Flor-Essence对小鼠免疫器官指数和肝功能的影响VIP

Flor-Essence对小鼠免疫器官指数和肝功能的影响姓名： 史良中文摘要 【目的】探讨Flor-Essence (FE)对小鼠免疫器官指数和肝功能的影响，为深入研究FE的免疫调节功能的作用机制奠定坚实的基础。【方法】小鼠口服不同浓度的FE，35天后眼窝取血，进行白细胞数量检测，血液肝功化验。对小鼠称重、解剖、分离器官并计算胸腺、脾的器官指数，并进行数据分析。【结果】不同浓度FE均能提高小鼠体重及免疫器官指数，且未对肝功能造成损害。【结论】适宜浓度的FE促进小鼠的生长；FE在未对肝功能造成损害的情况下，一定程度上能提高免疫器官指数即增强机体的免疫功能。关键词：富兰益赛思 小鼠 免疫器官指数 肝功能1 前言Flor-Essence又称“护士水”，是一种没有精炼加工的有机解毒草本茶1，由牛蒡（具有抗肿瘤效果并能减少细胞突变，传统中药认为牛蒡具有强身及净化身体的作用）、光叶赤榆皮（因富含粘液而能舒缓消化道，这种树皮能有效舒缓炎症）、羊酸膜草（刺激细胞再生，并有效帮助身体解毒）、大黄（帮助肠道解毒并清洁肝脏）、圣蓟（可以刺激胆汁的产生及流动）、红三叶草花（一种血液纯净剂，可以刺激毒素和废物流出，促进废物和毒素从皮肤、肾脏和肠道排出体外）、西洋菜（是叶绿素、维生素和矿物质的丰富来源，传统上，它一直被用作解毒剂和滋养品）、海带（含有大量矿物质的海洋植物，是补充碘的良好来源，可以帮助调节人体经络）八种成分组成2。 研究表明，FE具有帮助深度清除渗透到身体内部器官、组织和细胞的毒素，调节PH值，防癌自愈，全面提升癌症患者的生活质量的功效，还有着非常卓越的抗氧化效果，每天饮用，能及时有效地清除自由基、抗辐射、延缓衰老、增强免疫力，也可作为营养补充剂并用于病人治疗慢性疾病。2004年，印第安纳大学-普度大学的实验室经实验后报道FE能减缓前列腺癌细胞的生长，随后大量研究报道FE能抑制大鼠乳腺肿瘤的生长，并在不同的草药中发现了可用于制作FE的化学物质，这些化学物质可能会防止可导致癌症的细胞损伤，减轻肿胀，发红和疼痛，杀死癌细胞。FE在加拿大已有30年历史了，同时也争论了30年，约35%癌症病人服用它们3。在美国，38%癌症病人服FE制剂，也有4.9%无病人士服用。1997年，FE公司曾与俄罗斯卫生部合作进行了FE的临床前和临床评价，对FE是否有急性和慢性毒性进行了评估,还没有发现其对肾脏和肝脏的损伤。2013年，美国得克萨斯大学、得克萨斯-休斯敦大学和加拿大Foresight Link Corporation公司联合对美、加1998年6月至1999年8月期间使用上述药物的普通消费者和癌症病人进行了问卷调查，调查证实了FE给广大消费者，尤其是给癌症病人带来了显而易见的好处4。FE对疾病患者和健康人有如此多的疗效，但它是如何发挥其功能的仍不清楚。本研究采用不同浓度FE喂养小白鼠，通过对体重、免疫器官指数的测量，以及肝功能的检测，初步探究FE是否会通过改善机体的免疫力进而发挥药物疗效。2 材料与方法2.1 材料、试剂及仪器2.1.1 材料、试剂材料：32只二周龄、体重为1822 g、生理状态相似的小鼠（由大连医科大学SPF动物实验中心提供） 试剂：三种不同浓度（1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL）的Flor-Essence、冰醋酸、龙胆紫2.1.2 仪器 血液肝功化验仪（Bayer ADVIA 2400 ，德国BAYER公司） 电子天平（FA1604s型，北京赛多利斯天平有限公司） 超净工作台（MCV-131BNS，日本三洋） 超速冷冻离心机（Heraeus sepatech-Biofuge28RS，美国索福公司）制冰机（SIM-F140AY65，日本Sanyo公司）高速离心机（TGL-16G型，上海医用分析仪器厂） -80超低温冰箱（M208382，美国Thermo Scientific公司） 移液枪（H200、H1000，美国Tomos产品）2.2 方法2.2.1 制备FE溶液 （1）准备 将FE原液分装于50 mL离心管中（10 mL/管），置于抽滤瓶中4 保存。 （2）预冻结 箱外预冻法，用低温冰箱冷冻12 h。 （3）低温解析干燥 为保证原液的良好药性，选择直接进行低温解析干燥。将冻干机开启，待其冷凝 室温度降至-80 时，开始抽真空至15-30 pa，将抽滤瓶接入，进行低温解析干燥，得到FE冻干粉。 （4）FE冻干粉处理方法 将每管冻干样品溶于1 mL去离子水中，配制成浓度为100 mg/mL的浓缩液，200目滤网过滤，滤过液使用去离子水稀释成1%、2%、4%的溶液，其浓度分别为1、2、4 mg/mL。2.2.2 小鼠的喂养 将32只昆明种小白鼠平均分为四组，每组8只，每组分别编号1-8。四组分别为水处理组，FE低浓度组（1 mg/mL），FE中浓度组（2 mg/mL）和FE高浓度组（4 mg/mL）。2014-3-11至2014-4-15期间小鼠口服不同浓度的FE。每只小鼠每天定时灌胃一次，称体重记录，按照每克体重10 L剂量灌胃，连续灌胃35天。2.2.3 眼窝取血法 左手将小鼠头部固定，轻轻压迫颈部两侧，使眼球突出，右手持毛细玻璃管，沿内眼眶后壁向喉头方向旋转刺入取血。每只小鼠取0.5 mL全血，静置半小时后，离心（1500 r、5 min），吸取上层血清稀释至1 mL，利用西门子2400全自动生化分析仪进行血液肝功化验（该检测在大连医科大学附属第一医院进行）。2.2.4 体重测量及免疫器官指数检测 处死小鼠前称体重（g）,处死后打开腹腔，取出所需器官（包括肝、脾脏、胸腺），称各器官质量（mg）。计算各组小鼠服用FE后平均器官指数（器官质量mg/体重质量g）的大小。2.2.5 白细胞数量检测配制白细胞稀释液（冰醋酸2.0 mL,1%龙胆紫1 mL,蒸馏水加至100 mL，过滤后备用)，取小鼠，眼窝取血。检测过程如下： （1）取小试管1支，加白细胞稀释液0.19 mL。 （2）用血红蛋白吸管准确吸取末梢血20 L。 （3）擦去管尖外部余血，将吸管插入盛0.19 mL稀释液的试管底部，轻轻吹出血液， 并吸取上清液洗涮3次，轻轻摇动试管，使血液与稀释液充分混匀。 （4）将计数池和盖玻片擦净，盖玻片盖在计数池上，再用微量吸管迅速吸取混匀悬 液充入计数池中，静置23 min后镜检。 （5）用低倍镜计数四角的4个大方格内的白细胞总数。对于压线的白细胞，应采取 数上不数下、数左不数右的原则，保证计数区域的计数结果的一致性和准确性。2.2.6 数据统计分析 统计各组数据，利用excel进行T检验、误差、差异显著性分析。3 结果3.1 不同浓度FE对小鼠体重的影响 表3-1 服用不同浓度FE的小鼠体重变化Table 3-1 The weight change of mice who take different concentrations of FE 图3-1 不同浓度FE对小鼠体重的影响 Fig.3-1 The effect of different concentrations of FE on the body weight of mice 为了探讨不同浓度FE对个体生长状况是否有影响，我们做了体重变化分析。由表3-1和图3-1可知，与对照组相比，各实验组小鼠体重均有所增加，中浓度组体重增加最明显，其次是低浓度组、高浓度组。从T-test的结果可知，中浓度组具有极显著差异（p0.01），低浓度组具有显著差异（p0.05）。3.2 不同浓度FE对小鼠免疫器官指数的影响 图3-2 不同浓度FE对小鼠免疫器官指数的影响 Fig.3-2 The effect of different concentrations of FE on the immune organ index of mice 为了探讨不同浓度FE对免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况的影响，间接反映机体的免疫水平，我们做了免疫器官指数分析。由图3-2可知，与对照组相比，各组小白鼠免疫器官指数均有所增大，其中脾指数随FE浓度的增加而增大。胸腺指数在FE低浓度组和中浓度组依次增大，而高浓度组较中浓度组有所减小，但经数据分析脾指数和胸腺指数变化均无差异显著性。