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植物线虫真菌防治的研究进展（华南农业大学资源环境学院07植保检测，广州，510642）摘要植物线虫侵袭和寄生引起很多植物病害，每年给农林业生产造成的损失十分巨大，食线虫真菌是植物线虫生物防治中极其有用的生物资源。本文就生防真菌资源研究、食线虫真菌分子作用机制研究、生物防治现状、杀线虫毒素研究以及线虫生防中需要解决的生态学问题等5个方面的研究进展作介绍。关键词植物线虫；生物防治；食线虫真菌植物线虫侵袭和寄生引起很多植物病害，受害植物可因侵入线虫吸收体内营养而影响正常的生长发育；线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形，使农产品减产和质量下降。在人类对线虫的防治中，常用的方法有轮作防病、化学防治、生物防治和抗病育种等1。作物轮作防病被广泛应用，但它不适应于寄主范围较宽的根结线虫的防治。利用抗病品种是最经济的方法，但目前搞病品种很少而且存在很大的局限性。化学防治一直是目前采取的主要防治对策，但是用农药防治线虫随之而产生的诸多弊端逐渐受到重视；与此同时，生防制剂的开发也就成为了解决问题的研究新思路。食线虫真菌是线虫的真菌天敌，是指寄生、捕捉、定殖、毒杀线虫的一大类真菌。利用食线虫真菌防治线虫是线虫生物防治的重心，围绕这一重心和目的，科研工作者们已取得了极大的进展，但是也面临着一些迫切需要解决的问题2。下面就这些问题来逐个探讨。1 生防真菌资源食线虫真菌主要包括捕食线虫真菌，内寄生真菌，产毒素杀线虫真菌和定殖于固着性线虫、卵、雌虫、胞囊的机会病原真菌4大类。目前，全世界报道的食线虫真菌种类400多种，中国报道的种类200多种3。对食线虫真菌全面系统地进行研究的是云南大学张克勤研究团队和中国科学院微生物研究所刘杏忠研究团队，两团队报道了我国食线虫真菌及其相关真菌的绝大多数物种，发表新种30多个。专著食线虫菌物分类学，中国真菌志节丛孢及相关属真实反映了我国在食线虫真菌资源研究方面的概况和水平4。这些资源是生物防治的基础，为植物线虫生防制剂的研发提供了极其珍贵的资源储备。2 植物线虫生防现状1888年德国科学家Zopf开始认识到菌网具有捕食线虫的习性，正式揭开了捕食线虫的研究历史。以捕食线虫真菌作为线虫生防因子始于1978年法国的Cayrol等成功地应用粗状节丛孢防治双孢蘑菇菌丝线虫，使蘑菇产量比未施用该菌物的对照提高25%，并制成了商品制剂Royal 300。20世纪80年代初，在菲律宾用淡紫拟青霉，商品名为Biocon，防治马铃薯根结线虫取得了较好防效。法国De leij等1992年用厚垣孢轮枝菌防治温室番茄根结线虫，效果达90%，该菌能在番茄土壤中增殖，并存活至少123d。将该菌与化学药剂（aldicarb）混合使用，效果可达98%，而化学药剂对菌剂没有影响。刘杏忠等2001年在美国筛选出洛氏被毛孢，经培养后施入土壤，在温室自然条件下对大豆孢囊线虫防效达90%以上6。3 分子生物学技术在线虫生物防治中的应用食线虫真菌侵染寄主线虫的大概过程是：首先粘附到寄主体表，接着穿透体壁，最后侵入和消化体内组织细胞而获得营养。但至今我们对这一侵染过程的分子机制尚缺乏足够的认识，由于线虫体表和消化道表面覆盖一层有弹性的非细胞结构的天然屏障角质膜，胶原蛋白是构成线虫角质膜的一种主要结构蛋白，而且线虫体壁主要由蛋白质组成，溶胶原的丝氨酸蛋白酶能有效地降解线虫体壁，破坏角质膜的完整性，有利于真菌穿透侵染，因此胞外蛋白酶成为研究的焦点7。瑞典Lund大学的Ahman等率先开展真菌侵染线虫相关酶的研究，从捕食线虫真菌少孢节丛孢中克隆了首个真菌降解线虫体壁的胞外蛋白酶基因PII，PII编码的蛋白酶活性能被苯甲磺酰氟抑制剂所抑制，表明其活性中心有丝氨酸残基，在蛋白酶分类上属于丝氨酸蛋白酶，该酶是少孢节丛孢侵染线虫的主要蛋白酶之一，当然，还有其它类型的酶参与了侵染过程。除了丝氨酸类蛋白酶外，Veenhuis等以A.oligospora和Panagrellus redivivus为模式系统进行超微结构研究和细胞化学研究，证明了A.oligospora能产生过氧化氢酶等氧化还原酶8。分子生物学的飞速发展极有可能为线虫生防开创新途径。近几年来我国很多植物线虫专家对线虫相关酶进行研究，并克隆、表达了一批侵染性丝氨酸蛋白酶基因和几丁质酶基因。目前他们正在从结构生物学和生物信息学的角度进行侵染性蛋白酶晶体结构解析及功能区分析。在食线虫真菌中有一类真菌以菌丝特化形成的各种捕食器捕食线虫，对捕食器进行分子水平的研究对于解析微生物与其宿主间的相互关系和微生物结构的分子调控有重要意义。但到目前为止，国内外尚未报道一个有关捕食器形成的相关基因，因此在这条路上还没有人取得阶段性进展。4 杀线虫毒素的研究因为在实际应用中土壤生物和非生物因素对活体生防真菌有较大影响，由此激发人们努力探索微生物次生代谢产物来防治线虫。食线虫产毒菌物是指能够生毒素毒害线虫的一类菌物，食线虫产毒菌物的代谢产物十分丰富，从50多株菌中分离到90多种对线虫有活性的化合物，其结构类型多样。在这一领域最出色的是德国Anke及其学生所作的贡献。他们研究了50多株食线虫真菌，从中获得具有毒杀线虫的活性代谢产物96个。Stalder等人从子囊菌中分离到30多个化合物，并多数为新化合物，其中鉴定了24个对线虫有活性的物质。Anke等人检发现属于18个属的29株子囊菌产生杀线虫毒素。Stadler等用水琼脂平板测定方法检测了202株担子菌对C.elegans活性发现17株有活性。