分子生物学实验教案XX上——张荃for studentVIP

分子生物学实验教案XX上张荃for student 1教案xx-xx学年第二学期课程名称分子生物学实验课程编号4131204-学院、专业、年级生命科学院生科04级任课教师张荃教师所在单位生命科学院生物技术系山东师范大学2分子生物学实验教案-课程简介本课程的前6个实验须完成整个分子克隆的基本系列程序，首先进行PCR扩增外源片段，经琼脂糖凝胶电泳并从琼脂糖凝胶中回收该外源DNA片段；再将回收的外源DNA片段与质粒载体pMD18-T进行连接，并CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，之后将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞，实现外源DNA转化的目的；转化子经蓝白斑筛选，再进行质粒的提取并对提取的质粒进行酶切鉴定，以确定整个系列实验的成功与否。 后2个实验是进行植物材料的DNA和总RNA的提取，让学生掌握这两个基本分子生物学实验的实验原理和方法。 本课程包括以下几个方面1聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。 PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。 几乎所有核酸实验都需要进行电泳。 电泳能按分子大小分离核酸分子，而且操作简便，用途广泛，诸如分子长度测定和核酸混合物的分离等。 实验目的掌握PCR反应的原理及技术；了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。 2 （1）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段本实验所用的回收试剂盒的原理是在DR-1Buffer存在的条件下，使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片段吸附于Spin column的滤膜上。 最后用Elution Buffer或灭菌的双蒸水溶出DNA。 实验目的了解DNA片段回收的原理，掌握用试剂盒回收DNA的方法。 2 （2）DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA片段）DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来。 实验在pMD18-T质粒载体中加入上个实验回收的DNA（插入片段）的DNA，在连接酶和Buffer的作用下于16进行连接反应。 产物放于-20冰箱中，用于下次实验的转化。 实验目的了解DNA片段连接的原理，掌握DNA连接的方法。 3大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。 实验目的学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。 4转化及重组子的筛选转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。 其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞表现新的遗传性状。 将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。 实验目的了解细胞转化的概念及其在分子生物学上研究中的意义；学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 5质粒的提取(碱法)质粒是一种染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA3与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。 当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 实验目的了解碱法提取质粒的原理，掌握碱法提取质粒的方法。 6质粒的酶切验证限制修饰系统在细菌中普遍存在，其目的是保护自身DNA不被外源基因污染，即限制和修饰的区分使外来的DNA易被限制性酶识别，由于其缺乏适当位点的甲基化而被切割掉。 基因工程中应用的是II类限制性内切酶，它们能识别特定的靶序列（4-6bp），每一种酶仅负责限制作用，每一独立的酶负责同一序列的甲基化反应，即内切酶和甲基化酶分离。 II类限制性内切酶可识别特异的、相当短的DNA序列作为结合位点，结合之后在识别位点处切割。 切割反应在DNA重组和体外测序中应用广泛。 本实验利用限制性内切酶把环状质粒DNA切开，以检测质粒pMD18-T载体中是否含有克隆的外源DNA片段。 实验目的了解酶切原理。 4分子生物学实验教案教学大纲实验学时18；实验个数6；每个实验3学时课程编号:4131204课程性质（必做）适用专业生物科学xx级教学方法与手段实验与多媒体教学使用教材和主要参考书1.分子克隆实验指南(第二版)，【美】J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社，19952.精编分子生物学实验指南，【美】F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿；颜子颖王海林译，科学出版社，19993.基因工程，楼士林，阳盛昌，龙敏南，章军，科学出版社，xx4.植物基因与分子操作，顾红雅、陈章良等著，北京大学出版社，19955.基因工程及其分子生物学基础，静国忠主编，北京大学出版社，19996.植物工程，李立家，肖庚富，科学出版社，xx7.最新分子生物学实验技术梁国栋主编科学出版社xx8.分子生物学理论与技术顾晓松等主编北京科学技术出版社xx大纲执笔人张荃 一、实验课的性质与任务本课程为本科生分子生物学课实验教学部分而设定。 除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。 二、实验课程目的与要求实验目的为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。 