耐硒微生物的分离和耐硒能力测定.doc

学号：071040214本科毕业论文 题 目: 耐硒微生物的分离和耐硒能力测定 姓 名： 梅 运 新 班 级： 0710402 专 业： 生 物 工 程 指导教师： 周 毅 峰 副教授 中国恩施二O一四年五月Student ID： 071040214BACHELORS THESIS OF HUBEI UNIVERSITY FOR NATIONALTIESDetermination of resistance to microbial screening selenium and selenium tolerance ability Name： Yun-xin MeiGrade： 0710402Profession：Biological engineeringTutor：Coprof. Yi-Feng Zhou EnshiChinaMay , 2014学术声明本人郑重声明:1、 本人所呈交的学士学位论文是在指导老师的指导下独立进行试验取得的成果。2、 论文中凡是引用他人已经发表的成果、数据、观点等，均已注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果，对本文研究成果做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。3、 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 日期: 导师审核声明本人郑重声明：该生所呈交的学位论文，是在本人的指导下独立进行研究工作所取得的成果。其中文字、图、表及其它相关内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。 指导老师签名: 日期: 耐硒微生物的分离和耐硒能力测定梅运新 (湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施，445000，)摘要：本研究是在富硒区分离出耐硒的微生物，并寻找高耐硒微生物。实验材料取自世界硒都湖北恩施双河鱼塘坝，利用平板稀释法（Se浓度200mg/L）分离出耐硒细菌，并进一步采用浓度梯度加硒（Se浓度为0mg/L到1000mg/L的范围内设置了11个浓度梯度）来进行耐硒能力的测定。结果：初步分离出了22个细菌菌株，其中有7组细菌菌株耐硒，8株菌种较耐硒，7株菌种不耐硒。关键词：硒；耐硒微生物；耐硒能力School of biological science and technologyYun-xin Mei(College of biological science and technology, Hubei Institute for Nationalities，Enshi, 445000, ） Abstract: This study is separated selenium tolerance microorganisms in the area rich in selenium, and looking for high resistance to microbial. The experimental materials from the world of Hubei Enshi Shuanghe selenium pond dam, using plate dilution method (Se concentration 200mg/L) isolated from selenium resistant bacteria, and further by concentration gradient of selenium (Se concentration was 0mg/L to 1000mg/L range is made up of 11 concentration gradient) for determination of selenium tolerance ability. Results: the preliminary