酶制剂在玉米生料发酵酒精中的应用.doc

九江学院10届学士学位论文：生物酶制剂在玉米生料发酵酒劲中的应用JIU JIANG UNIVERSITY毕 业 论 文 题 目 酶制剂在玉米生料发酵酒精中的应用英文题目Enzyme Preparation in corn ethanol fermentation with uncooked application院 系 生命科学学院 专 业 生物科学 姓 名 张振宇 年 级 06级 指导教师 李汉全 二零一零年六月 摘 要实验所用生料发酵酒精复合酶是九江中星联生物科技公司提供的一种复合酶制剂。研究表明，其在玉米生料发酵中的合理添加有效的解决了玉米的液化和糖化问题。经过反复试验，生料酒精复合酶的最优比例为在料水比为12时每200g玉米粉加01#酶（80uL）；10#酶(450uL)；A酶(200uL)；03#酶(20uL)；04#酶(5uL)；05#酶(0.4uL)；11#酶(400uL) ；23#酶(4.6uL) ；24#酶(10uL)。这使得发酵液中还原糖的含量达到酵母生长和发酵的最适浓度，避免了杂菌的大量感染。经过复合酶对淀粉的分解和转化，发酵液中残淀粉、残糊精、残还原糖、残总糖和过滤总糖的含量大大降低，最大限度的使淀粉转化为酵母菌可利用的还原糖，进而发酵转化为酒精，从而显著提高了发酵液中的酒精含量。关键词 酶制剂；淀粉生料发酵；应用AbstractThe alcohol fermentation with uncooked compound enzyme is jiujiang zhongxing couplet biotechnology company provides a compound enzyme preparation. Research shows that, in the corn in the fermentation with uncooked add effectively solve the problem of corn liquefaction and glycosylated. After repeated experiments of alcohol compound enzyme raw materials for the optimal proportion than in water for 1:2 each 200g cornmeal and 01# enzymes (80uL), 10# enzyme (450uL), A enzyme (200uL), 03 # enzyme (20ul), 04# enzymes (5uL), 05 # enzyme (0.4 ul), # 11 enzyme (400uL), 23 # enzyme (4.6 ul), 24 # enzyme (10ul). This makes the result of reducing the yeast fermentation to grow and content of the optimal concentration, avoid the amount of bacteriainfection. After the decomposition of starch compound enzyme and transformation, result of residual amylum, residual dextrin and residual reducing sugar, total sugar content and filtration greatly reduced the maximum makes starch into yeast available, reducing alcohol fermentation into, thus greatly improve the result of alcohol content.key enzyme preparation;Fermentation with uncooked starch;application目录摘 要iiAbstractiii前 言11 材料与方法21.1材料21.1.1供试酶制剂21.1.2供试菌株21.1.3原料21.1.4其它仪器、材料和试剂21.2方法21.2.1培养基的制备21.2.2酵母菌扩培41.2.3酒精发酵阶段41.2.4发酵液试样酒精和挥发酸含量检测41.2.4.1酒精含量检测41.2.4.2挥发酸含量检测51.2.5发酵液各组分含量检测51.2.5.1残余还原糖的测定51.2.5.2残余总糖的测定61.2.5.3酸度的测定62结果与分析82.1失重的比较82.2酒分和挥发酸的比较112.3 其它数据比较123讨论14参考文献15谢 辞1616九江学院10届学士学位论文：生物酶制剂在玉米生料发酵酒劲中的应用前 言能源是人类赖以生存和持续发展的重要物质基础。