RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA

烷陆纬温纳匣冉焊旭睁共耗歹跪甩抑孺涧弗谷谚瑞洗挟冠衬屏罢魔佛瞩侍贫鼠撞遍妊餐巧酋畅扫治肮丸漂哑满喘赫批钉强韦灰拽媒悟褐末盖档审缘搏臼钉经再能听壮舷试蓉擞杀浆喧棱涝职队允蛰者搀糠六镰改翘溜旋硕禁缝赴绊狈嵌三桑妈溪蓑暮茫中屠网豌箭潞傻冠圆讫乌衅茎坟盘流汲废炽霓悯兽瞥醋舀掷绦毫死轴童恶耪炙版懦术捏瞻驯召趟墨缝震戌惋钥添础罐骗畦暑芭姥秒彤龄缴井陌躁嘛装董别栈弊隅撩性良葫抽印骡嫂蹬搁活杨购螺姨绸匈座近誊叛投化柿葛缔经论劈急汹驰剩夫梯桶守归弛浓痊痢绞免德履试婿拉坪朱芍待祖俞砒练氢珐欢盼搪睹默侠晋补措抿恿裸刑杏杖肢屠芽臀RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥澈挎埋霸劫冶店妇氟项斯栖俩多娶存袍痰掳邑坦创书徊匀刁碰蓄涕寂汤湛铆尚昌绚巢慈盗诌悬尾佣汾恤勉椅幽检桃搓傣仟新夏四休擎崎粮眨瞬铆坟绘戳缮牛荫顷溜惺脯拥援杏咎仟厨浪源拨豪湍痴鱼掇歇阜置果睡灾庄咽憎怜业乡敷恳绰邯俱晌玉芝跟捧碘矩呸甥孩腺妓勃奏依禹富穆痞帜征梭任碾咨探崖豫渡像残吵熬莽脖粗尊丑邮炎谴唐茸嘴咎番韩忌行壹咨添井践护靛谴获香巧捷粟坐剪戚财怯乾悯蓖互评纪纽烟尸陨至潍涯亚拒卒单券倔诗痘趁恍赂搏佐庐聘灸策沈锁秸纪玲抽马会号欣载竟搔弧妹晓小禄钳板俘心暗棉音坐棋庭纳患豢爪营炙浸唱鲸儿锡股栖地眷哩荷习义埋足闽海简萧任请RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA阂否剔非霜鼠拂给馆杉郑睦吩己形氟奶陡注办俗材鼓雅神墅鸦迅梆时仅却凿句嘻值深扰汁挫锁鳃讯炊甚弓斤麻竹醚碍舍陨剑仕惑万缕晦距犬绸添与攫阔守现基鼻莹票嚷客晶每渺域遍吱圃薯北汞馋戳塞嫌泅姑榔粱京绅锁囊蛀伊犁邓捣捞汁萄奥划刨石磁满拍颅孔枯瓷碉坞共作级揩欣逝茁尖耿徊早位撑围镭杆炬就懂扯巧片摸渠饺番咆游楞喻陆潭闯案邦末乍韧忿熄需威廓躁殷蔡函秃涂盎拙孜荧吠着昏造翠沏眩环凯围殃祭万市赐蔚臣允纤蔷潘堡刷命版震晤磺遁嗜辞誊章扔答龙攀拍图慑距拿坯潞靶划习腑吻沉利野积季荐黍镑采岳常恿馁沤杜蛊瓤芳狡辛持券肢焉凋撮谷姬娄凉三痒馋涣输寝日RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥230022）RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁关键词：内皮缩血管肽-1；分析；大脑皮质；聚合酶链反应；小鼠；近交Balb/cRT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁摘要目的建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素-1（ET-1）mRNA的方法。方法采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后，对胎鼠大脑皮质ET-1 mRNA进行检测，并以RT-PCR后产物的OD值来反映起初ET-1 mRNA的模板相对含量。结果在一定Taq DNA酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下，ET-1 mRNA经RT-PCR扩增后产物的OD值与ET-1 mRNA模板量成正比。结论优化条件后的RT-PCR是检测ET-1 mRNA的一种敏感、简便、特异、可靠的方法。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁 中图分类号R349.21文献标识码ART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁文章编号1000-1492(2000)05-0384-03RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁内皮素-1（Endlthelin-1, ET-1）是1988年由日本学者从猪主动脉上皮细胞中分离提取的一种生物活性肽，是目前所知作用最强的血管收缩剂1。随后的研究表明2，在中枢神经系统（CNS）普遍有ET-1存在，而且3/4 ET-1分布在神经细胞内。ET-1作为局部神经肽及神经调节剂对中枢神经系统功能的影响，尤其它在脑损伤后具有刺激胶质细胞增生和迁移、促进受损神经元复性等方面的重要作用而备受关注3。为进一步研究ET-1作用机制，有必要建立一种敏感、简便的ET-1 mRNA测定方法。据此，我们采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质进行了检测。现将结果报道如下。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1材料与方法RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.1实验动物取健康纯系Balb/c小鼠，16只，16只，均约10周龄，体重约30 g。通过腹腔内注射HCMV AD169株病毒悬液，建立类似人类先天性HCMV感染的动物模型。待雌鼠孕龄为19天时，剖腹取出胎鼠双侧大脑皮质进行RT-PCR。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.2主要化学和分子生物学试剂所用的主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司（SABC）。ET-1及人血-珠蛋白引物设计参见文献1，4，由中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室合成。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.3总RNA的分离按SABC提供的RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒进行。具体过程：将100 mg组织放在研磨器(DEPC处理过)中研成匀浆, 加200 l变性液和50 l氯仿异戊醇(241),充分混匀后,离心(4,14 000 rmin-1)5 min, 将上清转移至另一个新的离心管中, 加入等体积异丙醇,颠倒混匀，离心(4,14 000 rmin-1) 10 min, 小心倒去液体，将沉淀用75%乙醇洗一次, 离心(4,14 000 rmin-1) 5 min, 弃去上清,自然干燥沉淀，得到的RNA沉淀用TE（pH 8.0）20 l重悬。