isolated 22 strains of bacteria, including 7 groups of bacteria resistant strains of selenium, 8 strains were resistant to selenium, 7 strains resistant to Se.Keywords: Selenium; selenium resistant organisms; selenium tolerance ability目录前言11.1硒的生物学功能和研究意义11.2富硒微生物的研究概况21.2.1硒的分布21.2.2研究背景21.3硒的检测方法研究41.3.1样品处理方法41.3.2硒的测定的研究41.4选题的目的和意义5实验材料和方法62.1样本采集62.2实验试剂和仪器62.2.1主要试剂62.2.2主要仪器62.3培养基配置62.4平板制备72.5硒酸钠溶液的配置72.6实验用具灭菌72.7实验方法72.7.1菌种分离纯化及形态鉴定7结果分析93.1菌种纯化与形态鉴定93.2耐硒能力鉴定10结果讨论与展望12参考文献14致谢161前言1.1硒的生物学功能和研究意义硒(Selenium，Se)是一种人体必需的不可缺少的微量元素，是由瑞典化学家Berzelius1817年在硫酸厂的铅室底部的红色粉状物物质中发现1。美国科学家通过一系列实验证明了硒是谷胱甘肽酶的辅助因子，该因子还可以和一些维生素结合，起到抗氧化的作用2,这一成功的发现使人们逐步的意识到了硒的重要性，随后多国科学家也都对硒做了非常深入的广泛研究，而硒在生物学功能这一领域的研究为主，都取得了显著的成果，因此硒成为了科学研究中的热门元素之一；硒有着抗癌、保护生物体的膜结构、抗氧化作用、能够增强人体免疫力、有拮抗有害重金属的作用、能够调节维生素的吸收与利用、调节蛋白质的合成表达、硒更是肌肉的组织功能的重要成分和硒能够增强生殖功能等许多对人体非常重要的生物学功能，这也使硒元素的生理功能及生物学作用越来越突出，以至于硒有着“抗癌之王、心脏守护神的称号3。由此看出：硒在人和动物体内具有着不可替代的至关重要的作用，同时把有毒性的无机硒转化为毒性较低的有机硒是补硒的关键4。硒的具体生物学功能如下：1) 抗氧化作用。抗氧化作能而防止细胞膜损伤，来达到防止器官老化与病变，延缓衰老，增强免疫，抵御疾病，抵抗有毒害重金属，减轻放化疗副作用，防癌抗癌的作业硒的抗氧化性主要是通过硒酶起作用，如含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PG-SH-Px)5。GSH-Px是使氧化物失活，PGSH-Px是通过磷脂氢过氧化物反应的方式来抑制膜磷脂的过氧化6。2) 提高人体免疫功能。免疫力的提高有利于帮助肿瘤患者尽快康复，硒能保护白细胞和巨噬细胞等免疫细胞，增强免疫细胞对细菌的杀伤能力；也能刺激IgG、IgM等免疫球蛋白的生成7，从而增强机体的抗病能力，同时预防肿瘤的转移与复发，另外，长期适量的服用硒对人体不会产生任何的副作用，可以连续使用。补硒可减少恶心、呕吐、肠胃功能紊乱，食欲减退、严重脱发等放化疗时的毒副反应8。3) 解毒和排毒。硒能降低重金属毒性，是重金属的天然解毒剂。比如硒与三价As和二价Hg有很强的亲和力，可以在体内共价结合形成金属硒蛋白复合物，从而减低三价As和二价Hg的毒性;4) 预防癌症。硒能够阻止正常细胞转变为癌细胞且能抑制癌细胞的生长或对癌细胞具有杀伤作用是其能防治癌症的主要原因，所以适当补充硒可以降低多种癌症的发生几率9。5) 防治糖尿病。以硒为活性成分的谷胱甘肽过氧化物酶能防止胰岛细胞氧化而被破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状。另外还能防止心脑血管疾病、克山病、大骨节病和关节炎等疾病10。1.2富硒微生物的研究概况1.2.1硒的分布硒在地壳中的含量比较少，含量约千万分子七左右，主要分布在石油中、煤炭中、土壤中，由于地球上土壤和水中的硒分布不均，而使得植物体内的硒存在着比较大的区域性差异，这不仅导致同一地区同一自然条件下的硒含量不同，而且同一植物体内的硒含量在不同的器官都有着比较大的差异，主要分布在根茎叶及生长旺盛的部分器官中，且豆科类植物中的硒含量也明显高于蔬菜水果中的硒11。