实验要求通过本实验课程的学习，要求学生掌握分子生物学的基本技能核酸生化技术、蛋白质分离纯化技术等；除了实验操作，还要求学生学会实验分析及问题讨论。 三、实验项目1.聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段（及琼脂糖凝胶电泳）2.从琼脂糖凝胶中回收DNA片段；DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA片段）3.大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）4.转化及重组子的筛选5.质粒的提取(碱法)6.质粒的酶切验证 四、内容提要见课程简介 四、实验内容安排（包括教学目的与要求，教学重点和难点）见各个分教案5分子生物学实验教案授课时间xx.5.14（5.17/5.19）第1次课授课章节实验一聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段任课教师及职称张荃副教授教学方法与手段多媒体与实验教学课时安排2学时使用教材和主要参考书1.分子克隆实验指南(第二版)，【美】J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社，19952.精编分子生物学实验指南，【美】F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿；颜子颖王海林译，科学出版社，19993.基因工程，楼士林，阳盛昌，龙敏南，章军，科学出版社，xx4.植物基因与分子操作，顾红雅、陈章良等著，北京大学出版社，19955.基因工程及其分子生物学基础，静国忠主编，北京大学出版社，19996.植物工程，李立家，肖庚富，科学出版社，xx7.最新分子生物学实验技术梁国栋主编科学出版社xx8.分子生物学理论与技术顾晓松等主编北京科学技术出版社xx教学目的与要求要求掌握-1.掌握PCR反应的原理2.掌握PCR反应的操作技术教学重点，难点1.掌握PCR反应的原理2.掌握PCR反应的操作技术3.PCR技术参数聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板的作用教学内容实验一聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段实验目的掌握PCR反应的原理及技术。 实验原理聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。 PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。 6PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 反应分为三步1变性在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106-107个拷贝。 PCR技术的参数主要有7个聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。 实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.PCR仪2.台式离心机3.微量取液器4.紫外荧光观测仪5.高压灭菌的微量离心管6.DNA扩增系统7.琼脂糖凝胶电泳系统（二）材料模板DNA KS载体（三）试剂1.10PCR buffer2.dNTPs2.5mM3.Taq酶5U/?L4.引物1和22mol/L实验步骤1.在0.2ml Eppendorf管内配制50l反应体系ddH2O37.5?L10PCR buffer5?L dNTPs（2.5mM/each）2?L引物1(T3)2?L引物2(T7)2?L Taq酶（5U/?L）0.5?L模板（质粒载体）1?L2.按下述循环程序在PCR仪上进行扩增943分钟，1个循环；9440秒，5630秒，721分钟，30个循环；72延伸7分钟。 4保温。 3.扩增结束后，取大约30L PCR扩增产物进行1%的琼脂糖电泳，检测扩增情况、分析结果，并在紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的DNA片段、放入1m L的Eppendorf管中。 4冰箱存放。 注意事项1.PCR反应是在一个在没有DNA污染的干净环境中进行。 2.一般而言，只要能够得到可靠的结果，模板纯化的方法越简单越好。 要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试剂或缓冲液来提取核酸，不要使用以前用于别的样品的试剂。 73.所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。 配制试剂，操作样品，建立反应和以后的检测扩增产物过程中最好都使用手套。 4.所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水高压灭菌后分装备用。 5.所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成小份以确保实验间的连续性。 6.所有试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 7.PCR样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 8.扩增反应应当设计不加模板的阴性对照，电泳时应当加标准DNA分子量标记（Marker）以估计产物的大小。 附:引物T3和T7序列T3ATT AACCCT CACTAA AGGGAA（ATT AACCCT CACTAA AGGGA）T7TAA TACGAC TCACTA TAGGG（TAA TACGAC TCACTA TAGGGC GA）附I DNA的琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。 几乎所有核酸实验都需要进行电泳。 电泳能按分子大小分离核酸分子，而且操作简便，用途广泛，诸如分子长度测定和核酸混合物的分离等。 