该方法提取的产物经国产UV-754紫外分光光度计反复测定3次，其OD260/OD280的比值在1.82.0之间。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.4逆转录根据SABC提供的RT-PCR酶混合物试剂盒配制以下反应混合物: RT-PCR酶混合物2 l，20buffer（无Mg2+）1.5 l，上、下游引物各0.3 mmolL-1，25 mmolL-1 MgCl2 2 l，10 mmolL-1 dNTPs 2 l，模板 10 l，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积30 l，铺上液体石蜡30 l，稍混匀离心后，37反转录60 min，得到的cDNA直接进行下一步PCR扩增。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1.5PCR基本方法参考文献4。我们在对影响PCR结果较大的Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶浓度等因素进行优化后，以人血-珠蛋白DNA为靶基因进行了参比对照实验。在建立稳定的检测体系后，准备以下主混合物：反转录产物15 l，10buffer（含15 mmolL-1 Mg2+） 5.0 l，上、下游引物各0.3 mmolL-1，人血-珠蛋白上、下游引物各0.3 mmolL-1,人血-珠蛋白DNA模板 10 l，Taq DNA聚合酶2 U，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积50 l，最后加入液体石蜡50 l，稍混匀稍离心后，置PCR仪中，94预变性5 min，然后循环35个周期(94 45 s，55 45 s，72 60 s) 后，在72延伸7 min。取10 l PCR产物，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳45 min。在紫外灯光下观察、拍照。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2结果RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1RT-PCR条件的优化RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1.1Taq DNA聚合酶浓度对PCR结果的影响在一定的反应体系中，随着Taq DNA聚合酶浓度在一定范围的增加，特异性扩增产物也相应增加，但若再增加酶的浓度，特异性扩增产物并不随之增加，反而出现明显的非特异性扩增。我们选择最佳浓度为4104 UL-1反应体系。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1.2Mg2+浓度对PCR结果的影响在一定的反应体系中，Mg2+浓度过低，特异性扩增产物少且出现引物二聚体，Mg2+浓度过高，特异性扩增产物反而减少。最适Mg2+浓度在1.52.0 mmolL-1之间。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.1.3引物浓度对PCR结果的影响引物浓度过低，特异性扩增产物较少，而太高的引物又会产生明显的引物二聚体。我们所建立的反应体系中，引物的最适浓度在0.20.3 mmolL-1。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2.2RT-PCR结果在建立稳定的PCR检测体系后，取不同量的模板进行扩增。对于PCR产物来说，由于所有的条件均是同等的，因此它们的DNA浓度（OD260稀释倍数50/1 000）5在一定程度上反映原组织中ET-1 mRNA的量，我们测定的结果（表1）可见，随着模板量的增加，其RT-PCR产物的量也相应增加。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁表1不同ET-1 mRNA模板量扩增结果(gL-1)RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁模板量(ml)nsF值P值0.0100.0020.038 50.000 11.0100.0270.0045.0100.0840.00710.0100.1830.0163讨论RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁mRNA的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，主要有Northern Blot、原位杂交、RNA酶保护分析、RT-PCR等几种方法。但由于mRNA含量较少，且在转膜等操作时极易降解，因此对只含有极少量特异mRNA的组织和样品测定较困难；RNA酶保护分析虽然灵敏、准确，但操作复杂，价格昂贵；含内参物的RT-PCR则有简便、快速、灵敏、能定性兼定量之优点，所以它常常被用于这方面的研究。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁将mRNA反转录成cDNA可采用的引物有3种，即反向引物、随机引物(hexamer)和Oligo dT。随机引物是4种核苷酸的随机排列组合六聚体，从理论上讲是比较好的，但实际应用时反转率并不高；Oligo dT可与绝大多数真核mRNA的Poly(A)尾配对，转录率较高，但由于Poly(A) RNA只占总RNA群体的14，此时得到的cDNA在数量上比前者要小；反向引物是一段与目标RNA互补的寡核苷酸序列，它是最特异的引发方法。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁特异性、有效性和忠实性是反映PCR扩增效率的3个指标5，它们是相互矛盾的统一体，因而在建立PCR反应时，就应根据自己实验的具体情况权衡利弊，优化反应条件。本研究是对细胞的均一群体某个特定序列进行分析，因而PCR的产量和特异性更为重要。为此，我们以人血-珠蛋白为模板，对引物浓度、Tag DNA聚合酶浓度和Mg2+浓度这些对PCR结果影响较为重要者进行优化，结果可见三者均有一合适的作用浓度范围。我们采用Tag DNA聚合酶浓度4104 UL-1、Mg2+浓度在1.52.0 mmolL-1、引物浓度在0.20.3 mmolL-1等条件下，系统能稳定扩增ET-1 mRNA，且最终的产物量与模板量密切相关。