3.3不同浓度FE对小鼠白细胞数量的影响 图3-3 不同浓度FE对小鼠血液中白细胞数量的影响 Fig. 3-3 The effect of different concentrations FE on the numbers of white blood cells in mice blood 为了探究FE是否会通过改变白细胞数量来影响机体损伤治愈、抗御病原入侵及对疾病免疫的能力，我们对小鼠白细胞数量进行了检测。由图3-3 可知，与对照组相比，各组小鼠白细胞数量均无明显变化。3.4 不同浓度FE对血液肝功化验结果的影响 评价药物的安全性、副作用的指标是药物对肝功能是否有损伤，所以为保证FE的安全性，我们需检测FE对肝功能是否有损伤，对小鼠肝指数和如下几种酶含量进行了检测。 图3-4 不同浓度FE对小鼠肝指数的影响Fig. 3-4 The effect of different concentrations of FE on the liver index of mice 由图3-4可知，各组小鼠的肝指数与对照组相比均有所增大，其中中浓度组增大较多，低浓度组次之，高浓度组增大最小，但经数据分析肝指数变化无显著差异性。 图3-5 不同浓度FE对小鼠血液中谷丙转氨酶，谷草转氨酶含量的影响Fig. 3-5 The effect of different concentrations FE on ALT, AST in mice blood 由图3-5可知，与对照组相比，各实验组小鼠的谷丙转氨酶含量的变化并不明显；谷草转氨酶含量略有变化，但经数据分析这些酶含量的变化无显著差异性。 图3-6 不同浓度FE对小鼠血液中肌酸激酶，乳酸脱氢酶，胆碱酯酶含量的影响 Fig. 3-6 The effect of different concentrations FE on CK, LDH ,CHE in mice blood 由图3-6可知，与对照组相比，乳酸脱氢酶、胆碱酯酶含量，仅低浓度组有所减少；肌酸激酶含量低浓度组和中浓度组有所增加，但经数据分析这些酶含量的变化无显著差异性。4 讨论体重变化量可以直观的反映个体的生长状况，进而反映出不同浓度的FE对体重的影响，及各浓度作用效果是否有差异。本实验结果表明，各实验组小鼠体重均有变化，中浓度组体重变化最明显，其次是低浓度组、高浓度组。从T-test的结果可知，中浓度组具有极显著差异（p0.01），低浓度组具有显著差异（p0.05）。这说明适宜浓度的FE草本茶有助于促进小鼠的生长。胸腺位于胸腔前纵隔，是造血器官，能产生淋巴细胞，并运送到淋巴结和脾脏等处，这种淋巴细胞对机体的细胞免疫具有重要作用。胸腺上皮细胞合成和分泌多种具有激素活性的多肽类物质,对T淋巴细胞的发育、分化、成熟及免疫活性调节均有着重要作用。胸腺素还具有调节神经内分泌的功能,胸腺不仅是免疫系统中枢,而且还具有内分泌器官作用5。胸腺免疫制剂为新型的免疫调节剂，是从人、猪、牛等胸腺组织中提取的多种能调节免疫细胞功能的重要的多肽类生物活性物质6。脾脏是人体最大的周围淋巴器官，其实质由红髓和白髓构成，具有造血和血液过滤功能，也是淋巴细胞迁移和接受抗原刺激后发生免疫应答、产生免疫效应分子的重要场所。脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。侵入血内的病原体，如细菌、疟原虫和血吸虫等，可引起脾内发生免疫应答，脾的体积和内部结构也发生变化7。体液免疫应答时，淋巴小结增多增大，脾索内浆细胞增多；细胞免疫应答时脾周围淋巴鞘显著增厚。中医基本理论有关生命运动的观点与免疫学的认识有很多相似之处。近年来的研究表明从免疫学角度对中医理论的某些方面进行探索性研究,有广阔的前景8。胸腺和脾脏指数可以反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况，间接反映了机体的免疫水平9-10。小鼠称重后断颈处死，迅速取其免疫器官胸腺和脾脏，用滤纸吸去血渍，去除周围组织和脂肪等，称其湿重11。计算免疫器官指数，公式如下：免疫器官指数=免疫器官重量(mg)鼠体重(g)x100。在我们的实验中发现，与对照组相比，各组小白鼠免疫器官指数均有所变化，其中脾指数随FE浓度的增加而增大。胸腺指数由低浓度组至中浓度组依次增大，而高浓度组较中浓度组略有减小。这表明FE可以增大免疫器官指数，即适宜浓度的FE能促进免疫器官的发育和免疫细胞的功能。