二、基本原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA）且检测的范围很广。 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和提纯DNA的标准方法，而且可以直接确定凝胶中DNA的位置，并估计其大小和浓度。 在凝胶中DNA的迁移距离与DNA分子量的对数成反比。 琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光。 在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，因而DNA的检测很方便。 如将已知大小和浓度的标准样品（Marker）作电泳对照，就可估计出待测样品的大小和浓度。 凝胶电泳的分离能力强，对分离不同大小的DNA分子特别有用。 但分离不同分子量范围的DNA分子，要用不同浓度的凝胶和电泳条件。 三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.水平式凝胶电泳槽2.稳压电泳仪3.电炉或微波炉4.紫外检测仪5.台式离心机（二）材料实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。 （三）试剂1.琼脂糖2.8TAE电泳缓冲液(50):Tris242g,冰醋酸57.1ml,0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml。 3.稀释到电泳缓冲液1TAE4.溴化乙锭溶液10mg/ml，室温下棕色瓶或铝铂纸包装保存。 5.6溴酚蓝指示剂（DNA样品加样缓冲液） 四、实验步骤1.根据实验所需称取一定量的琼脂糖，放入制胶的容器中（一般用三角瓶），然后用1TAE配制1%的Agrose琼脂糖凝胶液；2.加热，使琼脂糖完全溶解；3.待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约60）后，加入约1/1000的1mg/ml溴化乙锭溶液（至终浓度为0.5-1g/ml）后轻轻混匀，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气泡）；等溶液降温到50-55左右（不烫手），将其倒入电泳槽，迅速在制胶槽一端插上梳子，检查有无气泡。 4.在室温下凝固约20分钟；室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中；5.加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm；6.待测DNA样品中加1/51/6的溴酚蓝指示剂后，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底，小心将其加到点样孔（凝胶的梳孔）中；7.打开电泳仪电源，按照需要调节电压（或电流），电泳开始，观察电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现；8.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳；9.取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果；10.根据需要切下DNA条带，放入1.5ml离心管中，放入-20冷冻保存，以备以后的实验用。 五、注意事项1.溴化乙锭是致癌剂，操作要小心，须带手套。 2.1%的Agrose胶可分离1-25Kb大小的DNA，小片段DNA（200-2000bp）用1.5%的Agrose。 附II聚合酶链式反应(PCR) 一、基本原理聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。 典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以快速扩增。 其主要步骤是将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。 二、PCR技术的应用PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无须经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。 它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。 因此，PCR技术产生的时间虽不长，却以惊人的速度广泛的应用于分子生物学的各个领域。 它可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。 PCR技术在分子克隆和DNA分析中有着如下多种用途 1、制备双链DNA中的特异序列探针； 2、由少量mRNA制备cDNA文库； 3、由cDNA克隆某些基因； 49、制备大量DNA以进行序列测定； 5、突变的分析； 6、染色体步移； 7、RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析。 三、PCR反应系统具体地说，PCR反应系统由寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。 现分述如下 1、引物引物是决定PCR结果的关键因素，下列原则有助于引物的合理设计1.引物长度以15-30bp为宜，其Tm=4（G+C）+2（A+T），一般（G+C）的含量在45-55，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列（尽量避免有三个以上连续相同的碱基），碱基的分布应时随机的。 2.两个引物在3端不应出现同源性，避免引物内部形成二级结构，3端的末端碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率，研究表明选T、G、C为好。 3.人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。 4.