常规矿物燃料的有限储量和其利用时对环境造成严重污染，使人类面临着日趋严重的能源危机和环境恶化。合理开发利用生物质能无论在能源安全战略上、经济上，还是在生态环境保护方面都具有重要意义1。据估计，在未来40年，生物质能源将占全球总耗能的40。其中，燃料乙醇是生物质能源中最容易实现产业化的品种之一。近二十多年来，随着化石能源日渐枯竭，石油价格攀升，寻找清洁环保、可再生的石油替代品及其加工制造技术已成为世界各国关注的焦点。普遍认为，燃料乙醇是车用燃料最适合的替代产品，燃料乙醇制造及使用技术的开发将对节约石油资源、减少环境污染、促进农业和其他相关产业的发展具有重大意义。更为重要的是，用生物质制造的燃料乙醇是太阳能的一种表现形式，在自然界物质能量循环系统中组成可再生、无污染的闭路循环，永不枯竭，是组成人类进入后化石能源时代的重要能源之一2、3、4、5。我国于2000年开始启动车用乙醇项目，已取得初步成果。目前，我国每年乙醇产量已经达到300多万吨，其中80%用淀粉质原料生产，约有10%用废糖蜜生产，以亚硫酸盐纸浆废液等纤维原料生产的乙醇约占2%，石油裂化合成的占3.5%左右。淀粉质原料主要以玉米等陈化粮为主。目前，玉米仍是我国生产乙醇的主要原料，比较成熟的生产工艺是熟料发酵，基本都在糖化前先经过高温高压蒸煮液化，这种工艺虽然使得淀粉的糖化比较彻底，没有造成原料的浪费,但这一工序占整个生产过程所耗能量的30%40%6、7、8、9。而生料发酵酒精是利用酶的效用对淀粉进行液化和糖化，取消了高温高压蒸煮工序，从而大幅度节省能量及设备。随着酶工业和酵母工业的产业化，生料发酵酒精取得了实质性进展，但不同的酶制剂在发酵酒精生产的应用研究鲜见报道。因此采用不同的酶制剂组合对淀粉发酵酒精进行了试验研究10。本文对酒精复合酶各酶的添加量进行了初步研究，现将实验情况介绍如下，为今后对该问题的进一步研究提供相关实验数据、理论依据和有益参考。1 材料与方法1.1材料1.1.1供试酶制剂 生料发酵酒精复合酶：01#酶、10#酶、A酶、03#酶、04#酶、05#酶、11#酶、23#酶、24#酶，江西九江中星联生物科技有限公司提供。1.1.2供试菌株 超级酿酒高活性干酵母，江西安琪公司生产。1.1.3原料原料为市场上出售的玉米粉，过20目筛。1.1.4其它仪器、材料和试剂 BS-2FD型双层立式全温培养摇床（苏州威尔实验用品有限公司）、PHS-3C型酸度计（上海盛磁仪器有限公司）、GZX-9070MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、LDZX-30KBS立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、WD-9403F紫外仪（北京市六一仪器厂）、电子天平、20目标准筛、移液器、双目生物显微镜、各种玻璃仪器和有机溶剂等。1.2方法1.2.1培养基的制备 酵母培养及发酵综合培养基：玉米全粉200g，尿素0.26g，口服青霉素V钾0.01 g，水400 ml，用20%的硫酸溶液调pH值为4.44.5，生料酒精发酵复合酶（各个酶加入量根据实验方案而定），装于1000 ml三角瓶中，29、125 rpm恒温振荡1h即得。说明：由于是初步研究，酒精复合酶各个酶的添加量是经过多轮发酵实验得出的。下面只列出三个比较有价值的方案进行分析。 