酸含量 可使浑浊度降低 68 75 游 游 离氨基酸苏氨酸 缬氨酸和精氨酸分别增加了离氨基酸苏氨酸 缬氨酸和精氨酸分别增加了 8 2 倍 倍 0 2 倍和倍和 1 1 倍 倍 3 作为饼干松化剂 作为饼干松化剂 在饼干 糕点中使用木瓜蛋白酶可以通过破坏巯基 降低面团筋在饼干 糕点中使用木瓜蛋白酶可以通过破坏巯基 降低面团筋 度 提高饼干疏松度 使其成型性好 饼色油润 减少次品率 度 提高饼干疏松度 使其成型性好 饼色油润 减少次品率 提高成品率 此外还可减少油脂和糖的用量 适用于各种风味的提高成品率 此外还可减少油脂和糖的用量 适用于各种风味的 高 中 低档饼干 糕点及面包的制造 高 中 低档饼干 糕点及面包的制造 4 用于调味品生产 用于调味品生产 啤酒酵母菌是啤酒工业的一个附产物 通过木瓜蛋白酶分解而提啤酒酵母菌是啤酒工业的一个附产物 通过木瓜蛋白酶分解而提 取香味浓郁的酵母抽提物 经调味后可制得酵母调味酱 它作为取香味浓郁的酵母抽提物 经调味后可制得酵母调味酱 它作为 一种优良的调味品提高了酵母菌的价值和利用率 一种优良的调味品提高了酵母菌的价值和利用率 5 用于营养保健品工业 用于营养保健品工业 木瓜蛋白酶用于保健食品主要有两种途径 一种途径是辅助消化 木瓜蛋白酶用于保健食品主要有两种途径 一种途径是辅助消化 可做成肠溶片 口服以达到消除消化紊乱的目的 另一种途径是可做成肠溶片 口服以达到消除消化紊乱的目的 另一种途径是 将一些含有特殊蛋白源的动植物分解制成各种营养保健液 方富将一些含有特殊蛋白源的动植物分解制成各种营养保健液 方富 永等采用木瓜蛋白酶酶解巴非蛤贝肉 结果表明酶解液中游离氨永等采用木瓜蛋白酶酶解巴非蛤贝肉 结果表明酶解液中游离氨 基酸含量丰富 约为基酸含量丰富 约为 923 0mg 100ml 色氨酸未计 色氨酸未计 其中必需 其中必需 氨基酸占氨基酸占 33 0 巴非蛤贝肉经复合蛋白酶水解 适当调配可制 巴非蛤贝肉经复合蛋白酶水解 适当调配可制 作营养丰富 海鲜风味浓郁 具有一定保健功能的口服液 作营养丰富 海鲜风味浓郁 具有一定保健功能的口服液 3 6 用于宠物食品生产用木瓜蛋白酶对宠物食品进行处理 可用于宠物食品生产用木瓜蛋白酶对宠物食品进行处理 可 以减少宠物食品的黏稠性 改善口感 增加风味 由于木瓜蛋白以减少宠物食品的黏稠性 改善口感 增加风味 由于木瓜蛋白 酶还具有驱虫效果 也可以用番木瓜汁来驱除哺乳动物宿主肠道酶还具有驱虫效果 也可以用番木瓜汁来驱除哺乳动物宿主肠道 内的线虫 另外 木瓜蛋白酶还可以应用到化工 医药等领域 内的线虫 另外 木瓜蛋白酶还可以应用到化工 医药等领域 如洗衣粉等洗涤剂中加入木瓜蛋白酶能快速地清洗衣物中的血渍如洗衣粉等洗涤剂中加入木瓜蛋白酶能快速地清洗衣物中的血渍 和汗渍 此外 木瓜蛋白酶还可以促进中药成分的有效煎出 用和汗渍 此外 木瓜蛋白酶还可以促进中药成分的有效煎出 用 于辅助于辅助 Rh 血型的鉴定 还可用于肿瘤的辅助治疗等 血型的鉴定 还可用于肿瘤的辅助治疗等 目前 木瓜蛋白酶被广泛地应用于食品行业 如肉类 啤酒 调目前 木瓜蛋白酶被广泛地应用于食品行业 如肉类 啤酒 调 味品等的生产 随着我国人民生活水平的提高 人们对食品安全味品等的生产 随着我国人民生活水平的提高 人们对食品安全 和食品营养的问题越来越关注 而木瓜蛋白酶可用来生产安全 和食品营养的问题越来越关注 而木瓜蛋白酶可用来生产安全 营养的食品 如具有保健功能的口服液等 具有良好的市场前景 营养的食品 如具有保健功能的口服液等 具有良好的市场前景 同时 为了满足各行各业对木瓜蛋白酶的需求 尤其是食品与医同时 为了满足各行各业对木瓜蛋白酶的需求 尤其是食品与医 药行业 