1 神经胶质瘤的研究意义.doc

.1 神经胶质瘤的研究意义神经胶质瘤（Glioma）是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的50%左右。目前临床上IV型神经胶质瘤是恶性程度最高的脑部肿瘤，至今无法治愈1。多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM） 起源于脑部神经胶质细胞，成年脑癌患者中约80%为浸润性的星形细胞瘤。由于该肿瘤是浸润性生长物，其和正常脑组织没有明显的界限，因此难以被完全切除或根本不能手术。血脑屏障的存在，又使得化学药物和一般抗肿瘤的中药难以发挥疗效。该肿瘤细胞对放疗亦不甚敏感，非常容易复发。因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。据文献报道神经胶质瘤的中位生存时间和无进展生存时间分别为14.6个月和6.9个月，5年生存率为9.8%2。近年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率达到每100,000人口中有5.26个人，而且每年有17000人被最新诊断出患有该致死性疾病3, 4。因此，积极研究神经胶质瘤的发病原因、寻找恶性胶质瘤治疗切实有效的治疗手段已成为目前亟待解决的关键问题。2 上皮-间质转化与神经胶质瘤发生发展的关系人脑胶质瘤发生、发展过程中，多种癌基因、抑癌基因的异常改变牵涉其中。肿瘤的形成和发展与基因改变间的关系是近年来肿瘤学研究的核心问题之一。多种基因的改变都参与到肿瘤细胞生长过程中，肿瘤细胞生长是肿瘤最基本的生物学行为，生长异常是肿瘤恶性行为的基础。大量的研究证实，肿瘤的形成起源于单个获得了癌基因和（或）抑癌基因改变的细胞；肿瘤的发展（包括由分化较好的肿瘤转变成分化差的肿瘤，局部浸润和远处转移）则是更多癌基因和抑癌基因受累后作用叠加，肿瘤细胞克隆选择和扩增的最终结果5。在胶质瘤发生发展的大量研究中，人端粒酶逆转录酶（hTERT）6、内皮生长因子受体（EGFR）7、热休克蛋白（HSP）8等分子以及PKA、PKC、ERK9, 10等关键信号转导分子均在神经胶质瘤的发生发展过程中发挥重要作用。p53基因的失活11和血小板源生长因子（PDGF）与其受体的激活12是神经胶质瘤非常常见的两个基因改变。P53基因突变在胶质瘤的各个分期中都起到关键作用，据报道在25-30%的原发性胶质瘤和60-70%的继发性胶质瘤中都发现p53基因的改变。p53下游信号（如MDM2, MDM4, INK4/ARF）在胶质瘤的发展过程中也都起到关键作用11。3. Zeb1与神经胶质瘤Zeb1是胚胎发育过程中必须的转录因子13，在胚胎形成及发育中的作用其突变能引起胚胎严重畸形。ZEB1是软骨形成的修饰基因，可抑制1型和2型胶原的表达，并在在胸腺T细胞发育中起主导作用，同时Zeb1也抑制IL-2的转录活性14，成体突变Zeb1可引起角膜营养不良15，研究发现Zeb基因也能够抑制抑癌基因的表达，可抑制 p63和肿瘤抑制基因臂板蛋白3F (semaphorin 3F，SEMA3F)的表达，而且视网膜母细胞瘤抑制蛋白(Retinoblastoma，Rb)缺失或p53蛋白表达的缺失或者p53突变体表达增加均可以诱导Zeb1的表达，说明Zeb1基因能够抑制肿瘤细胞的生长和癌症的发展16。Zeb1是基膜(Basement Membrane，BM)的主要调节物，它可促使肿瘤的间质浸润17。Zeb1染色程度与子宫内膜癌侵袭性表型相关，侵袭性II型子宫内膜癌间质细胞及上皮源性肿瘤细胞Zeb1表达明显升高。在乳腺癌和结直肠癌侵犯的组织中瘤细胞及肿瘤间质均可检测到Zeb1表达，并且Zeb1可通过与E-钙黏蛋白上保守的E2-boxes结合使其转录下调，导致EMT，诱导肿瘤侵袭。在肺癌和胃癌中，Zeb1通过调节降低E-钙黏蛋白的表达导致肿瘤分化降低，侵袭性及转移能力增强18-21。Zeb1信号通路在胶质母细胞瘤的发生发展，侵袭及耐药等方面均有十分重要的作用，Siebzehnrubl等研究发现Zeb1在侵袭能力强的胶质母细胞瘤中高表达，目前可以通过检测患者Zeb1表达作为预测短期生存率和治疗反应好坏的临床指标，而且Zeb1被认做是胶质母细胞瘤复发的重要候选分子，浸润性肿瘤细胞的标记和重要的潜在治疗靶点22。但是，关于Zeb1参与胶质母细胞瘤致病过程的具体调节作用机制目前还不十分明了，仍需大量研究揭示验证其在恶性胶质瘤细胞生长和侵袭过程中上下游重要调控分子和信号网络。 我们前期实验发现过表达PDGF-A能够明显促进小鼠脑内神经胶质瘤的形成；加入外源性PDGF-A能够促进胶质瘤细胞生长发生EMT并上调Zeb1、Vimentin的表达，下调E-cadherin的表达，抑制Zeb1后能抑制细胞生长，相反，Zeb1过表达能促进细胞的生长和迁移，提示PDGFA可能通过Zeb1调节胶质瘤细胞EMT过程 （预实验3）。并且过表达microRNA-200b-c（生理状态下，mRNA-200家族作为zeb1拮抗分子）后可逆转PDGF-A对Zeb1表达和细胞生长迁移的促进作用 （预实验10）。