谷胱甘肽转硫酶的制备.doc

谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究摘要：谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GST）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%，是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族。通过本次试验初步掌握了亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶，以及测定酶活力、米氏常数和最大反应速度的方法。关键词：谷胱甘肽转硫酶 亲和层析 酶活力 米氏常数 1实验原理1.1亲和层析原理亲和层析的方法是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。亲和层析法分离生物大分子示意图如下： 1.2.1测定酶活力的原理酶促反应速度：在一定条件下，以单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，用产物浓度对反应时间作图，得到酶促反应速度曲线。酶促反应体系复杂，影响酶促反应速度的因素很多，包括底物浓度、酶浓度、产物浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等影响因素。在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物存在下，反应初速度与酶浓度成正比。在酶促反应速度曲线上，过原点做切线，其斜率即为初速度。酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位定义为：在一定条件下，一定时间内，将一定量的底物转化为产物所需要的酶量，酶活力的大小即酶含量的多少。通常酶催化的反应速度越大，酶活力越高，反之，酶活力越低，所以酶活力的测定就是测定酶促反应的速度，即单位时间内底物或产物的浓度变化。测定方法主要是根据产物或底物的物理化学特性来决定具体的测定方法，分光光度法具有操作简便，时间短，灵敏度高等优点，是一种最重要的酶活力的测定方法。本实验采用1-氯2,4-二硝基苯（CDNB）和还原型谷胱甘肽作为酶的底物，分光光度法记录酶促反应生成产物GS-DNB引起的光吸收增加值，通过在340nm连续测定反应过程中产物光吸收值的变化，做出光吸收时间曲线，从而计算出酶活力。反应式为：1.2.2测定Km 和V的原理Km和最大反应速度V是酶的特征常数，不同的酶Km和 V不同，受底物、pH、温度、离子强度等因素的影响。将米氏方程的形式加以改变，可以得到几种方程形式，在特定条件下测得不同底物浓度S时相应的初速度v，用作图法测定Km和V。本实验采用终止法，即在酶和底物反应达到预定的时间（1min）时，立即加入强酸终止酶促反应，在这段反应时间里产物的生成量基本呈线性增加，用这段反应时间内的平均速度代替反应初速度，利用作图法，可以很方便地求出Km和V。1.3考马斯亮蓝G-250染色法实验原理考马斯亮蓝G-250Coomassie brilliant blue G-250，CBG）测定蛋白质含量属于一种染料结合法。CBG像指示剂，会在不同的酸碱度下变色：在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当结合蛋白质后，因为蛋白质会为CBG提供一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。游离状态考马斯亮蓝G-250的最大光吸收在465nm，CBG-蛋白质结合物最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内（10-1000ug/ml），CBG-蛋白质结合物的OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。2实验材料、仪器和试剂2.1实验材料动物肝脏组织2.2仪器：分光光度计、比色杯、秒表2.3试剂：0.5M NaCl：2000ml； 2M NaOH：250ml； 1M NaOH：100ml； 0.1M乙酸缓冲液（pH4.5）：1000ml； 56%二氧六环：200ml； 1M 乙醇胺：500ml； 缓冲液A：0.025M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1mmol/LEDTA，0.2MnaCl，1500ml； 缓冲液B：0.025M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），3mmol/L 谷胱甘肽（GSH），1000ml； 0.1mol/L (pH6.5)磷酸盐缓冲液（PB）； 60mmol/L CDNB：50ml（用1.5ml离心管分装）； 50%TCA：100ml （用1.5ml离心管分装）； 60mmol/LGSH：50ml（用1.5ml离心管分装）； 2mmol/LGSH：250m L； 染色液：CBG 100mg溶于50ml 95乙醇，加100ml85的磷酸，再用水定容到1L； 标准蛋白质溶液：0.25mg/ml的牛血清白蛋白，100ml。 3实验步骤3.1亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备（1）活化：称取10g Sepharose 4B，分别用100mL去离子水、0.5mol/L NaCl、去离子水淋洗，加入6.5mL 2mol/LNaOH、15mL 56%二氧六环和1.5mL 环氧氯丙烷，45恒温水浴摇动（160r/min），活化2-3h后，用100mL去离子水洗去活化剂。（2）偶联：0.4 g GSH 溶于10mL去离子水中，用1mol/L NaOH调节pH7.6，将其加入凝胶中，密闭，37恒温水浴摇动（60r/min），偶联24后，分别用100mL去离子水、0.5mol/L NaCl的0.1mol/L乙酸缓冲液（pH4.5）、去离子水淋洗。残余的活化基团用40mL 1mol/L乙醇胺封闭过夜，用100mL去离子水淋洗，得到亲和层析介质GSH-Sepharose。（3）装柱：柱床体积约4-6mL（柱高约2-3cm），连接蛋白质监测系统，用Buffer A平衡（约10-20mL），至记录仪基线平稳。3.2上柱样品的准备(1) 每组称取2g动物肝脏，剪碎，加入18ml Buffer A，用研钵研成匀浆。(2) 匀浆液离心机离心10min（4，8000rpm），弃沉淀，上清再次离心（4，8000rpm，10min），弃沉淀，上清液用滤纸过滤两次。 3.3亲和层析柱分离GST(1) 上柱：将滤液上柱，流速约4-5秒1滴。(2) 平衡：用Buffer A洗去杂蛋白至柱中介质变白，记录仪回到基线。(3) 洗脱：用Buffer B洗脱，流速约45秒1滴，收集洗脱峰（约5mL），分装冷冻。 3.4酶活力的测定 室温条件下测定，调好紫外分光光度计，取两个比色杯，按下表加样： （1）两个比色杯分别加入PB 、底物CDNB和GSH（60mmol/L），混匀；（2）以含参比溶液（不加酶的溶液）的比色皿调零；（3）在另一比色皿中加入酶后，立即混匀，开始计时，放入分光光度计中；（4）每隔30s记录吸光度，共反应4min。3.5Km和V的测定 取六支试管，按下表加样：（1）每个试管加入CDNB、GSH（2mmol/L）、PB后，加入酶，同时用秒表计时，立即混匀，静置，1分钟时加入50%的TCA，混匀，终止反应；（2）调好分光光度计，空白同酶活性测定，用0试管溶液放在“1”位上校零，测定其他各管的吸光值。3.6考马斯亮蓝法测定蛋白质含量制作标准曲线：取6支试管，依次分别加入0、0.10、0.15、0.20、 0.30、0.40、0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm值，绘制标准曲线。制作标准曲线加样表：4实验结果4.1亲和层析分离GST记录图 平衡洗脱4.2酶活力测定酶活力单位（IU）=0.0194.3酶比活力 提取液酶浓度=(0.361-0.0078)/3.3046=0.107（mg/ml）酶比活力(mol/minmg蛋白质)=0.019/(0.107*0.05)=3.5514.4米氏常数Km和VV=1/1.9166=0.522mol/(Lmin)Km=0.522*1.3745=0.71