引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是容易形成引物二聚体（prime-dimer）；二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。 一般来说，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。 一般用0.25-0.5pmol/?l较好。 5.新订的引物来了以后，在未开盖前就稍加离心，然后用TE配置成较高浓度的母液（约100?M），保存于-20C。 取出其中一部分用ddH2O配制成10?M或20?M的工作液。 2、反应缓冲液用于PCR的标准缓冲液含50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室温）和1.5mM MgCl2。 Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著的影响。 浓度过低，使反应特异性降低；浓度过高，使产物减少。 在各种单核苷酸浓度为200?M时，Mg2+为1.5mM较合适。 若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。 在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。 据我们的经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。 3、Taq酶的用量在100?l反应体系中，一般加入2.5U的酶量，足达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。 酶量过多导致产生非特异性产物。 但是，不同公司或不同批次的产品常有很大的不同，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当进行预实验。 一般100?l反应混合物用2-4U酶较为合适。 4、dNTPs的浓度高浓度dNTPs易产生错误掺入，若再高则可能不扩增；而浓度过低，势必降低反应产物的产量。 PCR常用终浓度为50-400?M的dNTPs。 四种脱氧三磷酸单核苷酸的浓度应相同。 如果其中任何一种的浓度明显不同于其他几种时（偏搞或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。 此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+的浓度。 5、模板单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。 若起始材料时RNA，一般须先通过逆转录得到第一链cDNA。 虽然PCR可以仅用极微量的样品（甚至是单一细胞的DNA），但为了保证反应的特异性，一般还宜用?g水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。 五、PCR反应的实验步骤 1、扩增反应 （1）按以下次序，将各种试剂加入一只无菌的0.5ml离心管中10扩增缓冲液*2.0?l MgCl2（25mM）1.2?l dNTPs（10mM each）0.4?l引物1（20?M）1.0?l引物2（20?M）1.0?l模板10DNA1.0?g（根据具体实验调整）Taq DNA聚合酶（5U/?l）0.2?l ddH2O x?l总体积20?l10扩增缓冲液Tris-HCl100mM（PH8.3）KCl500mM Gelatin0.01%Triton X-1001% （2）将上述试剂在微量离心管中仔细混匀，尽量避免产生气泡。 置于离心机上迅速离心片刻。 （3）在PCR仪上设定以下程序95C变性5min1个循环94C变性1min50C退火1min30个循环72C延伸3min72C延伸10min1个循环 （4）样品置于PCR仪上进行扩增。 2、扩增产物的检测取5-10?l PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并分析结果。 剩余样品置于-20C冻存，以备进一步分析使用。 附III聚合酶链式反应（PCR技术）聚合酶链式反应，即PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家KBMullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过烦琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称之为无细胞分子克隆法。 这种技术操作简单，容易掌握，结果也较为可靠，为基因的分析与研究提供了一种强有力的手段，是现代分子生物学研究中的一项富有革新性的创举，对整个生命科学的研究与发展，都有着深远的影响。 现在，PCR技术不仅可以用来扩增与分离目的基因，而且在临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进化研究，以及法医学等诸多领域都有着重要的用途。 因此，在该技术问世不久，即被在科技界享有盛誉的美国Science杂志评为1989年度十大科技新闻之一，成为全世界引用频率最高的文献。 PCR技术的特点:PCR技术快速敏感，简单易行，其原理并不复杂，与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。 首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链。 此外，DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动(引导)新链的合成。 因此，新合成的DNA链的起点，事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。 这是PCR的第一个特点，即它能够指导特定DNA序列的合成。 在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链DNA都可作为合成新生互补链的模板。 由于在PCR反应中所选用的一对引物，是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反链延伸。 