表1-1 酒精复合酶添加方案一试验号酶类别01#酶（uL）10#酶(uL） A酶（uL)03#酶 (uL)04#酶(uL)05#酶 (uL)11#酶 (uL)23#酶(uL)24#酶 (uL) 1-1 80 300 200 20 5 0.4 200 4.6 10 1-2 80 300 200 20 5 0.4 200 4.6 10 1-3 80 300 200 20 5 0.4 200 4.6 10 2-1 80 300 200 20 5 0.4 4.6 2-2 80 300 200 20 5 0.4 4.6 2-3 80 300 200 20 5 0.4 4.6 3-1 80 300 200 20 5 0.4 4.6 10 3-2 80 300 200 20 5 0.4 4.6 10 3-3 80 300 200 20 5 0.4 4.6 10 表1-2 酒精复合酶添加方案二 试验号酶类别01#酶(uL) 10#酶(uL) A酶(uL）03#酶(uL)04#酶(uL)05#酶(uL)11#酶(uL)23#酶(uL)24#酶(uL) 1-1 80 300 200 20 5 0.4 200 4.6 10 1-2 80 300 200 20 5 0.4 200 4.6 10 1-3 80 300 200 20 5 0.4 200 4.6 10 2-1 80 300 200 20 5 0.4 400 4.6 10 2-2 80 300 200 20 5 0.4 400 4.6 10 2-3 80 300 200 20 5 0.4 400 4.6 10 3-1 80 300 200 20 5 0.4 600 4.6 10 3-2 80 300 200 20 5 0.4 600 4.6 10 3-3 80 300 200 20 5 0.4 600 4.6 10 表1-3 酒精复合酶添加方案三试验号酶类别01#酶（uL) 10#酶 (uL) A酶 (uL)03#酶(uL)04#酶(uL)05#酶(uL)11#酶(uL)23#酶(uL)24#酶(uL) 1-1 80 350 200 20 5 0.4 400 4.6 10 1-2 80 350 200 20 5 0.4 400 4.6 10 1-3 80 350 200 20 5 0.4 400 4.6 10 2-1 80 400 200 20 5 0.4 400 4.6 10 2-2 80 400 200 20 5 0.4 400 4.6 10 2-3 80 400 200 20 5 0.4 400 4.6 10 3-1 80 450 200 20 5 0.4 400 4.6 10 3-2 80 450 200 20 5 0.4 400 4.6 10 3-3 80 450 200 20 5 0.4 400 4.6 10 4-1 80 500 200 20 5 0.4 400 4.6 10 4-2 80 500 200 20 5 0.4 400 4.6 10 4-3 80 500 200 20 5 0.4 400 4.6 101.2.2酵母菌扩培将保存在冰箱的活性干酵母放在室温一段时间，称取0.2 g接入配制好的酵母培养及发酵综合培养基，称重并记录，29、125 rpm恒温振荡培养24h，称重并记录。1.2.3酒精发酵阶段经过12h酵母菌的扩大培养，培养基中有大量酵母菌，此时30、125 rpm恒温振荡培养24 h，每12h称一次重量并记录。24h后将温度调整为33.6,125 rpm恒温振荡培养24 h，每12h称一次重量并记录。发酵阶段结束，测定各种指标。1.2.4发酵液试样酒精和挥发酸含量检测1.2.4.1酒精含量检测说明：发酵成熟醪的酒精分是酒精发酵的主要产物，是衡量发酵产酒情况、计算发酵率的基本数据。同时也是鉴别发酵工艺过程是否正常的显著指标。发酵结束后，用200ml容量瓶量取发酵液试样200ml，倾入1000ml三角瓶中，再用原容量瓶取蒸馏水200ml加入瓶中，然后将三角瓶置于电炉上，安装好冷凝器进行蒸馏，以原用的200ml容量瓶承接馏出液至稍低于刻度为止。将盛装馏出液的容量瓶冷至20，定容至200ml。摇匀后，倒入干净干燥的量筒中，用校准过的酒精计和温度计测定酒度和温度，然后查酒精酒度温度更正表，校正为20时的酒度。1.2.4.2挥发酸含量检测说明：发酵成熟醪的挥发酸，是衡量发酵过程感染杂菌程度的一项重要指标。 取50ml发酵液试样放入200ml圆底烧瓶中，按下图装置进行水蒸汽蒸馏。开始蒸馏时， 水蒸气和试样瓶可同时加热，当试样瓶的温度达到90时，停止加热，让水蒸汽通过，进行水蒸汽蒸馏。收集馏出液约200ml后停止蒸馏。在馏出液蒸馏瓶中加入23滴酚酞指示剂，用0.1N氢氧化钠滴定至呈现微红色在30秒钟内不消失为终点。计算方法：如按醋酸表示挥发酸的含量，则挥发酸含量%=VF0.00650100=0.012VF以上两式中 V滴定消耗0.1N氢氧化钠毫升数 F0.1N氢氧化钠的当量浓度校准系数 0.0061ml0.1N氢氧化钠相当于醋酸的克数1.2.5发酵液各组分含量检测1.2.5.1残余还原糖的测定说明：残余还原糖这项指标，通常是反映酒母质量的标志。酒母质量不良，常使成熟醪的残余还原糖升高。在正常情况下，残余还原糖在0.10.3% 之间。称取发酵液试样50g，用脱脂棉过滤，取滤液并加热蒸去酒精，用水洗入250ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，过滤后备用。空白实验：吸取斐林氏甲、乙各5ml，放入150ml三角瓶中，加蒸馏水20ml，由滴定管加入0.2%葡萄糖液24ml，至电炉上加热煮沸2分钟，加入0.5%次甲基蓝溶液2滴，继续用0.2%葡萄糖液在一分钟内滴至终点。记录消耗糖液毫升数为V1。预备实验：吸取斐林氏甲、乙液各5ml，放入150ml三角瓶中，加入上述试样滤液510ml（视试样中含糖量而定），置电炉上加热煮沸2分钟，用0.2%葡萄糖液滴定，待蓝色即将消失时，加入0.5%次甲基蓝溶液2滴，继续用0.2%葡萄糖液滴定至终点，记下消耗糖液毫升数。正式实验：吸取斐林氏甲、乙液各5ml，放入150ml三角瓶中，加入上述试样滤液510ml及适量的蒸馏水。再加入比预备试验少1ml的0.2%葡萄糖液，置电炉上加热煮沸2分钟，加次甲基蓝溶液2滴，继续用0.2%葡萄糖液滴定至终点。记录消耗糖液毫升数为V2计算方法： 计算式以0.2%葡萄糖液的用量为基准。 还原糖%=（V1V2）0.002250V350100 式中 0.0020.2%葡萄糖液每毫升含葡萄糖克数 V3加入试样滤液毫升数 50称取试样克数 250试样稀释至250ml1.2.5.2残余总糖的测定 称取发酵液试样50g，用脱脂棉过滤，取滤液并加热蒸去酒精，用45ml水仔细洗入250ml三角瓶中，加入20%盐酸溶液20ml，瓶塞上装有1m以上的玻璃管，放入沸水浴中水解35min，去除冷却后，用20%氢氧化钠溶液中和至微酸性（用PH试纸检察），滤入250ml容量瓶中，用水多次洗涤残渣，然后定容至刻度，摇匀备用。定糖和计算，与测定残余还原糖相同。1.2.5.3酸度的测定说明：发酵成熟醪的酸度（即总酸），是反映发酵过程感染杂菌程度的主要指标。在正常情况下，发酵成熟醪酸度的增加不应超过1度酸。为了准确测定酸度，必须将醪液中溶解的二氧化碳的影响加以排除。其测定方法如下：吸取发酵液试样过滤液2mL，放入250mL三角瓶中，加中性蒸馏水100mL，安装好冷凝管，置沸水浴中煮沸30min后，将带冷凝管的三角瓶速冷至室温，加酚酞指示剂2滴，用0.1N氢氧化钠滴定至终点。计算方法： 酸度=滴定用氢氧化钠毫升数101/2N0.1 式中 N氢氧化钠的实际当量浓度，如N=0.1 则 酸度=滴定用氢氧化钠毫升数101/20.10.1=滴定用氢氧化钠毫升数5 2结果与分析2.1失重的比较 酵母在发酵过程中会长生大量的二氧化碳，所以发酵时三角瓶中会有大量气泡溢出，使得其质量减少。根据失重的大小和平行性可以初步判断酒精含量的高低和实验数据的稳定性。三个方案的失重情况如下表： 表2-1 方案一的失重情况表称量时间试验号1-11-21-32-12-22-33-13-23-32010-4-20 20:00 9249289269219249239229239252010-4-21 08:00 911914914912915916912912914 12小时减重量 13 14 12 9 9 7 10 9 92010-4-21 20:00903905905905908910904903905 12小时减重量 8 9 9 7 7 6 8 9 92010-4-22 08:00896898897901904905900898899 12小时减重量 7 7 8 4 4 5 4 5 62010-4-22 20:00890892890895898900893893894 12小时减重量 6 6 7 6 6 5 7 5 52010-4-23 08:00884886882891895896888889890 12小时减重量 6 6 8 4 3 4 5 4 42010-4-23 20:00881882879889893892885886886 12小时减重量 3 4 3 2 2 4 3 3 42010-4-24 08:00879880875887892890884883884 12小时减重量 2 2 4 2 1 2 1 3 2重量减轻总数 45 48 51 34 32 33 38 40 41分析：从表一中数据可以看出方案一失重的平衡性很好，每组之间的失重梯度很明显，比较成功。