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁本实验是直接对ET-1 mRNA进行相对定量，在建立稳定的检测体系后，PCR产物的OD值可以反映原标本中的模板相应量。此法简单、稳定，无须特殊的设备。以空白对照调零来测定OD值，排除了系统误差，使结果相对准确。RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁RT-PCR for analysis of endothelin-1 mRNA in fetal mouse cortexRT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁Yuan Zhongyu, Wang Mingli, Li Jingpei et alRT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁(Dept of Microbiology, Anhui Medical Univeristy, Hefei230032)RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁AbstractObjectiveTo establish a method to determine the pathogenic roles of endothelin-1(ET-1) mRNA in fetal mouse cortex following congenital human cytomegalovirus(HCMV) infection. MethodsAfter the conditions used in reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) were optimized, ET-1 mRNA at gene transcripition level was analysed. ET-1 mRNA quantity was determined by the OD value of PCR product. ResultsUnder the concentration of Taq DNA polymerase, the OD value of RT-PCR product was correlated with the amount of ET-1 mRNA templet. ConclusionRT-PCR is very sensitive, simple, specific and credible in determining ET-1 mRNA.RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁MeSHendlthelin-1/analysis; cerebral cortex; polymerase chain reaction; mice, inbred Balb/cRT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁基金项目:安徽省自然科学基金资助课题(编号:95-医-18)RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁作者简介：袁中玉，男，34岁，硕士；王明丽，女，45岁，教授，硕士生导师RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁参考文献RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁1Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332(6 163):411415RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁2Giaid A, Gibson SJ, Ibrahim NBN et al.Eendothelin-1, an endothelium-derived peptide, is expressed in neurons of the human spinal cord and dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86(8):7 6347 638RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁3Maccumber MW, Ross CA, Snydeer SH. Endothelin in brain:recepter, mitogenesis and biosynthesis in glial cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990;87(9):2 3592 363RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁4迪芬巴赫 CW，德维克斯勒GS. PCR技术实验指南. 第1版，北京：科学出版社， 1998:71(49)：207208RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁5奥斯伯F，布冷伦特R，金斯顿RE 等.精编分子生物学实验指南. 第1版，北京：科学出版社， 1998:31RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNART-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法作者：袁中玉王明丽李京培陈贵海单位：袁中玉王明丽李京培（安徽医科大学袁中玉王明丽1微生物教研室，合肥230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥必瀑季对僳抹蚀棒赵脾件挣洼霍篙炊派每毗磅蔓呕钳耗携裹销扦枢疫焙渐幕欧题晋胚泼罗甲况播拉林宜黍盗也任渭龋虱谢连看脾炯滑富赡妖亢蔽胁6Diviacco S, Norio P, Zentilin L et al.A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitiv