转基因植物制药.ppt

第三节植物转基因技术 1 植物转基因技术的发展2 植物表达载体的构建3 植物转基因的过程4 转基因植株的鉴定 农杆菌介导法 基因枪法 植物转基因技术 花粉管通道法 其它方法 优点 低成本易操作 转基因的低拷贝数低 导入片段的确定性好 缺点 受作物基因型的影响较大 优点 低成本易操作 不受基因型影响 不需要经过组织培养可以获得转基因种子 缺点 导入片段的确定性差 转化效率很低 优点 不受作物基因型的限制 缺点 成本高 转基因的拷贝数高 导入片断的确定性差 聚乙二醇法 显微注射法 激光介导法 脂质体介导法 农杆菌介导法植物转基因的原理agrobacterium mediatedplanttransformation 基因枪法植物转基因的原理planttransformationviamicroprojectalbombardment 第四节植物转基因技术 1 植物转基因技术的发展2 植物表达载体的构建3 植物转基因的过程4 转基因植株的鉴定 pcambia1301质粒 t border right nos3 gus 35s5 nco i 35s5 hyg r t border left 35s3 hin diii sal i bam hi eco ri bst eii pcambia1301 11837bp lacz pcambia1301 pbs rsp1 2 35s hyg r t3p gus rsp2 lacz ncoi pcam gus bamhi hindiii kpni bamhi kpni hyg r t7p gus rsp1 kpni bamhi gus nos3 pcam rsp1 2 gus hyg r 35s 35s 35s rsp2 rsp1 kpni 用kpni和bamhi双酶切后连接 bamhi nos3 nos3 lb rb 1715bp firstintron 1182bp lb lb rb rb 水稻蔗糖合酶基因启动子驱动gus基因的表达载体构建 第四节植物转基因技术 1 植物转基因技术的发展2 植物表达载体的构建3 植物转基因的过程4 转基因植株的鉴定 2n6诱导愈伤7 10d n6 ba预培养2 3d 种子 优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系 ab as诱导12h ab培养基活化12h yep平板单菌落 液体ms浸泡15min 无生长素n6 as共培养3d n6 h选择培养20d 抗性愈伤组织的获得及植株再生30d 62d 70d 12n6愈伤诱导 2n6 ba预培养 3n6 h选择培养 优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程 4植株再生 第四节植物转基因技术 1 植物转基因技术的发展2 植物表达载体的构建3 植物转基因的过程4 转基因植株的鉴定 2 0kb 1 0kb 0 5kb 转基因植株中gus基因的pcr检测pcranalysisofgusinputativetransgenicplantletsm dnamarker p 以pcam gus1质粒为阳性对照 ck1 以水为模板的阴性对照 ck2 以未转基因植株为阴性对照 1 6 转基因植株 m dnamarker p pcam gus1plasmidaspositivecontrol ck1 thetempleteiswaterasnegtivecontrol ck2 non transformedplantletasnegativecontrol 1 6 putativetransgenicplantlets mpck1123456ck2 563bp 转基因水稻根 茎和叶的gus组织化学分析 a b c a b c a b c a b c a 根系 b 茎杆 c 叶片 a gus基因由35s启动子驱动 b gus基因由蔗糖合酶基因rsus1的启动子序列驱动 c 未转基因水稻植株 a roots b stems c leaves aandbrepresentthegusgeneisdrivedby35sandrsus1promoterrespectively c no transformedplantsasnegativecontrol 农杆菌介导的基因转移以原生质体或细胞 组织 作为受体的直接基因转移 如 聚乙二醇法 peg 电击 ep electroporation 脂质体 lip lome 磷酸钙 dna共沉淀 ca p 微注射 mi microinjection 基因枪法 particlebombardment 简称pb 超声波法 ulstrasonication 种质系统 germlinetranstormation 的基因转移 如利用子房注射 种胚以及花粉管通道等导入外源基因 植物转基因的主要方法 在当今众多的植物基因转化技术中 最为可靠和有效的方法之一是农杆菌ti质粒介导的外源基因转化系统 这是一个本来就存在于自然界的 天然 的基因工程系统 随着人们对其机理的揭示 使人们得以利用其进行植物的定向转化 把有益基因转入植物 成为可能 概述 1 1植物冠瘿瘤 植物的一种癌症 1 1冠瘿瘤 植物与人一样 可以产生各种各样的瘤和癌 其中一类瘤被叫作瘿 瘿的种类很多 引起瘿的因素有 受伤 昆虫 病毒 细菌和特定的基因组织表达等 人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤 1 1 1冠瘿瘤的起因由根癌农杆菌 agrobacteriumtumefaciens 属根瘤菌科 rhizobiaceat 对植物的侵染而引起 1 1 2冠瘿瘤的侵染过程细菌通过伤口进入植物 在基因水平上转化植物 细菌dna中的编码基因在植物细胞中表达 刺激植物细胞不受控制的分裂 