微生物检验微生物学检验概述.doc

第九章微生物学检验概述本章考点：1.临床微生物学检验的目的与要求2.标本采集与运送3.微生物学检查4.血清学诊断5.临床微生物实验室安全措施和质量保证6.动物试验7.免疫检测技术8.发光分析技术9.鲎试验10.分子生物学在病原微生物中的应用临床微生物工作的第一步就是要正确、规范地采集和运送标本，然后根据微生物学检验的特点和临床要求进行初步诊断和确定诊断。（结合临床作出病原学诊断）临床细菌实验室的主要工作是从临床标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，同时指导临床合理应用药物，为临床诊断、治疗、预后和流行病学调查以及医院内感染的监控提供可靠的依据。 一、临床微生物学检验的目的和要求（一）临床微生物学检验的目的1.为临床感染性疾病的诊断提供病原学依据。2.为临床感染性疾病的治疗提供参考用药的信息。3.为医院感染提供病原微生物及其耐药性动态信息。4.改进或更新临床微生物学检验的方法。（二）临床微生物学检验的要求1.快速、准确地提出检验报告。2.检验人员必须有较丰富的微生物学基础知识和熟练、正确的操作技能，必须养成有菌观点和无菌操作的习惯。3.临床微生物学检验必须进行全面质量控制，并参加和接受质量控制考核。4.重视实验室消毒灭菌工作。（三）诊断试验的选择原则1.选择有鉴定价值的试验：要对两种细菌进行鉴定，须选择一项两种菌呈现绝然不同结果的试验，即一种菌呈现阳性（阳性反应的菌株阳性率须大于90），另一种菌为阴性（阴性反应的菌株阳性率应小于10），这项试验才有鉴定价值。否则，就没有鉴定价值。2.选择简易、快速、方便的试验：鉴定一种细菌可能有多种特异的方法，没有必要逐一进行试验，只选择其中一或两种达到目的即可，多选无意义。选择操作简便、快速的方法。选用复合培养基，一次操作可同时看几个生化反应，如克氏双糖铁（KIA），动力靛基质脲酶（MIU）等。3.综合考虑试验的敏感性和特异性：试验敏感性越高，假阴性结果就越少。特异性越高，假阳性结果越少。试验的敏感性和特异性是相互联系的，试验的敏感性增加，会使特异性下降，反之亦然。二、标本的采集和运送标本质量的好坏直接影响诊断结果的正误，不当的标本可导致假阴性、假阳性结果的出现，因此在标本采集、送检、保存等各个环节都要规范操作，严格控制，是确保实验结果准确可靠的前提。（一）标本采集的一般原则1.早期采集：采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时，而且必须在使用抗生素或其他抗菌药物之前采集。2.无菌采集：采集的标本应无外源性污染。在采集血液、脑脊液、胸腔积液、关节液等无菌标本时，应注意对局部及周围皮肤的消毒，严格进行无菌操作；对于与外界相通的腔道，如窦道标本应由窦道底部取活组织检查，而不应从窦道口取标本，以免受皮肤表面正常菌群的污染，造成混淆和误诊；对于从正常菌群寄生部位（如口腔）采集的标本，应明确检查的目的菌，在进行分离培养时，采用特殊选择性培养基。采集的标本均应盛于无菌容器内，盛标本的容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或用一次性无菌容器，而不能用消毒剂或酸类处理。3.根据目的菌的特性用不同的方法采集：厌氧菌、需氧或兼性厌氧菌，以及L型菌采用的方法不同。4.采集适量标本：采集量不应过少，而且要有代表性，同时有些标本还要注意在不同时间采集不同部位标本。5.安全采集：采集标本时不仅要防止皮肤和黏膜正常菌群对标本的污染。同时也要注意安全，防止传播和自身感染。（二）标本的处理一些对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检，而其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室。若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存，如尸检组织、支气管洗液、心包液、痰、尿等标本应保存在4环境中。脑脊液、滑膜液等则要在25保存。一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器送。三、微生物学检查临床微生物学实验室接到标本后应立即进行微生物学检验。主要包括直接镜检、检测特异性抗原或病原体成分、进行分离培养和鉴定、体外药敏试验等，各种检查方法的比较见表5-9-1。表5-9-1微生物学检查方法、判断和速度方法鉴定类型速度直接镜检初步诊断510min免疫荧光（直接法）快速诊断12h乳胶凝集快速诊断1530min对流免疫电泳快速诊断2h气-液相色谱鉴定1.52hDNA探针快速诊断、鉴定13天PCR快速诊断数小时微量鉴定系统鉴定36h常规法确定诊断数天或以上（一）直接镜检1.初步诊断；2.指导进一步检出步骤和鉴定方法的选择；3.评价标本的质量。（二）快速诊断快速检测病原体成分主要是指特异性抗原和核酸检测。特异性抗原检测包括免疫荧光技术、胶乳凝集试验、酶免疫技术、对流免疫电泳、化学发光免疫测定等。（免疫学检验技术）核酸检测包括核酸探针杂交、PCR技术。（分子生物学检验技术）其他快速检测法还有气-液相色谱法、化学发光、生物发光测定法和基因或蛋白微型阵列芯片技术等。（三）直接药敏试验鉴定结果快，但结果不明确，故分离出纯培养物后应再作体外药物敏感试验。（四）常规检验1.分离培养：通常由正常无菌部位采取的标本接种血平板，置于空气或含510CO2的气缸中培养，大部分细菌可于2448h生长良好。