在动物组织器官中，硒元素是不可缺少的组成部分，其中肌肉和肾脏是硒元素主要的聚集地。动物体内的硒大多数都与蛋白质结合以硒蛋白的形式存在，其中还有一部分的硒与酶结合而形成了硒酶。1.2.2研究背景1）硒的研究背景：有着“世界硒都”之称的恩施市境内的硒矿和含硒石煤资源丰富，主要富集在二叠纪含硅碳质页岩中，且富含硒、钒、钼等元素。双河渔塘坝硒矿床位于恩施市东南部73公里处，是一个重要的独立硒矿床，是由队湖北省地质矿产局从1993至19943月探索的；该矿床的发现，填补了在世界上没有独立的硒矿床的空白；双河硒矿床的核心区，长6公里，宽1.5公里，面积0.88平方公里，平均3637.5mg/kg硒，证明硒金属具有工业开采价值的工业纯硒为45.699吨，在该矿床硒含量为6300mg /公斤岩石被发现12，是最大含量硒岩石的11倍，改写了“硒不能形成一个独立的工业矿床”的学术论点，恩施市双河渔塘坝硒矿成为到目前为止“世界罕见的唯一的独立硒矿床位于工业”13。硒在工业领域应用广泛，工业硒广泛用于陶瓷、颜料、光学、太阳能、蓄电池、化工、饲料、保健品、生物肥料、生物制药、化妆品等十几个行业，被称为工业产业的维生素。恩施地区以富硒土壤、硒矿泉水、含硒丰富的动植物资源在一起形成的天然富硒生物圈，生物圈中的植物、动物和微生物的硒含量明显高于那些世界其他地区的同一物种。2009年中科院地理科学与资源研究所对恩施富硒岩石和土壤、作物的调查，证实了恩施境内暴露十米厚煤层的含硒（含Se碳质页岩）暴露是引起土壤地层分布区的主要因素，导致恩施地区的粮食作物，牧草和饲料，牲畜和家禽产品，草药的硒含量的10倍以上该国其他地区的数十倍，这样形成了独特的天然富硒生物圈的14。硒元素具有两重性，即它的营养性和毒性，这二者之间似乎存在着矛盾性，事实上，它的营养性和毒性并不冲突15。硒作为一种营养元素，无论在人体内还是存在于动物体内，其实都是有一定范围的，低于最低的硒浓度，就是说缺硒会导致一系列疾病的发生，如肿瘤癌症、克山病、大骨节病、心血管病、糖尿病、肝病、前列腺病、心脏病、癌症等疾病16；但不是硒越多就越对人体有益，相反超出这个浓度范围，就会导致硒中毒。因此硒对于人体的影响还是巨大的，所以如何补硒也逐渐进入人们的视野。但补充过量的硒又会造成硒中毒，补充的量和时间决定了硒中毒是急性还是慢性。所以在如此富集硒的恩施地区，经过长时间的自然选择，耐硒的微生物相对缺硒地区可谓种类繁多，并且恩施地区的硒浓度的高水平造就了高耐硒微生物，从而为本实验的研究提供了材料基础和可行性的依据。2）耐硒微生物的研究背景：微量元素硒能激发人体免疫球蛋白及抗体的产生，保护细胞膜、染色体和核糖核酸等生物大分子的结构与功能17；若机体细胞长期处于缺硒状态而不补充硒，则与硒相关的代谢就会被阻从而导致某些疾病的发生；随着人类对硒生理功能认识水平的提高，人体补硒已成为防治肿瘤及保健的措旋。目前，国际上微生物代谢硒的研究广泛且活跃，研究工作主要集中在以下3个方面：1)一些具有还原硒作用的细菌可形红色纳米硒球，它是很好的生物纳米材料，对于生物补硒高效且低毒，且在其他的新材料利用方面还处于摸索阶段18。2)硒代谢的分子机制研究，主要集中在硒还原和硒甲基化方面，但调控硒还原的相关基因和酶还未发现；硒氧化方面，还属于空白阶段19。3)环境中微生物转化硒的作用和硒污染环境的微生物修复。国内的研究主要集中于硒在土壤中的行为和植物富硒、硒有关的纳米材料，而在硒的细菌代谢机制方面(包括土壤中的作用机制)极为缺乏6。由于富硒微生物的硒转化研究得到了人们的重视，在研究上已经取得长足发展。另外富硒酵母、富硒乳酸菌和富硒食用菌（包括富硒蕈菌类、富硒金针菇、富硒平菇、富硒香菇、富硒猴头菇、富硒木耳、富硒灵芝）的研究都有一定的进展20。其中富硒酵母的研究是取得一定的进展，用紫外线的最佳照射时间为8 min，亚硝酸的最佳作用时间为14 min，经过紫外和亚硝酸的复合诱变后，筛选出的高产菌株的菌体生物量为121 g/L，硒含量为832 g/g;其中更是将生物量和硒含量最高的组合筛选出来了，硒添加量20 g/mL、培养时间40 h、接种量12、装液量60 mL/250 mL（此条件下的生物量为1895 g/L，硒含量为：993 g/g）3。1.3硒的检测方法研究1.3.1样品处理方法原料样品取自恩施双河的土壤，取1.0g土壤，在超净工作台上加到有50ml无菌水的无菌三角瓶中，混合均匀，并用封口膜封好，放置到恒温震荡培养箱中，在37，120r/min条件下培养24h，然后在无菌条件下进行平板分离，再进行单菌落的分离和保存以及耐硒能力的筛选。在37，130r/min条件下培养24小时，分离菌体，烘干至恒重，消化处理（0.1g干菌体，5ml浓盐酸，在功率为500W下微波消解30min），将消化之后的液体转移至酸泡过的20ml的烧杯中，70下恒温蒸干至有白色粉末析出，再用5%的盐酸定容至25ml21 。 1.3.2硒的测定的研究原子荧光分光光度计检测Se的原理：在酸性条件下，高价态的被测元素（如：硒、砷等）与还原剂( 一般为硼氢化钾或钠) 生成砷化氢，由载气( 氩气) 带入石英原子化器，受热分解为原子态Se，在特制Se空心阴极灯的照射下，基态硒原子被激发至高能态，再去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光22，在一定的浓度范围内，其荧光强度与砷含量成正比，与标准系列比较定量23。仪器法：全自动注射原子荧光光度计（AFS-930d，北京吉天仪器有限公司）。标准硒溶液的配制：硼氢化钾溶液：称取15.0g硼氢化钾，溶于氢氧化钾溶液(0.5%)中，然后定容至1000mL；载液：5%盐酸溶液；氩气：纯度为99.99%；水：为三重蒸馏水。开启仪器后设定好仪器最佳条件，设置炉温,稳定30min后开始测量。连续用硒标准溶液的1号管进样, 待读数稳定之后,转入标准系列测定,绘制标准曲线。在转入样品测定之前,再进入空白值测量状态,用样品空白消化液进样,让仪器取其均值作为扣底的空白值。随后即可依次测定样品。每次测不同的样品前用载液清洗进样器；，由标准曲线可得样液的硒质量浓度，再对所测结果进行分析24 。1.4选题的目的和意义缺硒会引起一系列疾病的发生，更会降低人体免疫力，还会大几率的引发癌症，因此研究如何补硒就成为了人们关注的热门话题；直接补充无机硒是可以提高人体的硒含量，但是毒性大，吸收率又低，因此不能被应用到生活中但是，所以寻找一种安全高效的补硒途径又是值得我们高度关注，因此补硒时把有机硒视为最安全有效的手段。目前有机硒的获得包括微生物转化法、植物转化法、和动物转化法等。微生物转化法中较多的是利用酵母和乳酸菌，而利用其他微生物进行富硒未见报道25。而耐硒微生物转化的有机硒不仅安全高效，而且可以将有毒性无机硒转化为对人体有益的有机硒，因此现阶段，利用生物转化来工业化生产是人体补硒剂是最有希望的途径之一3。本研究主要是在硒矿床的淤泥中分离耐硒微生物(主要是细菌)做为研究材料，获得15株生物量和硒含量高的细菌菌株，培养条件的优化和硒浓度梯度的建立来确定菌株生长和耐硒能力强的最佳条件，来达到将无机硒高效转化为有机硒的目的，从而为生物补硒提供更加可行的依据。本实验主要筛选的是耐硒的细菌，主要由以下优点：1、生长条件要求不是很高，需氧量很低，由于样本采集自水下淤泥，更是有一部分为厌氧硒菌；2、生长速度快，在接种2小时后，生物量就有明显的增长，且培养基中出现被还原的纳米红色硒；3、突变率高，经过连续的高硒培养，我们发现，细菌的耐硒能有有一定的提高，4、还原硒的能力比较高，经培养24小时后，出现红色纳米硒沉淀非常多，整个额培养液成红色。这为以后的耐硒基因的研究和硒代谢的分子机制的研究提供了良好的实验基础和依据。2实验材料和方法2.1样本采集在湖北省恩施州双河地区采取土壤样本，用无菌的试剂瓶冷藏保存。2.2实验试剂和仪器2.2.1主要试剂：琼脂粉（上海伊卡生物技术有限公司）、氯化钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）、TRYPTONE LP0042、牛肉浸膏（国药集团化学试剂有限公司）、亚硒酸钠（分析纯、西亚试剂有限公司）、无水乙醇、碘液、结晶紫溶液、中性红溶液。