这样，在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点。 然后反应混合物经再次加热使新、旧两条链分开，并加入下轮的反应循环，即引物杂交、DNA合成和链的分离。 PCR反应的最后结果是，经n次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是112n。 这就是PCR技术的第二个特点，即使特定的DNA区段得到了迅速大量的扩增。 PCR反应涉及多次重复进行的温度循环周期，而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤组成。 鉴于目前PCR技术已经获得了极其广泛的用途、测试的DNA样品多种多样、所用的寡核苷酸引物长短不一等诸多因素，因此要给出一个标准的温度循环参数其实是十分困难的。 研究者要根据自己的实验材料和研究目的，通过具体操作才能得出符合要求的、比较理想的温度循环参数。 在一般的情况下，首先是将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(91C)环境下加热1分钟，使双链DNA发生变性作用，分离出单链的模板DNA；然后降低反应温度(约50C)，致冷1分钟，使专门设计的一对寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用，结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，将反应混合物的温度上升到72C左右保温15分钟，此时在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸分子便从引物的3-端开始参入，并沿着模板分子按5-3的方向延伸，合成出新生的DNA互补链。 PCR扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过30次的循环反应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106一107倍的扩增。 例如，当我们按常规的PCR程序扩增一种人类基因时，其标准的反应是加入1?g的人类基因组DNA(一般从1ml血样中可以获得50?gDNA)。 它应含有平均长度为10kb的各种单拷贝序列分子3105，相当于01pg(或10-13g)的300个核苷酸长的靶DNA序列。 经过30次循环扩增之后，便可产生出约1?g的靶DNA片段，足以满足任何一种分子生物学研究，包括直接的DNA序列测定的需要。 实验表明，从100?lPCR扩增反应混合物中，取10?l的少量样品，经EtBr琼脂糖凝胶电泳之后，在紫外光下便可观察到清晰的靶DNA条带。 有人报道即便反应混合物中只含有一个拷贝的靶DNA分子，亦能被有效地扩增。 正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，所以任何DNA样品或实验试剂均应仔细避免发生被污染的可能性，同时也意味着分子生物学分析现在已可应用于只含有痕量DNA的样品，包括一根头发、血迹等,这对于法医学具有特别的应用价值。 Taq DNA聚合酶在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段，但这种酶是热敏感的，在双链DNA解链所需的高温条件下，会被破坏掉。 因此在每一个循环反应中，都需通过人工操作不断补充新鲜的聚合酶。 这样的实验过程不仅费时乏味而且浪费金钱。 此外，Klenow大片段酶的最佳聚合反应温度是37C，在这样偏低的温度条件下，容易促使DNA引物与模板序列之间形成非专一的碱基错配，或易受某些DNA二级结构的影响，结果使扩增反应混合物中产生出非特异的DNA条带，降低了PCR产物的特异性。 1988年，RKSaiki等人成功地将热稳定的TaqDNA聚合酶应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性，是PCR技术走向实用化的一次突破性的进展。 TaqDNA聚合酶最初是由HAErlich于1986年从一种生活在温度高达75C的热泉中的细菌，即栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化出来的。 在补加有四种脱氧核苷三磷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)的反应体系中，Taq酶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，从分别结合在扩增区段两端的引物为起点，按5-3的方向合成新生互补链DNA。 这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，其最适的活性温度是72C，连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需求。 因此，Taq酶的开发利用有力地促进了PCR操作过程自动化的实现。 与大肠杆菌DNA聚合酶相比，Taq酶的应用的确使PCR的特异性和敏感性都有了明显的提高。 然而就像所有其它生化过程一样，DNA复制也不可能是一种绝对精确的过程。 在偶然的情况下，DNA聚合酶也会将错误的核苷酸加入到DNA的生长链。 在天然复制的DNA分子中，这种错误参入的机率大约是每109个核苷酸中有一个。 在细胞内DNA复制之所以能达到如此精确的地步，是因为它存在着一种校正机理，能从DNA链上移去错配的碱基对。 在体外使用的TaqDNA聚合酶已经失去了这种3-5方向的校正活性，因此在典型的一次PCR反应中Taq酶造成的核苷酸错误参入的机率大约是每2104个核苷酸中有一个。 这对于大批量的PCR产物分析而言，并不会构成什么严重的问题，因为具同样错误参入核苷酸的DNA分子，仅占全部合成的DNA分子群体的极小部分。 然而，如果PCR扩增的DNA片段是用于分子克隆，那么核苷酸的错误参入则是值得重视的事件。 每一个克隆都是单一的扩增分子，如果此种分子含有一个或数个错误参入的核苷酸，那么在该克隆中的所有克隆DNA都将带有同样的突变。 所以对于扩增用于克隆的DNA，十分重要的是要检测克隆产物的DNA序列，以便弄清在PCR反应过程中可能发生的任何突变。 