提示Zeb1可能在由PDGFR介导的神经胶质瘤中起重要的调节作用，microRNA-200b-c可能参与该过程中。因此，基于已有研究结果，我们拟从分子、细胞、动物模型、临床样本等不同层次深入研究Zeb1在神经胶质瘤细胞生长和肿瘤侵袭中的作用，并阐明其分子调控机制，为神经胶质瘤的诊断和治疗提供新的分子靶标。3 ZEB1 在PDGFR 调节肿瘤瘤生长与侵袭中的作用血小板源衍生生长因子（PDGF）是可以由多种细胞产生的多肽，具有刺激平滑肌细胞、胶质等细胞增生等广泛的生理活性。PDGF是由A、B两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体。传统的PDGF包括三种形式:PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB。近年来还发现了PDGF家族的另两种形式:PDGF-C和PDGF-D23。血小板衍生生长因子受体（PDGFR）异常表达和激活是胶质瘤发生发展的主要分子机制之一24。在恶性胶质瘤临床样本的11个扩增基因中，PDGFR排在第三位12，提示PDGFR在神经胶质瘤发生发展过程中的关键作用。另据报道神经胶质瘤病例中约30%的人与PDGFR的表达相关25，约40% PDGFRA高表达的病例中存在PDGFRA 8,9这一突变体，它外显子8和9中的243个碱基缺失，可以导致其激活26。另外，还有文献报道称PDGFR过表达及受体上的多个下游调控位点均与神经胶质瘤的恶性程度和很差的预后直接相关，也是胶质瘤病人生存时间变短的主要因素12。但是PDGFR在胶质瘤生长侵袭过程中的具体机制、参与PDGFR调控胶质瘤生长侵袭的下游信号通路和关键分子、以及相关信号调控网络等重大科学问题仍需进一步研究。本课题组前期发表在J Clinical Investigation12和Oncogene27上研究表明， PDGFRa及其下游信号分子参与调控神经胶质瘤的增值和侵袭。PDGFRa活化后，主要激活PI3K和MAPK途径。PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）途径能够活化蛋白激酶B （PKB，Akt），该途径在一系列广谱的人类肿瘤中都可以被激活，其在恶性胶质瘤中，也同样起到重要作用，可通过激活CD133和p85位点的相互作用激活PI3K/Akt途径促使胶质瘤干细胞的肿瘤原性28。肿瘤细胞侵袭是恶性胶质瘤发展过程中最重要的特征，PDGFRa及其下游关键信号分子都在神经胶质瘤侵袭过程的信号转导过程中扮演重要角色；而上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)过程是肿瘤侵袭的重要步骤，E盒结合同源盒蛋白，即Zeb1是上皮-间充质转化的诱导因素之一29。我们发现在神经胶质瘤细胞系中存在PDGFR和Zeb1共高表达的现象（预实验2），因此，探讨PDGFR和Zeb1是否存在调控关系以及其中可能的调控网络很可能成为解决神经胶质瘤细胞通过EMT过程发生侵袭的症结所在。4 Zeb1蛋白分子的修饰和胶质瘤的关系 Zeb1具有6个功能结构域：包含两个C2H2的锌指ZFD结构域，是DNA结合部位，结合到相关基因的Z盒和E盒30；中央部分有一个POU样的HD结构域；同时含有一个结合到R-Smads的SBD结构域和结合CtBP蛋白的CID结构域31；最后还包含一个结合共激活因子P300和P/CAF的CBD结构域（图1）。正常情况下，Zeb1会有泛素化修饰，影响其转录抑制活性32，而Zeb1和CtBP1、HDAC1的直接结合介导了这种转录抑制33, 34。Zeb1蛋白分子存在多个潜在的能丝氨酸磷酸化的位点35，但迄今为止Zeb1的修饰和其功能的关系，尤其在胶质瘤中的作用，很少有报道，我们在预实验5中发现，胶质瘤中Zeb1存在一定的丝氨酸磷酸化修饰，这提示我们磷酸化可能参与了Zeb1的功能调节，因此探讨Zeb1修饰作为调节PDGFR调控网络的因素之一，有助于清晰阐明神经胶质瘤发生发展过程中的内在原因。图1：Zeb1蛋白结构简图 总之，在前期研究的基础上，本项目将借助体外实验与体内动物模型以及恶性胶质瘤的临床样本，利用分子生物学及细胞生物学等的研究方法，探讨Zeb1介导PDGFRa调节的神经胶质瘤生长与侵袭作用及分子机制，深入探索其中可能的调控网络，从而确定Zeb1是否有可能成为一个新的神经胶质瘤的治疗靶点。 本课题的目的在于希望通过该研究不仅可以补充PDGFR调控神经胶质瘤侵袭作用的机制，加深对PDGFR调节肿瘤发生与侵袭的作用的理解，还望找到新的治疗神经胶质瘤的靶向位点，如Zeb1，为建立新型的联合基因靶向治疗该致死性疾病提供理论基础。 因此，该项目的研究具有重要的理论和临床意义。参考文献1.Tanaka, S., et al., Diagnostic and therapeutic avenues for glioblastoma: no longer a dead end? Nat Rev Clin Oncol, 2013. 10(1): p. 14-26.2.Stupp, R., et al., Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol, 2009. 