2.2.2主要仪器：水平层流双人净化工作台（ HS-1300u型，苏州净化设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9420 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；西门子冰箱；美的电磁炉；微波炉；pH计（METTLER TOLEDO，梅特勒-托利多仪器有限公司）；电子天平（ ME204E/02，托利多仪器有限公司）；台式高速离心机 （5424 ，eppendorf）、紫外分光光度计 （TCH901型，北京普析通用仪器有限公司）；优谱超纯水机；生化培养箱 （SPX-1505H-II，上海新苗医疗器械制造有限公司）；全温振荡器 （HZQ-QG，中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，移液枪（eppendorf）、光学显微镜等。2.3培养基配置固体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基标准称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂粉20g，先将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入1000ml搪瓷缸中，加入约700ml蒸馏水，用电磁炉加热至沸腾，停止加热，加入琼脂粉，再次加热至沸腾2min，用蒸馏水定容到1000ml，待培养基冷却至60-70时，用pH计调节pH至7.026，再分装到25根干净的试管中和30个250ml的三角瓶中，每根试管大约15ml培养基，每个三角瓶准确装取16ml培养基。液体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基标准称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g，先将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入1000ml搪瓷缸中，加入约700ml蒸馏水，用电磁炉加热至沸腾2min，用蒸馏水定容到1000ml，待培养基冷却至60-70时，用pH计调节pH至7.027，分装至250ml三角瓶中，每瓶20ml培养基2.4平板制备将灭菌过的含有16ml牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶，在微波炉中加热至融化，在灭过菌的水平层流双人净化工作台上在融化的培养基中加入灭过菌的4ml的Se浓度为1000mg/l的亚硒酸钠溶液，迅速混合均匀后，倒入灭菌好的平板内，冷却至培养基凝固备用，此时培养基的Se浓度为200mg/L。2.5硒酸钠溶液的配置标准称取亚硒酸钠粉末10.95g用无菌水定容至1000ml，即得Se浓度为5g/L的亚硒酸钠溶液，分装到250ml三角瓶中，封口膜封好，121摄氏度高温灭菌30min，备用。用移液枪（eppendorf）取5g/L的Se的亚硒酸钠母液2ml，定容到10ml即得Se浓度为1000mg/l的亚硒酸钠溶液，分装到250ml三角瓶中，封口膜封好，121高温灭菌30min，备用。250ml三角瓶中，每个三角瓶中20ml培养基，封口膜封好。 2.6实验用具灭菌：将上述配置好的培养基（试管和三角瓶）、两种浓度的亚硒酸钠溶液、装有50ml的无菌水的三角瓶、1ml的移液器枪头、用报纸包好的涂布棒和干净的培养皿若干一起在手提式高压蒸汽灭菌锅121灭菌30min，其中试管中的培养基需要倒置斜面。水平层流双人净化工作台风速为中速紫外灭菌15min,。2.7实验方法2.7.1菌种分离纯化及形态鉴定原料样品取自恩施双河富硒淤泥，取1.0g淤泥，在超净工作台上加到有50ml无菌水的无菌三角瓶中，混合均匀，并用封口膜封好，放置到恒温震荡培养箱中，在37，120r/min条件下培养24h，得到细菌悬浮母液。用无菌移液器分别取用无菌水稀释1000倍的100ul细菌母液于5个无菌平板上，用无菌涂布棒涂均匀，在生化培养箱中37培养12h。在培养好的每个平板上挑取单菌落，再次进行平板（50mg/mlSe浓度）划线纯化，生化培养箱中37培养12h，进一步得到单菌落，共得到22株菌种，然后转接到试管斜面在生化培养箱中37培养12h后冷藏保存，共得到22株菌种，现保存于湖北民族学院湖北省生物资源保护与利用重点实验室。革兰氏染色：281）涂片固定；2）草酸铵结晶紫染1分钟；3）自来水冲洗；4）加碘液覆盖涂面染约1分钟；5）水洗，用吸水纸吸去水分；6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；7）中性红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗，干燥，镜检。2.7.2各菌种耐硒能力测定菌种活化与种子液配制在已经紫外灭菌15min水平层流双人净化工作台上将斜面保存每株菌种分别接种到已经灭菌好的含有20ml液体培养基的三角瓶中，在全温振荡器中37，转速130r/min,培养24h，在水平层流双人净化工作台上，将已经培养好的细菌母液用移液器转移到比色皿中，使用紫外分光光度计在600nm波长下，进行OD值的测定，并用无菌的液体培养基调整其OD值为0.8。接种设计在水平层流双人净化工作台上按表1进行接种，每个实验组做3个平行组，接种完成后在全温振荡器中37、130r/min条件下培养24h。表1. 接种设计Table1.Inoculation of design实验组别 液体培养基Se含量（mg/L）需加调整后的细菌母液体积(l)需加5g/L亚硒酸钠母液体积（ml）需加无菌水体积（ml）102000521002000.54.532002001.04.043002001.53.554002002.03.065002002.52.576002003.02.087002003.51.598002004.01.0109002004.50.51110002005.00.0耐硒菌生长情况测定经过24h培养的菌液，使用紫外分光光度计在600nm波长下，进行OD值的测定。2.7.3数据处理22组菌种的耐硒能力测定结果的原始数据，通过SPSS软件进行数据的方差分析和t值检验，进行平行组的平均值的矫正。3结果分析3.1菌种纯化与形态鉴定初筛得到22株菌种，图1为其中两个单菌落菌株，并通过平板划线法进一步纯化得到22株单菌落，图2为其中一株菌种的划线平板。通过革兰氏染色和镜检，22株菌种有18株是革兰氏阳性菌，4株为革兰氏阴性菌，镜检的细菌形态都是杆菌，见表2。15图1.初筛单菌落图Fig 1 .Screening single colony diagram图2.分离纯化单菌落图Fig 2. Purified single colony isolation表2. 菌种形态和革兰氏染色结果Table2.Results bacterial morphology and Gram staining菌种革兰氏染色结果细菌形态菌种革兰氏染色结果细菌形态M1G+杆菌M12G+杆菌M2G+杆菌M13G+杆菌M3G+杆菌M14G+杆菌M4G+杆菌M15G+杆菌M5G+杆菌M16G-杆菌M6G+杆菌M17G-杆菌M7G+杆菌M18G-杆菌M8G+杆菌M19G-杆菌M9G+杆菌M20G-杆菌M10G+杆菌M21G+杆菌M11G+杆菌M22G+杆菌小结：22株菌种全部为杆菌，其中有18株为革兰氏阳性菌，4株为革兰氏阴性菌。3.2耐硒能力鉴定其中耐硒菌种有M2、M4、M5、M6、M8、M10和M19，见图3；图3 耐硒菌种生长比较Fig. 3 Comparison of selenium resistant bacteria growth其中M2菌种的波动比较大，但是其OD值还是有一个略微的上升趋势，故而该菌种是有耐硒能力的；M4、M8、M10三株菌种的趋势是比较接近的，但是OD值的总体水平还是在2.0以上，故而耐硒能力也是毋庸置疑的；M20菌种在300mg/L浓度时出现了一个峰值，为3.1895，而在800mg/L浓度时OD值有明显的下降为700mg/L时的一半不到，且在900、1000mg/L时稳定在相同的低水平，说明该菌种的最佳耐Se浓度为300mg/L；在相同的M5菌种是在300mg/L浓度时带到最高的峰值；M5菌种也是类似的情况，在100mg/L浓度时带到最高的峰值，说明该菌种是一个在Se低水平下，生物量最高的菌种，但不排除低水平硒对该菌种生长的积极影响。而较耐硒的菌种（见图2）有：M3、M7、M9、M12、M13、M18、M20和M22八组菌种，这八组菌种的OD值相对比较稳定，而平均水平都接近于2，相对于不耐硒菌种还是比较高的水平，所以这八组是较耐硒的菌种。图4 较耐硒菌种生长比较Fig. 4High selenium species comparison不耐硒菌种（见图3）有：M1、M11、M14、M15、M16、M17和M21七组菌种，这七组菌种基本在100mg/L浓度时有着明显的下降趋势，且在后面也是有着一定的下降趋势，而OD值基本维持在1.5以下，说明这7组菌种是不耐受硒的菌种。图5 不耐硒菌种生长比较Fig. 5 Not resistant to se growth comparison4结果讨论与展望湖北恩施被誉为“世界硒都”，本实验从恩施富硒区富硒淤泥中筛选一系列耐硒细菌，综合本实验的实验结果，23株菌种有15株已经有较好的耐硒能力，但需要进一步做菌种的分类鉴定和在高硒条件下的菌种的硒含量的测定，从而进一步对耐硒相关基因做出研究和硒代谢分子机制的研究，这些菌种的筛选丰富了利用微生物进行生物富硒的研究基础，为硒资源的开发和利用提供了微生物的研究基本材料。微生物硒的代谢机制还没能完全阐明，故将来的工作重点可以放在以下几点：一是发掘各种参与硒代谢的微生物资源。本实验的耐硒细菌主要是还原硒，形成红色纳米硒，而硒氧化细菌的研究的发掘还几乎是空白，而硒的还原、甲基化等途径的发掘也是有一定的空间。二是研究硒代谢途径的具体途径和分子机制。从亚硒酸盐到红色单质纳米硒的关键调控基因和关键酶还没有找到，亚硒酸盐的还原如果在细胞内进行，那亚硒酸盐是通过何种转运途径进入细胞的，纳米硒又是通过何种途径如何转运出细胞的，这两个问题一直是研究的空白。三是利用细菌合成硒纳米材料，虽然这方面研究颇多，但仍然是生物材料研究和应用的一个热点领域，而且应用前景非常广泛。5参考文献1缪正秋.补硒：慢性肝病远期疗效的辅助性治疗措施J.世界感染杂志, 2005,(4)：287-288.2Rotruck J T，Pope A L，Ganther H E，et a1Selenium biochemical role as acomponent ofglutathione peroxidaseJScience1973，179：5885903李嫒嫒.硒酵母高产菌株的筛选及发酵条件研究D.山西大学,2013-06.4秦秦,阎向东,吴绪敏.有机硒富硒麦芽与无机硒亚硝酸钠的毒性比较J卫生毒 理学杂志,1988,(03) .5刘华山.番茄和生菜的施硒效应和积硒特性D.扬州大学,2009-06.6郑世学.硒是双刃剑?谈微生物中的硒代谢N华中农业大学学报,2013-9, 32(5).7彭成卓,汪开毓,金明昌.微量元素硒对动物免疫功能的影响J.饲料博览，2006, (04)：18-21.8陈默,程先平.硒对肿瘤化疗患者心脏毒性的保护作用J.安徽医药,2010,(05)：605-606.9姜培珍.硒重金属的天然解毒剂J.中老年保健,2010,(03):53.10丛建民.人体内硒的生物学功能J.生物学教学, 2008,(06):9-12.11伊永亮,马亚兵.微量元素硒与疾病的关系DB/OL.http:/max. /html/2013/0828/4646227.shtm,2013-08-28.12郑翔,钱汉东,吴雪枚.湖北恩施双河硒矿床地球化学特征及成因探讨M.高校地质学报,2006年,12(1):83-92.13余凌云.“世界硒都”恩施的硒资源DB/OL .http:/w