研究如何分离纯化得到成本低 纯度高的木瓜蛋白酶就药行业 研究如何分离纯化得到成本低 纯度高的木瓜蛋白酶就 很有意义 因此 对木瓜蛋白酶的提取和分离纯化技术进行深入很有意义 因此 对木瓜蛋白酶的提取和分离纯化技术进行深入 的研究 提取高质量的木瓜蛋白酶具有重要的实用价值 的研究 提取高质量的木瓜蛋白酶具有重要的实用价值 实验内容 实验内容 一 实验目的 一 实验目的 1 1 熟悉木瓜蛋白酶的粗提方法和原理 熟悉木瓜蛋白酶的粗提方法和原理 2 2 掌握盐析和双水相萃取法的原理和步骤 掌握盐析和双水相萃取法的原理和步骤 3 3 掌握酶活力测定的方法 并评定木瓜蛋白酶的活性 掌握酶活力测定的方法 并评定木瓜蛋白酶的活性 4 4 学会分析总结影响实验结果的因素 学会分析总结影响实验结果的因素 二 实验原理二 实验原理 根据木瓜蛋白酶的分子量及特性 通过离心烘干等技术获得木根据木瓜蛋白酶的分子量及特性 通过离心烘干等技术获得木 瓜蛋白酶的粗产物 再根据粗产物在双水相中分配系数的差异进行瓜蛋白酶的粗产物 再根据粗产物在双水相中分配系数的差异进行 进一步的提纯 最后在紫外分光光度计中测取酶的吸光度 通过进一步的提纯 最后在紫外分光光度计中测取酶的吸光度 通过 ODOD 值换算酶的活性 值换算酶的活性 四 四 技术线路 技术线路 木瓜乳汁 粗提 有机试剂提取 乙醇提取 超声波提取 双水相法 盐析法 提纯 双水相法 盐析法 双水相法 盐析法 双水相法 盐析法 SDS page 标准曲线法 标准曲线测蛋白含量 实验一 木瓜蛋白酶的粗提 实验一 木瓜蛋白酶的粗提 1 1 有机溶剂提取法 有机溶剂提取法 1 1 实验原理 根据木瓜蛋白酶在不同相的分配系数不同 实验原理 根据木瓜蛋白酶在不同相的分配系数不同 2 2 实验步骤 称取 实验步骤 称取 700g 木瓜乳汁木瓜乳汁 加入加入 350m l 水水 拌匀拌匀 用用 40 NH4OH 调调 pH 至至 9 0 搅拌搅拌 1h 抽滤抽滤 滤液加入冷无水乙醇滤液加入冷无水乙醇 使使 乙醇浓度为乙醇浓度为 60 搅拌均匀搅拌均匀 置低温冰箱置低温冰箱 30m in 2500r m in 离心离心 SDS PAGE 标准曲线法 双水相法 盐析法 测酶活 15 m in 取沉淀取沉淀 干燥 干燥 2 超声波提取法 超声波提取法 1 实验原理 实验原理 木瓜蛋白酶是由植物细胞合成的具有催化活性和高度专一性的特殊木瓜蛋白酶是由植物细胞合成的具有催化活性和高度专一性的特殊 蛋白质蛋白质 超声波提取法作为一种新型的提取技术已经比较广泛地运用超声波提取法作为一种新型的提取技术已经比较广泛地运用 于天然植物有效成分的提取于天然植物有效成分的提取 在研究超声波提取木瓜蛋白酶的工艺中在研究超声波提取木瓜蛋白酶的工艺中 发现超声波可以有效提高酶的提取率发现超声波可以有效提高酶的提取率 超声波产生的空化效应超声波产生的空化效应 一方面一方面 赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力赋予溶剂对细胞壁更大的渗透力 并强化细胞内外的质量传输并强化细胞内外的质量传输 另一方另一方 面破坏细胞壁面破坏细胞壁 使细胞内含物更易释放使细胞内含物更易释放 从而强化了提取过程从而强化了提取过程 超声波超声波 形成的微射流效应也是提高提取率的一个重要原因 形成的微射流效应也是提高提取率的一个重要原因 2 实验内容 实验内容 试验材料 试验材料 番木瓜番木瓜 酪蛋白酪蛋白 L 酪氨酸酪氨酸 CCl3 COOH Na2CO3 Na2HPO4 12H2O NaH2PO4 2H2O NaAC HAC NaOH HCl NaCl CuSO4 EDTA Cys