从T-test结果得知各组均无显著性差异（p0.05），这可能是由于灌胃天数不足造成的，所以，要得到更加确定的结论，在以后的实验中需延长灌胃的天数，并进行多次重复实验。白细胞数量可以反映机体损伤治愈、抗御病原入侵及对疾病免疫的能力，血液离心时表层为灰白色，这部分的细胞即称为白细胞。白细胞也通常被称为免疫细胞，是机体防御系统的一个重要组成部分。它通过吞噬和产生抗体等方式来抵御和消灭入侵的病原微生物14。它是一组形态、功能和在发育与分化阶段不同的非均质性混合细胞的统称，依据形态、功能和来源而分为粒细胞、淋巴细胞、单核细胞三类15。白细胞数临床意义：(1)增高：急性化脓性感染(脓肿、脑膜炎、肺炎、阑尾炎、扁桃体炎等)，某些病毒感染(传染性单核细胞增多症 ，流行性乙型脑炎)，白血病，类白血病反应，糖尿病酮症酸中毒，严重烧伤，急性大出血，恶性肿瘤及某些金属(如铅、汞等)中毒。生理性增高见于新生儿，月经期，分娩，情绪变化及注射肾上腺素后等。(2)减少：某些传染病(伤寒、副伤寒、黑热病、疟疾、病毒性肝炎、沙门菌属感染等)，某些血液病(再生障碍性贫血、非白血性或亚白血性白血病)，自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮等)，脾功能亢进、各种原因所致的脾肿大(如门脉肝硬化)，粒细胞缺乏症，恶性组织细胞病，阵发性睡眠性血红蛋白尿，慢性理化损伤，电离辐射(如X线等)，肿瘤化疗及某些药物(磺胺、氯霉素)反应等。为探究FE是否会影响小鼠的免疫功能，我们对喂食FE的小鼠的白细胞数量进行了检测。实验结果表明，与对照组相比，各组小鼠白细胞含量均有所变化，其中低浓度组减少的最明显，中浓度组减少的略少一点，高浓度组减少的最少。但T-test结果显示各组均无显著性差异(p0.05)，这说明FE对小鼠白细胞数量无影响。 药物对肝功能是否有损伤，是评价药物的安全性、副作用的指标。为了观察FE对肝功能是否有损伤，我们检测了肝指数和肝功能。肝脏是人体内最大的消化腺，也是体内新陈代谢的中心站，还是人体免疫系统的一部分，产生抗体，消灭入侵的各种抗原。据估计，在肝脏中发生的化学反应有500种以上，实验证明，动物在完全摘除肝脏后即使给予相应的治疗，最多也只能生存50多个小时，这说明肝脏是维持生命活动的一个必不可少的重要器官。肝脏的主要功能是进行糖的分解、贮存糖原；参与蛋白质、脂肪、维生素、激素的代谢；解毒；分泌胆汁；吞噬、防御机能；制造凝血因子；调节血容量及水电解质平衡；产生热量等。在胚胎时期肝脏还有造血功能12-13。谷丙转氨酶主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。谷草转氨酶主要存在于肝细胞线粒体内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，才能引起谷草转氨酶血清中浓度偏高。谷草转氨酶偏高，反映肝细胞炎症始终未停止，肝细胞肿胀、坏死持续存在。血清胆碱酯酶活性是协助诊断有机磷中毒和评估肝实质细胞损害的重要手段，脂肪肝患者CHE平均水平较正常对照组比较显著升高,是脂肪肝患者又一突出的生化指标，血清胆碱酯酶水平可以作为判断病情程度和预后的一项临床指标。肌酸激酶对诊断急性心肌梗死有较高价值，肌酸激酶的同功酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，肌酸激酶因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。乳酸脱氢酶是一个广泛存在于各种生物体中的酶，包括了植物与动物。心、肝、肾、骨骼、骨骼肌、胰腺、肺等，各种组织的损伤时乳酸脱氢酶含量会升高，溶血、剧烈运动、妊娠等情况也是可以使乳酸脱氢酶含量升高。由此可知，若上述几种酶的含量显著增多就说明肝脏受损。实验结果表明，各实验组小鼠的肝指数和上述酶含量均有所变化，但变化不明显，且T-test结果显示各组均无显著性差异(p0.05),这说明肝脏并未受到损害，即FE未对肝脏造成不良影响。 5.小结 目前，已有大量的研究证明了Flor-Essence草本茶的功能，但对其作用机制尚不明确。为方便日后深入研究，本次