第一组的失重最大，其次是第三组，最差的是第二组，很好的说明了11#酶和24#酶在酒精发酵中起重要作用。再看前面36小时的失重，仍然是第一组最大，其次是第三组，最后是第二组，这说明11#酶和24#酶主要在酵母培养阶段和前发酵阶段起作用，由此推断11#酶和24#酶主要负责淀粉的分解和糖化，因为酵母不能利用淀粉，所以在酵母扩培期必须经过酶的催化使淀粉转化为其可利用的还原糖，以便酵母进行生长和发酵。表2-2 方案二的失重情况表称量时间试验号1-11-21-32-12-22-33-13-23-32010-4-24 20:009249309269249269279859709622010-4-25 08:0091091791590691091097195795012小时减重量1413111816171413122010-4-25 20:00901 90890589289890096294694012小时减重量9910141210911102010-4-26 08:0089290089788288789095493893112小时减重量9881011108892010-4-26 20:0088889489187688188494893292412小时减重量4666666472010-4-27 08:0088388988687087788094492892012小时减重量5556444442010-4-27 20:0088188688386787487894192591712小时减重量2333323332010-4-28 08:0087888487986587087393992291412小时减重量324245233重量减轻总数464647595654464848分析：从表二中的数据可知方案二各组内失重的平衡性很好，数据具有很好的参考价值，而且失重很大，预期酒精百分比会很高。第二组的失重较一、三组大一些，说明在目前料水比的情况下，11#酶的最适添加量为400uL。 表2-3 方案三的失重情况表称量时间试验号1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-32010-4-30 20:009259339309219339289749519569729819542010-5-01 08:0091192091690791991496093694295796693912小时减重量1413141414141415161515142010-5-01 20:0089990790389390590094592292794395192412小时减重量1213131414141514151415152010-5-02 08:0088889889388389589193691391793194091312小时减重量119101010999101211112010-5-02 20:0088189288787688788392890590992593390512小时减重量7666888886782010-5-03 08:0087688588187088287892289990491992889912小时减重量5746556656562010-5-03 20:0087288187786787787391889589991692389512小时减重量4443554453562010-5-04 08:0086987887386387587091689289691392189312小时减重量334423233322重量减轻总数565557585858585960596061分析：从表三的数据来看，本次发酵实验的失重普遍高于前两次，这是因为确定了11#和24#最适添加量后，淀粉的糖化和液化与酵母菌的生长和繁殖相适应，使得发酵达到一个合理阶段，增加了酒精的产量。本次有关于10#梯度，第四组的失重相对大一些，但差别不是很大，所以对10#酶添加量的要求不是很高。