羟基磷灰石纳米粒子体外抗肝癌的实验研究.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除羟基磷灰石纳米粒子体外抗肝癌的实验研究 肝癌严重危害人类的健康，目前大多数化疗药物疗效虽然快但不理想，而且副作用大，因此，临床应用受到限制。羟基磷灰石（HAP）纳米粒子具有良好的生物相容性、生物活性、化学稳定性及广谱抑癌作用13，但对正常细胞的影响研究较少。我们的实验旨在研究HAP纳米粒子对肝癌细胞及肝细胞的选择性作用，探讨应用于肝癌临床治疗的可能性。1材料和方法1.1试剂及仪器 DMEM(Gibco)；新生牛血清(Gibco)；型胶原酶(Gibco)。倒置显微镜(CK_40 Olympus, Japan)；酶标检测仪(MB _，北京市新技术应用研究所)；粒径分析仪(Zataplus，Brookhaven)；透射电镜(H_600 Hitachi, Japan)。1.2细胞株及动物细胞系Bel_7402人肝癌细胞来源于中国科学院上海细胞研究所细胞库，由武汉大学典型培养物保藏中心提供。Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重260g300g，由湖北省医学科学院医学实验动物中心供给，合格证号：19084。1.3实验方法1.3.1HAP纳米粒子制备与检测以Ca(OH)2饱和液和Ca(H2PO4)2为原料，应用均相沉淀法制备HAP纳米粒子。高压灭菌，临用前用DMEM培养液稀释，终浓度为1.4104mol/L、1.4105mol/L、1.4106mol/L三组。常规制备透射电镜(TEM)标本，镜下观察HAP纳米粒子形状、大小及分散状态。1.3.2实验分组及细胞培养肝癌细胞分4组：C、C1、C2、C3，其中C为空白对照组，C1C3分别含有1.4104mol/L、1.4105mol/L、1.4106mol/L HAP纳米粒子组。肝细胞分组同上，与其对应的为N、N1、N2、N3。对数生长期的肝癌细胞经0.25胰酶消化，用DMEM培养基(含10小牛血清、10万U/ml青霉素、10万g/ml链霉素)配成单细胞悬液，以2104个细胞/ml接种于25ml培养瓶内，计40瓶。肝细胞的分离依据文献4进行，以上述同样方法配制肝细胞悬液，接种40瓶。将全部培养瓶置37、5CO2下培养，24小时后更换培养液，给药组换含不同浓度HAP纳米粒子的培养液，对照组加等量新鲜培养液，继续培养5天，实验重复3次。1.3.3形态学观察及活细胞计数在培养状态下，用倒置显微镜每日观察细胞生长状况和形态学改变。每天每组取2瓶，经0.25的胰酶消化后，取30l细胞悬液加2台盼蓝染液混匀，在细胞计数板上计数，每瓶计数3次，取其平均值，拒染细胞为活细胞。统计结果行t检验。2结果2.1HAP纳米粒子的大小、形态透射电镜下观察HAP纳米粒子呈均匀分散的针状颗粒，平均粒径67.6nm，粒径分析仪测定有效平均粒径为72.3nm。2.2细胞形态学变化培养细胞在倒置显微镜下观察，肝癌细胞呈典型的多边形贴壁生长。培养5天连续观察到C组Bel_7402细胞增殖明显，细胞数量逐渐增多，第4天达高峰(见图1)。用HAP纳米粒子处理的C1组，24小时内细胞形态、数量没有明显变化，随着培养时间的延长细胞数量逐渐减少，部分细胞变成圆形、梭形或不规则形，于第4天细胞质内形成大量空泡(见图2)，多形性更加明显。C2组、C3组与C组比较没有明显差异。新鲜分离的肝细胞呈单个分散状态，为具有立体感的圆球形，晶莹透亮，体积上大小一致。培养24小时后细胞单层铺展，圆形或多边形。N组细胞数始终呈上升趋势；N1、N2、N3组未见细胞形态、数量的显著变化。2.3HAP纳米粒子对细胞生长的影响高浓度的HAP纳米粒子与2104细胞/ml共同孵育后，肝癌细胞的生长受到抑制，与对照组相比P0.01，且该作用随HAP纳米粒子作用时间的延长而增强。而对正常肝细胞的抑制作用较弱。如图3所示。3讨论原发性肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，涉及细胞生长、分化与凋亡之间的调控失衡，以及环境与机体的相互作用5。肝癌的发病率高，而且还具有极强的临床侵袭性，预后极差。许多抗肝癌的化学药物通过不同的机制作用于肝癌细胞，但其疗效不佳，相互之间可产生交叉耐药性，并增加毒副作用。无机纳米粒子在抗肿瘤方面初步显示了独特的优势。纳米粒子通常是指尺度在1nm100nm之间的微粒，由于其具有大的比表面积，表面原子数、表面能和表面张力随粒径的下降急剧增加，表现出了小尺寸效应、表面效应及很强的吸附性和生物活性。纳米粒子的抗肿瘤效应分为两类：其一，纳米粒子药物复合物，纳米粒子在其中承担载体的作用6;其二，单纯纳米粒子，主要发挥纳米粒子本身的抗肿瘤效应。我们研制的HAP纳米粒子，平均粒径67.6nm，利用其本身独特的生物活性进行了初步体外实验研究，发现1.4104mol/L的HAP纳米粒子有明显的抗肝癌作用，与对照组相比差异显著，相同浓度的HAP纳米粒子作用于大鼠肝细胞，与对照组比较未见明显抑制作用，即对肝细胞影响较小。提示HAP纳米粒子具有体外抗肝癌效应，且副作用较小。可望通过进一步的体外实验及动物实验，深入研究HAP纳米粒子的抗癌机理，为临床应用奠定实验基础。参考文献：1Li SP,Zhang SC,Chen WJ，et al.Effects of hydroxyapatite ultrafine powder or colony formation and cytoskeletones of MGc80_3 cellJ.Bioceramics,1998，9225227.2Feng LY,Li SP, Yan YH, et al.Inhibition of HAP nanopartics on W_256 sarcoma of rats in vivoJ.Chin Biomed Engin,2001,302304.3李世普，冯凌云，曹献英，等.无机纳米粒子抑制癌细胞的机理J.稀有金属材料与工程, 2001,30(增刊)702705.4曹献英，闫玉华，杨美娟，等. 肝细胞原代培养的技术改良