形成瘤 冠瘿瘤 上 电镜下的根癌农杆菌下 冠瘿瘤 1 1 3冠瘿瘤的一般生物学特性 45 杀死侵染植物的根癌农杆菌 植物组织仍然能形成癌 把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上 能够无限止的分裂和生长 1 根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有一个叫作ti tumor inducing 的质粒 tiplasmid 2 根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质 类植物激素和冠瘿碱 类植物激素使细胞大量扩增 出现冠瘿瘤 冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸 包括胭脂碱 章鱼碱等 冠瘿碱是根癌农杆菌生活的c n和能量来源 1 2ti质粒 1 2 1ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质 为双股共价闭合环状dna分子 其分子量为95 156 106d 约有200kb 最近有人发现农杆菌中还有其它的质粒 称之为隐秘质粒 稳秘质粒的功能还不清楚 有的认为可能是缺陷型的ti质粒 迄今已从多种植物中分离出不同种类的根癌农杆菌 1 2ti质粒 1 2 2ti质粒的物理图谱物理图谱 限制性内切酶酶切片段在ti dna上的排列顺序 ti物理图谱构建 经限制性内切酶处理之后的ti质粒dna 用琼脂糖凝胶电泳作片段分离 便可显示出有20多条大小不同的dna酶切片段 然后将这些酶切片段进行分子杂交分析 测定顺序 再排列成完整的物理图 1 2ti质粒 1 2 3ti质粒的基因图谱基因图谱 基因在ti dna上的排列顺序 基因图谱构建 转座子标签法利用细菌的转座子 transposon 使ti质粒发生嵌入突变和缺失突变 细菌转座子带有各种抗菌素抗性的基因 在转化过程中它们可嵌入ti质粒 使根癌农杆菌带有相应的抗菌素抗性 因而可方便地筛选出转座子嵌入ti质粒突变体 由于在转座子嵌入处的编码基因发生失活 因而可通过分析ti质粒限制性内切酶片段的变化 如某些片段消失或电泳迁移率改变 确定这些基因插入位置 并且与突变体的表型相对应 从而建立ti质粒的基因图 目前已建立了十多个ti质粒的基因图 其中主要是章鱼碱型和胭脂碱型两大类的ti质粒基因图 1 2ti质粒 ti质粒的基因图谱不同的ti质粒有二个同源区 vir区 转化所必须 是毒性区 也叫毒性基因或vir基因或致病基因 t dna transformingdna t dna是ti质粒的转化植物的dna 故称t dna 在转化植物细胞二倍体基因组中含有一个或几个 至多 t dna拷贝 noc是编码细菌利用胭脂碱的基因 1 2ti质粒 1 2 4ti质粒的基因位点及其功能区域 1 t dna区 transferred dnaregions t dna是农杆菌侵染植物细胞时 从ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段dna 故称之为转移dna 该dna片段上的基因与肿瘤的形成有关 2 vir区 virulenceregion 该区段上的基因能激活t dna转移 使农杆菌表现出毒性 故称之为毒性区 t dna区与vir区在质粒dna上彼此相邻 合起来约占ti质粒dna的三分之一 1 2ti质粒 3 con区 regionsencodingconjugations 该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因 tra 调控ti质粒在农杆菌之间的转移 冠瘿碱能激活tra基因 诱导ti质粒转移 因此称之为接合转移编码区 4 ori区 originofreplication 该区段基因调控ti质粒的自我复制起始 1 3t dna 1 3 1结构 胭脂碱型的t dna是15kb长的dna连续片段 占ti的7 15 两边有23bp的定向重复序列 章鱼碱型的t dna区分为两部分 左区 tl dna 为13kb的单拷贝序列 是诱发和维持肿瘤所必需的 右区 tr dna 为7kb的多拷贝序列 t dna通常较完整的且序列不改变地被整合到植物基因组中 1 3t dna 1 3 2t dna携带的遗传信息 1 致瘤基因 用于转化植物细胞的基因 使植物不受控制地繁殖 致癌基因 onc基因 2 冠瘿碱合成酶及其分解基因 使植物细胞合成某种冠瘿氨基酸的基因 如nos 编码胭脂碱合酶的基因 和ocs 编码章鱼碱合酶的基因 1 3t dna 1 3 3ti质粒来自细菌 原核 系统 为何其基因能在真核生物中表达 证据1 由t dna产生mrna均是典型的植物mrna分子 可通过植物rna聚合酶ii被转录 并具有5 帽子结构和3 polya尾巴 证据2 nos ocs等基因的5 末端具有真核特有的tata box和caat box 结论 t dna的基因序列只能被真核生物识别 不能被原核生物识别 由此说明这些基因可以在真核细胞中表达 且只能在转化到真核细胞后表达 1 4vir区的基因结构与功能 1 4 1vir的位置 位于ti质粒上t dna的左侧 两者之间的距离常随ti质粒类型不同而有差异 章鱼碱型的距离较大 而胭脂碱型的间隔距离很小 1 4 2vir的基因结构 章鱼碱型ti的vir区 40kb 含8个操纵子 24个基因 vira 1 b 11 c 2 d 4 e 2 f 1 g 1 h 2 pinf 它们协同调节 形成一个调控子 共同起作用 胭脂碱型有7个操纵子 1 4vir区的基因结构与功能 1 4 3vir的基因功能 1 细菌附着到植物受伤细胞上 2 vir基因产物加工t dna形成单股dna片段 3 t 股 tstrand 