Vc 仪器设备 仪器设备 721 型分光光度计型分光光度计 UV 2000 型紫外可见分光光度计型紫外可见分光光度计 JY92 超声波超声波 细胞粉碎机细胞粉碎机 PHS 3C 型精密型精密 pH 计计 TDL 5 型低速台式大容量离心机型低速台式大容量离心机 梅梅 特勒特勒 托利多托利多 PL202 S 电子天平电子天平 HH 6 数显恒温水浴锅数显恒温水浴锅 Tianfeng Tp10 20 实验型超滤装置 实验型超滤装置 操作步骤 操作步骤 酶液制备酶液制备 选择新鲜的番木瓜选择新鲜的番木瓜 清洗去皮 籽 瓤后清洗去皮 籽 瓤后 切块破碎切块破碎 称取果称取果 肉肉 加入一定量的加入一定量的 4 蒸馏水进行打浆蒸馏水进行打浆 果浆在一定条件下进行超声波果浆在一定条件下进行超声波 处理处理 4000 r min 1 离心离心 15min 除杂过滤后除杂过滤后 上清液选用截留分子质量上清液选用截留分子质量 为为 20000 u 的的 PP 中空纤维膜进行超滤浓缩中空纤维膜进行超滤浓缩 收集酶液样品收集酶液样品 冰箱保存冰箱保存 备用备用 为保持样品的活性为保持样品的活性 超声波处理前先预冷至超声波处理前先预冷至 0 4 超声波处理超声波处理 时采用冰浴冷却时采用冰浴冷却 整个过程中料液的温度尽量控制在低温状态整个过程中料液的温度尽量控制在低温状态 重复重复 3 次次 佳提取工艺条件为超声波功率佳提取工艺条件为超声波功率 300W 超声处理时间超声处理时间 200 s 果浆质量分果浆质量分 数数 30 经超声波强化提取经超声波强化提取 酶活力提高到原先的酶活力提高到原先的 1 71 倍倍 在以酪蛋白在以酪蛋白 为底物 为底物 pH 7 5 和和 40 条件下条件下 木瓜蛋白酶的木瓜蛋白酶的 Km 值和值和 Vm 值分别为值分别为 1 4709 mg mL 1 和和 5 5252 g mL 1 min 1 最适温度为最适温度为 70 80 最适最适 pH 值为值为 5 4 6 6 该酶在该酶在 40 以下以下 pH 为为 5 4 6 0 时酶活力相对稳定时酶活力相对稳定 EDTA Cys 和和 Vc 对酶活力具有激活作用对酶活力具有激活作用 CuSO4 和和 ZnCl2 具有抑制作具有抑制作 用用 而而 KCl NaCl CaCl2 MgSO4 对酶活力的影响不大 对酶活力的影响不大 3 乙醇提取法 乙醇提取法 新鲜青番木瓜新鲜青番木瓜 取皮切碎取皮切碎 加加 30 冰水捣碎冰水捣碎 过虑过虑 取滤液离心取滤液离心 15min 3500r min 4 取上清弃沉淀取上清弃沉淀 加入酶活保护剂 加入酶活保护剂 L cys 和和 EDTA 添加量分别为添加量分别为 0 04mol L 和和 0 004mol L 加入乙醇量加入乙醇量 45 调调 Ph 为为 7 0 静置静置 过夜过夜 离心离心 20min 5500r min 取沉淀取沉淀 测酶活测酶活 真空冷冻干燥真空冷冻干燥 粉碎粉碎 得粗酶 得粗酶 实验二 蛋白浓度测定实验二 蛋白浓度测定 Bradford 法 法 1 实验原理 实验原理 蛋白与染料结合显色的原理设计的 考马斯亮蓝蛋白与染料结合显色的原理设计的 考马斯亮蓝 G 250 染料在一定染料在一定 浓度的酸性乙醇溶液中显淡红色浓度的酸性乙醇溶液中显淡红色 当与蛋白质结合后当与蛋白质结合后 产生的蓝色溶液产生的蓝色溶液 在在 595nm 处有最大光吸收处有最大光吸收 吸光度值与蛋白浓度成正比吸光度值与蛋白浓度成正比 因此可通过因此可通过 检测检测 595nm 的光吸收值的大小来计算蛋白的含量 的光吸收值的大小来计算蛋白的含量 2 实验内容 实验内容 1 试剂配置 试剂配置 1 