这些有活性的菌株大部分分布在侧耳属和猴头菌属。Mayer等从奥尔类脐菇（Omphalotusolearius） 分离到一个商业利用前景的次级代谢物环十二缩肽omphalotin A。它对南方根结线虫的活性最大，18h后半致死量为0.75ppm，1h后半致死量为2ppm，比商业杀线剂啊维菌素活性更高9。5 线虫生物防治面临的生态学问题在线虫生防中的有一个严重、至今无法完美解决的问题是在实验室试验和温室试验防效极高的生防菌在大田中的防效却偏低和不稳定。经过研究，人们发现很多环境下的土壤对生防菌存在严重的土壤抑菌作用，在严重抑菌土壤中，生防菌的萌发率低于10%，这是制约土传病虫害生防的瓶颈。在线虫生防中，孙漫红等测定了东北10多份土壤对线虫生防菌的土壤抑菌作用。莫明和等系统地对土壤抑菌作用问题进行了研究。测定了来自全国26个省市2 010份土壤样品对9种真菌生防菌（Paecilomyces lilacinus、Pochonia chlamydosporia、Lecanicillium psalliotae、Beauveria bassiana、Clonostachys rosea、Trichoderma viride、T.harzianum、T.koningii、T.hamatum）的抑菌作用。结果显示：中国农业土壤对真菌生防菌的抑菌作用普遍存在，所有供试土样对供试真菌都表现出不同程度的抑菌作用，对孢子萌发的平均抑制率22.8%97.5%之间，对菌丝生长的平均抑制率在17.3%75.6%之间。经过他们系统分析，发现以下5大细菌类群：Alcaligenaceae、Bacillales、Micrococcaceae、Rhizobiaceae Xanthomonadaceae通过分泌挥发性物质参与土壤抑菌作用。利用GC/MS分析了土壤抑菌参与土壤抑菌作用的挥发性物质，通过验证，确定出11种参与土壤抑菌作用的细菌挥发性物质。从强抑菌作用土壤中分离获得抑菌力最强的菌株Bacillius sp.H6，发现其抑菌作用机理是通过产生抑菌蛋白阻止真菌的繁殖通过上述研究，对土壤抑菌真菌孢子萌发和菌丝生长机制进行了诠释：在土壤生态系统中，经过长期的适应性进化，每一特定的土壤环境中形成了相对稳定的生物区系，这些生物间形成了相互依赖和相互制约的复杂关系，而生物分泌的代谢产物是维系这种关系的主要调控因子10。对真菌生防菌而言，土壤抑菌作用将使其在土壤中长时间处于休眠状态，很难在土壤中生长和定殖，进而影响生防制剂的防效及其稳定性11。6 讨论与展望当前，虽然生物防治线虫已取得很大进展，但是由于也存在不少问题，所以尽管化学防治中所采用的农药带来了一系列环境和社会问题，但仍然是防治线虫的主要措施。生物防治虽然有着取代部分化学农药的趋势和前景，但目前研究进展还是过于缓慢，很多问题未能很好地解决，例如剂型的改进，菌剂的工业化生产方法，菌剂的保存方法，菌剂的施用技术，菌剂在土壤中的定殖能力和种群动态监控能力，生防菌的退化问题等。再者我国现在就生防农药这块的生产标准和审定标准几乎处于空白水平，为促进我国生防农药的发展，政府应当从政策、法规的角度去规范和作出支持。主要参考文献：1利用食线虫真菌防治植物寄生线虫 莫明和，牟贵平中图分类号Q959.174 文献标志码A2韩生成，刘清利，孟颂东，等.植物寄生线虫分子生物学和抗线虫基因工程策略的研究进展J. 农业生物技术学报3张克勤，莫明和. 中国真菌志节丛孢及相关属M.北京：科学出版社，2006：1-157.4李天飞，张克勤，刘杏忠.食线虫菌物分类学M. 北京：中国科学技术出版社，2000：1-313.5孙漫红，刘杏忠，唐霖. 土壤抑菌作用对食线虫真菌及其制剂的影响J. 菌物系统，1997，16（2）：149-154.6Linqian Dong，Jinkui Yang，Keqin Zhang. Cloning and phylogenetic analysis of the chitinase gene from the facultative pathogen Paecilomyces lilacinusJ. J Appl Microbiol，2007，103：2476-2488. 7林超，孙辉，王瑞宾，等. 菌寄生真菌的研究进展J.菌物研究，2005 ，3（1）：46- 52.8ZhiFang Li，ChangSong Zou，YueQiu He，et al. Phylogenetic analysis on the bacteria producing non-volatile fungistatic substancesJ. J Microbiol，2008，46（3）：250-256.9Lei Li，Minghe Mo，Qing Qu，et al. Compounds inhibitoryto nematophagous fungi produced by Bacillus sp. Strain H6 isolated from fungistatic soilJ. Eur J Plant Pathol，2007，117：329-340.10adler M，Sterner O，Anke H. New nematicidal and antimicrobial metabolites from the basidiomycete Cheimonophyllum candidissimum（Berk & Curt.）Sing. I.Producing organism. Fermentation. Isolatio