10(5): p. 459-66.3.Dolecek, T.A., et al., CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol, 2012. 14 Suppl 5: p. v1-49.4.Omuro, A. and L.M. DeAngelis, Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review. JAMA, 2013. 310(17): p. 1842-50.5.Hudson, T.J., Genome variation and personalized cancer medicine. J Intern Med, 2013. 274(5): p. 440-50.6.Wang, T., et al., Silencing of the hTERT gene through RNA interference induces apoptosis via bax/bcl-2 in human glioma cells. Oncol Rep, 2012. 28(4): p. 1153-8.7.Feng, H., et al., Phosphorylation of dedicator of cytokinesis 1 (Dock180) at tyrosine residue Y722 by Src family kinases mediates EGFRvIII-driven glioblastoma tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(8): p. 3018-23.8.Alam, R., et al., PTEN suppresses SPARC-induced pMAPKAPK2 and inhibits SPARC-induced Ser78 HSP27 phosphorylation in glioma. Neuro Oncol, 2013. 15(4): p. 451-61.9.Alapati, K., et al., uPAR and cathepsin B knockdown inhibits radiation-induced PKC integrated integrin signaling to the cytoskeleton of glioma-initiating cells. Int J Oncol, 2012. 41(2): p. 599-610.10.Ku, B.M., et al., Caffeine inhibits cell proliferation and regulates PKA/GSK3beta pathways in U87MG human glioma cells. Mol Cells, 2011. 31(3): p. 275-9.11.England, B., T. Huang, and M. Karsy, Current understanding of the role and targeting of tumor suppressor p53 in glioblastoma multiforme. Tumour Biol, 2013. 34(4): p. 2063-74.12.Liu, K.W., et al., SHP-2/PTPN11 mediates gliomagenesis driven by PDGFRA and INK4A/ARF aberrations in mice and humans. J Clin Invest, 2011. 121(3): p. 905-17.13.Caramel, J., et al., A switch in the expression of embryonic EMT-inducers drives the development of malignant melanoma. Cancer Cell, 2013. 24(4): p. 466-80.14.Williams, T.M., et al., Identification of a zinc finger protein that inhibits IL-2 gene expression. Science, 1991. 254(5039): p. 1791-4.15.Liskova, P., et al., Variable ocular phenotypes of posterior polymorphous corneal dystrophy caused by mutations in the ZEB1 gene. Ophthalmic Genet, 2010. 31(4): p. 230-4.16.Chang, C.J., et al., p53 regulates epithelial-mesenchymal transition and stem cell properties through modulating miRNAs. Nat Cell Biol, 2011. 