Bradford 贮存液 称取贮存液 称取 350mg 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G 250 溶于溶于 100ml 95 乙醇乙醇 加入加入 200ml 磷酸磷酸 置于暗处置于暗处 室温下可长期保存室温下可长期保存 2 Bradford 工作液 在工作液 在 425ml 双蒸水中加入双蒸水中加入 15ml 95 乙醇乙醇 30ml 85 磷酸和磷酸和 30 ml Bradford 贮存液 混匀后用贮存液 混匀后用 Whatman 1 号滤纸过号滤纸过 滤滤 棕色瓶保存棕色瓶保存 可使用数周可使用数周 但在使用前需要再过滤 标准牛血清白但在使用前需要再过滤 标准牛血清白 蛋白 蛋白 BSA 配制成浓度为 配制成浓度为 200ug ml 的溶液 的溶液 2 标准曲线的制定 标准曲线的制定 1 在若干洁净试管中分别加入 在若干洁净试管中分别加入 200ug ml 的标准品的标准品 0ul 10ul 20ul 30ul 40ul 50ul 和和 75ul 用双蒸水补足至用双蒸水补足至 200ul 2 各管中加入 各管中加入 2ml 工作液工作液 振荡混匀振荡混匀 室温放置室温放置 5min 在在 595nm 处测定吸光值 处测定吸光值 3 每个样本做三个平行 以每管中 每个样本做三个平行 以每管中 BSA 的的 ug 数为横坐标数为横坐标 吸光值为纵坐标吸光值为纵坐标 绘制标准曲线 绘制标准曲线 3 样品蛋白含量测定 样品蛋白含量测定 1 将待测样品稀释 将待测样品稀释 n 和和 m 倍倍 配制成浓度约为配制成浓度约为 0 025 0 075mg ml 的溶液 的溶液 2 取稀释过的样品 取稀释过的样品 200ul 加入试管中加入试管中 加入加入 2ml 工作液工作液 振荡均匀振荡均匀 室温放置室温放置 5min 在在 595nm 处测定吸光值 处测定吸光值 3 每个样本做三个平行 将测得的吸光值扣去空白后 每个样本做三个平行 将测得的吸光值扣去空白后 从标准曲从标准曲 线上查得相应的蛋白质量线上查得相应的蛋白质量 再按照各自的稀释倍数推算出蛋白浓度再按照各自的稀释倍数推算出蛋白浓度 取取 平均值后即为样品的蛋白浓度 平均值后即为样品的蛋白浓度 实验三 木瓜蛋白酶的提纯实验三 木瓜蛋白酶的提纯 1 1 盐析法 盐析法 实验原理 实验原理 盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐 使某些高分子物质的盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐 使某些高分子物质的 溶解度降低沉淀析出 而与其他成分分离的方法 盐析法主要用于溶解度降低沉淀析出 而与其他成分分离的方法 盐析法主要用于 蛋白质的分离纯化 常作盐析的无机盐有氯化钠 硫酸钠 硫酸镁 蛋白质的分离纯化 常作盐析的无机盐有氯化钠 硫酸钠 硫酸镁 硫酸铵等 硫酸铵等 实验内容 实验内容 1 1 初步采集处理初步采集处理 在未成熟的新鲜木瓜上纵向切口约在未成熟的新鲜木瓜上纵向切口约 5 5 1010 个个 切口约切口约 1 1 2 2 mm mm 收集乳汁收集乳汁 按按 1 11 1 量加入蒸馏水量加入蒸馏水 搅拌搅拌 1 1 h NaOHh NaOH 调节至调节至 pH9 0 pH9 0 抽滤抽滤 滤液备用 滤液备用 2 2 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀 上述滤液中缓缓加入硫酸铵粉末至终浓度为上述滤液中缓缓加入硫酸铵粉末至终浓度为 20 4 20 4 老化老化 3030 min 8min 8 000r min000r min 离心离心 5 5 min min 弃沉淀 上清继弃沉淀 上清继 续加硫酸铵粉末至终浓度为续加硫酸铵粉末至终浓度为 40 40 收集沉淀收集沉淀 4 4 老化老化 3030 min 8min 8 000r min000r min 离心离心 5 5 min min 收集沉淀收集沉淀 4 4 用用 5050 mmol L pH4 0mmol L pH4 0 的醋的醋 酸缓冲液透析除盐 酸缓冲液透析除盐 3 3 SP sephadexSP sephadex C C 5050 柱色谱柱色谱 上述透析产物在室温条件下上上述透析产物在室温条件下上 SP SP sephadexsephadex C50C50 柱柱 1 1 1 1 cm 20cm cm 20cm 进行梯度洗脱进行梯度洗脱 洗脱液是含洗脱液是含 0 0 1 51 5 mol Lmol L NaClNaCl 的醋酸缓冲液的醋酸缓冲液 50 50 mmol L pHmmol L pH 4 0 4 0 流速流速 为为 0 50 5 mL minmL min 分部收集 分部收集 检测酶活力并收集有酶活力的洗脱检测酶活力并收集有酶活力的洗脱 液液 4 4 用用 pH6 8pH6 8 0 0010 001 mol Lmol L 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 BPS BPS 透析 透析 4 4 羟基磷灰石柱色谱羟基磷灰石柱色谱 上述透析产物室温条件下上羟基磷灰石柱上述透析产物室温条件下上羟基磷灰石柱 1 1 1 1 cm 20cm 20 cm cm 梯度洗脱梯度洗脱 洗脱液是洗脱液是 0 0010 001 0 050 05 mol Lmol L BPS pHBPS pH 6 8 6 8 流速为流速为 0 50 5 mL minmL min 分部收集 分部收集 检测酶活力并收检测酶活力并收 集有酶活的洗脱液集有酶活的洗脱液 超滤除盐浓缩超滤除盐浓缩 即得纯酶 即得纯酶 2 2 双水相萃取法提纯 双水相萃取法提纯 实验原理 实验原理 两种亲水性高聚物或一种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶两种亲水性高聚物或一种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶 的匀相水溶液的匀相水溶液 即双水相体系 早在年即双水相体系 早在年 发现发现 当明胶与琼脂或明胶与当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时可溶性淀粉溶液相混时 会得到一个浑浊不透明的溶液会得到一个浑浊不透明的溶液 随之分为两相 随之分为两相 上相富含明胶上相富含明胶 下相富含琼脂或淀粉下相富含琼脂或淀粉 且两相的主要成分都是水 这种且两相的主要成分都是水 这种 现象被称为聚合物的不相溶性现象被称为聚合物的不相溶性 由此产生了双水相萃取技术 由此产生了双水相萃取技术 双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似 都是基于被分离物质在两都是基于被分离物质在两 相间的选择性分配 当物质进入双水相体系后相间的选择性分配 当物质进入双水相体系后 由于表面性质 电荷由于表面性质 电荷 作用和各种力如疏水键 氢键和离子键等的存在和环境的影响作用和各种力如疏水键 氢键和离子键等的存在和环境的影响 使其使其 在上下相中的浓度不同 物质在双水相体系中的分配系数不是一个在上下相中的浓度不同 物质在双水相体系中的分配系数不是一个 确定的值确定的值 