当然，通过克隆测序以及同一系列独立扩增的DNA分子进行比较，便能够评估PCR扩增产物的精确性。 现在已经发现另一种扩增反应精确性有所提高的热稳定的DNA聚合酶，这将有助于克服核苷酸错误参入的问题。 12复习思考题、作业题1.试述PCR的工作原理和实验方法？2.PCR技术的应用？3.为什么PCR反应须在三个不同的温度（高温、中温、低温）下重复循环？4.Taq DNA聚合酶的特点？5.聚合酶链式反应（PCR）的英文全称？6.试述PCR技术参数聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板的各自作用？7.为什么PCR反应要设阳性对照和阴性对照？8.溴化乙锭使用时的注意事项？9.溴酚蓝加样缓冲液、EB(溴化乙锭)和Marker在DNA琼脂糖凝胶电泳中的作用？10.PCR引物设计的原理？下次课预习要点1.了解DNA片段回收的原理；2.了解DNA片段连接的原理；3.掌握DNA连接的方法。 13分子生物学实验教案授课时间xx.5.21（5.24/5.26）第2次课授课章节实验二 （1）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段任课教师及职称张荃副教授教学方法与手段多媒体与实验教学课时安排2学时使用教材和主要参考书1.分子克隆实验指南(第二版)，【美】J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社，19952.精编分子生物学实验指南，【美】F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿；颜子颖王海林译，科学出版社，19993.基因工程，楼士林，阳盛昌，龙敏南，章军，科学出版社，xx4.植物基因与分子操作，顾红雅、陈章良等著，北京大学出版社，19955.基因工程及其分子生物学基础，静国忠主编，北京大学出版社，19996.植物工程，李立家，肖庚富，科学出版社，xx7.最新分子生物学实验技术梁国栋主编科学出版社xx8.分子生物学理论与技术顾晓松等主编北京科学技术出版社xx教学目的与要求要求掌握1.了解DNA片段回收的原理；2.掌握用试剂盒回收DNA的方法教学重点，难点1.了解DNA片段回收的原理；2.掌握用试剂盒回收DNA的方法教学内容14实验二 （1）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段实验目的了解DNA片段回收的原理，掌握用试剂盒回收DNA的方法。 实验原理本实验所用的回收试剂盒的原理是在DR-1Buffer存在的条件下，使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片段吸附于Spin column的滤膜上。 最后用Elution Buffer或灭菌的双蒸水溶出DNA。 实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.高速台式离心机2.微量取液器（二）材料实验一切下的含有回收片段琼脂糖凝胶（三）试剂试剂盒(TaKaRa AgaroseGel DNApurification Kit,Ver.2.0)(50次量)；其余同实验一。 实验步骤1.使用TAE或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。 应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率。 注:切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损失。 3.切碎胶块，可加快步骤6的胶块融化时间，提高DNA回收率。 4.称量胶块重量，计算胶块体积。 以1mg=1?L进行计算。 5.向胶块（1%）中加入3个凝胶体积量的胶块融化液DR-1Buffer。 6.混合均匀后75C加热融化胶块。 并间断振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。 7.加入DR-1Buffer的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。 注当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。 8.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 9.将步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。 注如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA回收率。 10.将500?L的Rinse A加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。 11.将700?L的Rinse B加入Spin Column中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。 12.重复步骤11。 13.将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25?L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 注把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60C使用时有利于提高洗脱效率。 14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。 注意事项?切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损失。 ?胶块一定要充分融化，否则会严重影响DNA的回收率。 ?混合振荡操作不要过于剧烈。 ?灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60C使用时有利于提高洗脱效率。 ?15DNA需长期保存时，建议使用Elution Buffer。 ?纯化的DNA用于序列分析时，最好使用灭菌的双蒸水进行DNA的洗脱。 附IH.Q.Q.凝胶回收试剂盒II(H.Q.Q.Gel ExtractionKit II)安徽优晶（U-GENE）生物工程有限公司1.0.7g（700mg）700?L(1mg=1?L)2.700?L NJ缓冲液3.混合物55-65C，7min(期间需振荡混匀2-3min)(正常为浅黄色)4.700?L溶液转到Mu-Pu纯化柱，8,000g-10,000g,1min弃去流出液5.700?L乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液加入柱中静置2-3min10,000g,1min弃去流出液（重复一次）6.空柱10,000g,1min（甩干！）7.柱子装入新的1.5mL EP管中30-50?L DNA洗脱缓冲液or无菌去离子水于柱基质-静置1min8.10,000g,1min洗脱DNA.凝胶回收操作主方案请您在正式操作之前仔细阅读本说明书确保完全熟悉本操作方案。 1.处理琼脂糖凝胶EB电泳混合物以分别分离DNA片段。 任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。 我们强烈的建议您使用新鲜的TAE Buffer或TBE Buffer作为电泳缓冲液。 不要重复使用电泳缓冲液，因为会因其pH的增加而减少产量。 2.当带纹间的间距达到足够的量的时候，在紫外灯上小心的把所需的DNA片段切下来。 这样就能保证把含DNA的凝胶尽量多的取出来。 DNA爆光在紫外灯下的时间不要超过30秒，同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜。 3.通过把凝胶薄片装在1.5ml小离心管中称其重量的方法，近似地确定其体积。 假设其密度为1gml，于是凝胶的体积便可通过如下方法得到如凝胶薄片的质量为0.2g，则其体积为0.2ml。 加入等体积的NJ缓冲液，把混和物置于55-65水浴中温浴7min,至凝胶完全融化。 水浴期间将离心管振摇或旋涡混匀2-3分钟。 注意在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-NJ缓冲液混和物的pH值。 如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。 观察混合物的颜色，如果是橙色或红色，则要加入5l浓度为5M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。 经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。 4.把700l的DNA琼脂糖溶液加到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，并把柱子装在一干凈的2ml收集试管内，室温下于8,000-10,000xg离心1min，弃去流出液。 对于体积大于700l的样品，则分别加到不同的柱子上，每次750l，每一个Mu-Pu DNA回收纯化柱都有一个极限为25-30ug DNA的吸附能力。 如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱中。 5.用700l无水乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液洗涤柱子,加入柱中后静置2-3分钟。 室温下10,000xg离心1min。 6.可选做的步骤弃去流出液，重复第5步一次。 7.弃去流出液，把空柱10,000xg离心1min以甩干柱基质残余的液体。 这步对得到好的DNA产量是十分重要的。 8.16把柱子装在一个灭菌干凈的1.5ml离心管上，加入30-50l的DNA洗脱缓冲液(取决于最终产品的浓度)或无菌去离子水到柱基质上,10,000xg离心1min以洗脱出DNA。 这样约可得到70%的结合DNA。 如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的话浓度就会降低。 注意从柱子上洗脱DNA的效率取决于洗脱液的pH值。 如果是用水洗脱，应确保其pH值在8.0左右9.DNA的产量及质量把抽提到的样品稀释一定的倍数后，分别在260nm和280nm下测其光吸收值，回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算DNA浓度A26050稀释倍数gml长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量。 而50bp-500bp的带则可达到55-80的回收率。 （A260A280）的比率是核酸纯度的一个标记。 如果此值1.8，则意味着核酸的纯度90。 另一方面，产量（或者是产物的质量）有时主要取决于琼脂糖EB电泳。 凝胶回收真空操作方案（ZK-spin）注意在使用此操作方案之前应仔细阅读说明书前面的部分。 1.准备凝胶样品并按照前面凝胶抽提主方案中步骤1-3进行凝胶溶解。 2.依照厂家的提示准备好真空泵（多支管的），并把ZK-Spin柱连至真空泵上。 3.把主方案第3步中得到的DNA/琼脂糖溶解液转至ZK-Spin柱中。 4.打开真空泵电源，待样品流过柱子后，关上电源。 5.按上述方法，用750l SPW洗涤液洗涤柱子两次。 6.把柱子装到一个2ml收集试管上，并转至小离心机上，极速离心1min以干燥柱子。 7.把柱子转至一个干净的1.5ml小离心管上，加30-50l TE缓冲液或灭菌去离子水，静置12min,接着室温下10,000xg离心1min以洗脱DNA。 简短操作方案（对熟练者）1.取得含目的DNA片段的凝胶薄片。 2.确定凝胶的体积。 加入与凝胶薄片等体积的结合缓冲液。 3.55-65?C温育7分钟直至凝胶完全熔化。 4.加入700l上述溶解液至Mu-Pu DNA回收纯化柱中，柱子事先套上一个2ml收集试管。 5.室温下极速离心1分钟。 弃去流出液。 6.用700l乙醇稀释过的SPW洗涤缓冲液洗涤柱子两次。 7.极速离心空柱1分钟以甩干硅膜。 8.将柱子放入一个洁净的1.5ml离心管中，用30-50l无菌水或TE缓冲液洗脱DNA。 离心1分钟。 附II使