实验8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架讲解材料

实验8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架讲解材料 实验88考马斯亮蓝染色显示细胞骨架 1、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤； 2、观察微丝在细胞中的分布。 一、实验目的2019/10/171?细胞骨架的概念为真核细胞胞质中的蛋白质构成的纤维系统，在细胞的形态维持、细胞的运动、物质运输和细胞分裂中发挥重要作用。 三种组成成分微丝、微管、中等纤维?非肌细胞中的微丝是动态结构，肌动蛋白单体（G G-actin）与纤维（F F-actin）在一定条件下互相转化。 本实验中M M-缓冲液提供的离子条件可使F F-actin稳定。 二、实验原理2019/10/172中等纤维微管微丝2019/10/173 二、实验原理?考马斯亮蓝R250(Coomassie blueR250)是一种蛋白质染料，不能特异地显示细胞骨架蛋白。 用含非离子型去垢剂TritonX-100的缓冲液处理细胞，可将细胞的膜结构和部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保留，用考马斯亮蓝R250染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构，其主要成分为直径40nm左右的微丝束。 ?观察时可能会发现细胞膜上有些孔洞，甚至有些细胞变空了，这可能是由于Triton XX-100处理时间过久破坏细胞结构所致。 2019/10/174显示细胞骨架成分的特异性方法 11、特异性的药物结合反应如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝 22、免疫细胞化学方法制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架2019/10/176免疫荧光染色左微丝，中微管，右中等纤维2019/10/177 三、实验用品复式显微镜（带油浸物镜）擦镜纸（lens paper）；记号笔；小片滤纸；载玻片；盖玻片；剪刀；镊子；洋葱鳞茎1%TritonX-100；M缓冲液；3%戊二醛；pH6.8磷酸缓冲液；0.2%考马斯亮蓝R-250染色液2019/10/178 四、实验步骤1用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约1cm见方。 置于pH6.8的磷酸缓冲液中，使其下沉（每人做2片，不要太大，否则不易展开）。 2吸弃磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理20mins。 对照组使用M缓冲液处理。 3M缓冲液洗5mins X3times43%戊二醛固定30min（或Carnoy固定液）5磷酸缓冲液洗5mins X3times。 60.2%考马斯亮蓝染色30mins，蒸馏水冲液洗一次，5分钟。 然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上，加盖玻片，显微镜下观察。 2019/10/179?洋葱表皮细胞（200倍） 五、实验结果2019/10/1710?洋葱表皮细胞（400倍） 五、实验结果2019/10/1711?洋葱表皮细胞（对照组，100倍） 五、实验结果2019/10/1712 五、实验结果2019/10/1713 六、实验报告1.简单画出所观察到的图像（包括对照）的并分析。 2.用1%的Triton X-100处理细胞的作用是什么？3.M缓冲液的作用是什么？2019/10/1714注意事项?洋葱鳞茎内表皮不必剪得过大，否则很难平整地铺开在载玻片上，而是部分重叠着，影响观察效果。 ?另外，在用高倍镜观察之前要盖上盖玻片，如果载玻片上较干，最好先滴上一滴水后再盖盖玻片，以免造成很多气泡，影响观察效果。 ?染色时间不宜过长，否则会染色过甚反而观察效果不佳。 ?用11%Tri