2.2酒分和挥发酸的比较 表3-1 方案一的酒分和挥发酸情况表项目试验号 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3酒分（%）10.7810.4010.219.409.629.389.609.899.70挥发酸（%）0.1400.1320.1300.1040.1120.1120.1400.1400.140分析：本批次实验各组内数据的平行性不够理想，但各组间的梯度差异还是很明显的。第一组的酒分最高，挥发酸含量相对适中，基本达到了实验要求，再结合前面的失重情况，进一步验证了11#和24#酶对发酵的重要性。第二组的酒分低，挥发酸也很低，结合失重情况，可以得出其主要原因是发酵过程中缺少11#和24#酶的催化，淀粉的液化糖化程度大大降低，使得酵母可利用的还原糖量相对减少，影响了其生长繁殖和发酵作用，从而降低了酒精含量；由于缺乏营养成分，杂菌的生长繁殖也受到影响，所以挥发酸的含量也较低。第三组的酒分和挥发酸含量都较第一组低，主要是因为其少加了11#酶，影响了发酵。 表3-2 方案三的酒分和挥发酸情况表项目试验号 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 酒分（%） 9.80 9.80 9.30 10.90 10.50 10.20 10.00 10.18 10.20挥发酸（%）0.0880.0560.0980.0840.1120.1120.1400.1400.140分析：本次实验比较成功，各组间梯度差异明显，各组内的数据平行性也挺好，很有参考价值。从表3-2可以看出，第二组的酒分最高，挥发酸含量也控制的很好，说明当前料水比11#酶的最适添加量为400uL，此时，淀粉的糖化速度和程度适中，大都随着酵母的生长繁殖和发酵被其利用。第一组是糖化程度不够，淀粉没有被充分利用，酵母可利用营养成分不足，酒分无法提高。第三组是明显的营养过剩，虽然酒分相对高一些，但丰富的营养使得杂菌大量增长，跟酵母竞争糖分，产生大量挥发酸，影响了酵母发酵，所以糖化程度高而酒分却不高。 2.3 其它数据比较 表4-1 方案一情况表项目试验号1-11-21-32-12-22-33-13-23-3残还原糖（%）0.1100.1000.1100.1400.1650.1500.1300.1200.120残总糖（%）2.6002.5672.3563.1503.3403.3362.9963.0903.036表4-2 方案二情况表项目试验号1-11-21-32-12-22-33-13-23-3残还原糖（%）0.1390.1170.1280.1070.1100.1190.1110.1090.109残总糖（%）3.8303.9243.8342.3562.9162.6883.4423.5363.556分析：从表4-1可以看出各组残还原糖都在正常范围内，而且相对较低，这说明实验用的酵母质量是较好的，有很好的发酵能力。但第二组的残还原糖明显高于其它两组，这可能是因为前期淀粉糖化程度低，营养成分不能满足酵母的生长繁殖，使得发酵后期酵母发酵能力不足，还原糖过剩。残总糖需要综合考虑，由于酵母发酵能力不足，第二组中的还原糖没有被及时利用，含量较高，对淀粉的糖化有一定的抑制作用；酶的缺少也是其残总糖较高的原因。表4-2中第二组的残总糖最低，很好的验证了11#酶的作用。3讨论中星联生物科技有限公司研制的酒精复合酶具有高效的催化性，本文对其在玉米生料发酵酒精中的最适添加及配比进行了初步研究，复合酶能有效解决玉米生料发酵酒精中淀粉的液化糖化，而且可以把一些难分解的多糖很好的转化为酵母可以利用的糖类，在原料量一定的情况下，很大程度提高了酵母可利用的糖分，从而提高了酒精含量。本实验只列举了对11#、10#和24#酶的梯度实验，通过比较各组的失重、酒分、挥发酸、残还原糖和残总糖等数据指标，来推断各种酶在酒精发酵中的主要作用，进而推断出各个酶的最适添加量及配比。在发酵过程中，当没有添加酒精复合酶时，最终发酵醪的失重和酒分都很低，这主要是原料中的淀粉没有充分转化为酵母可利用的还原糖类，影响了酵母的生长繁殖和发酵，使酒分无法提高。当添加量过多时，原料中的淀粉糖化率达到最大值，造成营养过剩，使得酵母在前期增长过快，成为营养过剩型，这样的酵母往往到发酵后期发酵能力大幅度下降，影响酒分的提高；同时，丰富的营养使得杂菌迅速生长繁殖，产生大量挥发酸，影响酵母的发酵，使得酒分降低。所以要通过实验找到酶的最适添加量，使得淀粉的糖化速度和程度与酵母的生长繁殖和发酵强度相对应，进