它要受许多因素的影响 影响蛋白质及细胞碎片在双水相它要受许多因素的影响 影响蛋白质及细胞碎片在双水相 体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类 成相聚合物的分体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类 成相聚合物的分 子质量和总浓度 无机盐的种类和浓度 值 离子环境等 子质量和总浓度 无机盐的种类和浓度 值 离子环境等 实验内容 实验内容 1 试剂 试剂 PEG 4000 和和 6000 L 半肤氨酸 二硫苏糖醇半肤氨酸 二硫苏糖醇 DTT 磷酸二氢钠和磷 磷酸二氢钠和磷 酸氢二钾 酸氢二钾 30 丙烯酞胺储液 过硫酸铵 丙烯酞胺储液 过硫酸铵 TEMED Tris 透析袋 透析袋 分子截留量 分子截留量 3500 填料 填料 Sepharose SP Fast Flow 考马斯亮蓝 考马斯亮蓝 G 250 和考马斯亮蓝和考马斯亮蓝 R 250 牛血清白蛋白 牛血清白蛋白 N 苯甲酞苯甲酞 DL 精氨酸对硝精氨酸对硝 基苯胺盐酸盐基苯胺盐酸盐 2 仪器 仪器 温控摇床 恒温混匀仪 电热恒温水槽 紫外可见分光光度计 实温控摇床 恒温混匀仪 电热恒温水槽 紫外可见分光光度计 实 验室验室 Ph 计 分析天平 电子天平 高速冷冻离心机 蛋白电泳系统 计 分析天平 电子天平 高速冷冻离心机 蛋白电泳系统 恒温磁力搅拌器 真空冷冻干燥机 预装柱恒温磁力搅拌器 真空冷冻干燥机 预装柱 HiTrap SP FF 1ML 快 快 速蛋白纯化系统速蛋白纯化系统 3 实验方法 实验方法 1 粗酶溶液配制 粗酶溶液配制 称取称取 45g 喷雾干燥的木瓜粗酶粉喷雾干燥的木瓜粗酶粉 在在 4 下溶于半肤氨酸溶液下溶于半肤氨酸溶液 20Mm Cys 1Mm EDTA PH 5 7 中 待样品充分溶解后 中 待样品充分溶解后 将溶液离将溶液离 心心 20 000g 4 15minj 收集上清 将该上清 大约 收集上清 将该上清 大约 45mg ml 稀 稀 释成不同的蛋白浓度释成不同的蛋白浓度 作为初始粗酶溶液待用 作为初始粗酶溶液待用 2 双水相体系配制 双水相体系配制 按实验设计称取相应量的按实验设计称取相应量的 PEG 4000 或或 6000 盐溶液 盐溶液 40 w w 磷磷 酸盐或酸盐或 40 w w 硫酸铵 和硫酸铵 和 4g 酶溶夜 置于酶溶夜 置于 15ml 刻度离心管中刻度离心管中 补补 加去离子水至总体系质量为加去离子水至总体系质量为 10g 其中 其中 不同不同 ph 值的磷酸盐溶液由值的磷酸盐溶液由 40 w w K2HPO4 和和 40 w w NaH2PO4 配制而得 不同配制而得 不同 PH 值的酶溶液由值的酶溶液由 6M HCL 或或 NaOH 调整而得 将配制好的双水相体系调整而得 将配制好的双水相体系 放入放入 4 或或 20 摇床中充分混合摇床中充分混合 2h 将混合均匀的离心管在各自温 将混合均匀的离心管在各自温 度下离心度下离心 10 000g 15min 以使两相充分分离 读取上 下相体积 以使两相充分分离 读取上 下相体积 用注射器分别吸取一定量的上 下相用注射器分别吸取一定量的上 下相 进行蛋白浓度和酶活测定 同进行蛋白浓度和酶活测定 同 时时 将样品进行碱性蛋白非变性电泳和快速蛋白液相色谱 将样品进行碱性蛋白非变性电泳和快速蛋白液相色谱 FPLC 检 检 测测 以验证双水相体系对木瓜蛋白酶的提纯效果以验证双水相体系对木瓜蛋白酶的提纯效果 3 上相中木瓜蛋白酶与成相聚合物 上相中木瓜蛋白酶与成相聚合物 PEG 的分离 的分离 经双水相