13(3): p. 317-23.17.Spaderna, S., et al., A transient, EMT-linked loss of basement membranes indicates metastasis and poor survival in colorectal cancer. Gastroenterology, 2006. 131(3): p. 830-40.18.Chaffer, C.L., et al., Poised chromatin at the ZEB1 promoter enables breast cancer cell plasticity and enhances tumorigenicity. Cell, 2013. 154(1): p. 61-74.19.Hasuwa, H., et al., miR-200b and miR-429 function in mouse ovulation and are essential for female fertility. Science, 2013. 341(6141): p. 71-3.20.Hur, K., et al., MicroRNA-200c modulates epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in human colorectal cancer metastasis. Gut, 2013. 62(9): p. 1315-26.21.Liu, W., et al., Inhibition of TBK1 attenuates radiation-induced epithelial-mesenchymal transition of A549 human lung cancer cells via activation of GSK-3beta and repression of ZEB1. Lab Invest, 2014. 94(4): p. 362-70.22.Siebzehnrubl, F.A., et al., The ZEB1 pathway links glioblastoma initiation, invasion and chemoresistance. EMBO Mol Med, 2013. 5(8): p. 1196-212.23.Little, P.J., GPCR responses in vascular smooth muscle can occur predominantly through dual transactivation of kinase receptors and not classical Galphaq protein signalling pathways. Life Sci, 2013. 92(20-21): p. 951-6.24.Verhaak, R.G., et al., Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell, 2010. 17(1): p. 98-110.25.Brennan, C., Genomic profiles of glioma. Curr Neurol Neurosci Rep, 2011. 11(3): p. 291-7.26.Clarke, I.D. and P.B. Dirks, A human brain tumor-derived PDGFR-alpha deletion mutant is transforming. Oncogene, 2003. 22(5): p. 722-33.27.Feng, H., et al., Dynamin 2 mediates PDGFRalpha-SHP-2-promoted glioblastoma growth and invasion. Oncogene, 2012. 31(21): p. 2691-702.28.Wei, Y., et al., Activation of PI3K/Akt pathway by CD133-p85 interaction promotes tumorigenic capacity of glioma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(17): p. 6829-34.29.Huang, R.Y., et al., An EMT spectrum defines an anoikis-resistant and spheroidogenic intermediate mesenchymal state that is sensitive to e-cadherin restoration by a src-kinase inhibitor, saracatinib (AZD0530). Cell Death Dis, 2013. 4: p. e915.30.Remacle, J.E., et al., New mode of DNA binding of multi-zinc