被转入植物细胞 整合到寄主基因组中 4 t dna基因被表达 使植物细胞增殖并产生冠瘤碱 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 1 5 1vir基因的诱导1 5 2vira和virg被结构性表达1 5 3t dna的加工及转移1 5 4t dna链整合植物基因组 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 1 5 1vir基因的诱导细菌处于易感受伤植物附近 受伤植物产生酚类物质 如烟草组织产生的乙酰丁香酮 诱导ti中vir基因的表达 章鱼碱型 ocs ti质粒具有8个vir操纵子 vira virb irc vird vire virf virg virh胭脂碱型 nop 有7个vir操纵子 vira virb virc vird vire virg tzs 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 1 5 2vira和virg被结构性表达 1 vira基因产物vira蛋白 是细菌细胞膜上的疏水蛋白 是植物酚类物质如乙酰丁香酮的受体 2 vira蛋白与酚类物质结合 导致virg基因产物virg蛋白的磷酸化 virg蛋白是个转录活化因子 其磷酸化形成一个dna结合蛋白 能与其它vir基因的启动子中的专一的12bp的序列结合 开启它们 因此 磷酸化把virg蛋白从非活性状态转变成活性状态 1 5 2vira和virg结构性表达 酚类 激活 vira 膜上疏水蛋白 virg virg p 不表达的基因 vir活化 开始表达 转录因子与专一的12bp序列结合 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 1 5 3t dna的加工及转移 1 农杆菌附着到植物细胞后 只留在细胞间隙中 t dna首先在细菌中被加工 剪切 复制 然后转入植物细胞 并非整个ti质粒都进入植物细胞 2 vir基因操纵子系统被活化 vird 编码vird1和vird2两种蛋白 一起决定内切酶活性 表达 在边界重复序列的特定位点形成切点 产生单链断裂 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 3 t dna的复制首先是在下链 或称底链bottomstrand 25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间缺口剪切 然后从缺口3 端开始合成新的dna链 并一直延伸到左边界第22碱基处 置换出原来的下链 形成ssdna 即t链 t dna的复制 vird蛋白的作用 1 保护5 端不被5 核酸酶攻击 2 t dna进入植物细胞核的向导vire蛋白的作用 编码ssdna结合蛋白 与单链t dna结合 包被t链成核蛋白丝 便于运转 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 4 t链复合物通过细胞膜的转运穿膜通常需要在蛋白质n 未端有一信号肽 信号肽可帮助跨越细菌内膜 im 完成后特异肽酶切除信号肽 转运停止 t链复合物运转的活性物质可能是virb蛋白 virb蛋白 按功能可将virb蛋白分为5类 r 在内膜上或内膜内的某些蛋白 可能作为t复合体的受体 a 可能作为能源 作为一种atp酶促使t复合体被泵出细菌细胞 virb11可能是这种 a 类蛋白 c 起形成通道的作用 virb4可能是一种 c 蛋白 virb4是一种富集蛋白 无疏水区 无信号肽 可能在t链转运中起一种结构作用 形成至少一部分特殊的通道结构 s 载体蛋白 起运载t复合体穿过通道的作用 这类蛋白可能与所有的膜成分 内膜及周质 有关 p 位于外膜上 可能作为结合植物细胞膜的一种受体 t复合体经virb通道输出示意图 p 细胞结合蛋白 s t复合体运载蛋白 c 通道蛋白 a atp酶 r t复合体受体 vird2 核定位信号 vire2 保证t复合物在进入膜孔时不受干扰 引自vogel等 1992 1 5农杆菌ti质粒基因转化机理 1 5 4t dna链整合植物基因组 在靶dna上形成一个缺刻 由于部分解旋 5 3 外切酶消化形成缺口 单链t dna靠近缺口 由于两链存在短的dna互补顺序 于是退火形成异质双链 t dna末端与靶dna连接 靶dna链的互补链产生缺刻 以游离的3 dna末端为引物 修复合成第二条t dna链 2 2植物基因工程载体种类 1 目的基因克隆载体 目的基因克隆载体与微生物基因工程类同 通常是由多拷贝的e coli小质粒为载体 其功能是保存和克隆目的基因 2 中间克隆载体 中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入t dna片段及目的基因 标记基因等构建而成 它是构建中间表达载体的基础质粒 2 2植物基因工程载体种类 3 中间表达载体 中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体 其功能是作为构建转化载体的质粒 4 卸甲载体 卸甲载体是解除武装的ti质粒或ri质粒 其功能是作为构建转化载体的受体质粒 5 植物基因转化载体 植物基因转化载体是最后用于目的基因导入植物细胞的载体 故亦称工程载体 它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成 根据它的结构特点又可分为两种转化载体 即一元载体系统和双元载体系统 2 2植物基因工程载体种类 2 3 1卸甲载体 卸甲载体 切除t dna上的onc基因 致瘤基因 即 解除 其 武装 的ti载体 在这种载体中 已缺失的t dna部分被e coli的一种常用