若原始培养为阴性，但据镜检结果和临床信息提示可能有病原菌存在，则应再采集大量标本，离心浓缩或溶解离心法处理，取沉淀接种营养丰富的需氧或厌氧培养基来培养。对于存在正常菌群部位采集的标本，分离时应采用选择培养基以利于病原菌生长，也可加某些抗生素抑制污染菌的生长。对于某些感染标本中发现的细菌，如尿路感染的尿液中检出大肠埃希菌，可能是病原菌，也可能是污染菌或正常菌群，其临床意义的确定有赖于定量培养法。2.鉴定：分离出的细菌一般应经过细菌形态、菌落特点、生化反应、血清学试验、动物接种等鉴定。目前尚有某些微量鉴定系统，其鉴定快速、简便，值得推广。如用于鉴定肠杆菌科的20E，鉴定非发酵菌的20NE及鉴定厌氧菌的20A等。3.体外纯菌药物敏感性试验：常用方法包括抑菌试验、杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌产生的抗生素灭活酶等。（五）报告直接镜检要求2h报告，说明标本是否合格，发现微生物情况和特点；初步鉴定和直接药敏结果于24h或次晨报告，报告可能的病原菌和直接药敏结果；最后鉴定和细菌药敏结果一般不超过3天，还规定除血培养外，所有送检标本必须在24h内预报。四、其他检测技术（一）免疫检测技术微生物学中常用的免疫检测技术包括凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、免疫荧光技术、酶免疫测定及皮肤反应等。（二）发光分析技术发光分析技术是依赖酶或化学反应释放能量引起发光物质（如鲁米诺、荧光素等）发光的检测方法。具有操作简便、快速、敏感度高、无污染特点。根据发光原理，主要分为生物及化学发光两种方法。（三）鲎试验（检测内毒素）鲎变形细胞溶解物试验简称鲎试验。其基本原理是内毒素在碱性金属离子存在下激活鲎试剂中凝固酶原转变为凝固酶，凝固酶使存在于鲎试剂中的凝固蛋白原生成凝固蛋白，产生凝胶。凝胶的形成速度及其坚固程度与内毒素浓度有关。鲎试验阳性表明有革兰染色阴性菌或内毒素血症，也可用于生物制品或注射液的内毒素污染检测。（四）分子生物学在病原微生物中的应用对生物体的基因组DNA片段及其转录产物进行定性和定量分析，进而对人体状态和疾病作出诊断。基因诊断技术可克服病原微生物的传统检测方法灵敏度低、特异性低及速度慢等不足之处，并可用于流行病学的大量现场筛查工作。第十章细菌形态学检查法本章考点：1.显微镜（1）普通光学显微镜（2）暗视野显微镜（3）相差显微镜（4）荧光显微镜（5）电子显微镜2.不染色细菌标本检查法3.细菌染色标本检查法（1）常用染料（2）常用染色方法细菌的形态学检查包括不染色标本检查法和染色标本检查法，显微镜是观察细菌形态所必备的基本工具。镜检不仅可以迅速了解标本中有无细菌及大致的菌量，而且根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。对某些细菌，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等，通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。一、显微镜在细菌的形态学检查中以光学显微镜为常用，借助显微镜放大至1000倍左右可以观察到细菌的一般形态和结构，至于细菌内部的超微结构，则需经电子显微镜放大数万倍以上才能看清。检查细菌常用的显微镜有以下几种：1.普通光学显微镜：普通光学显微镜通常以自然光或灯光为光源，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25m，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，可将0.25m的微粒放大到0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25m，故用普通光学显微镜均能清楚看到。2.暗视野显微镜：暗视野显微镜是用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，由于暗视野集光器的中央为不透光的遮光板，光线不能直接射入镜筒，故背景视野黑暗无光，而从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，犹如夜空中的明亮星星。明暗反差提高了观察的效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。3.相差显微镜：利用相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的某部分结构比其他部分深暗，衬托出鲜明的对比。本法主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。4.荧光显微镜：荧光显微镜以高压汞灯产生的紫外光或蓝紫光为光源，能激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光素染色后，置于荧光显微镜下，即可激发荧光，因此在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。用于细菌、病毒等的诊断或鉴别。5.电子显微镜：电子显微镜以电子流代替光源，电磁圈代替普通显微镜的光学放大系统，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨lnm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。二、不染色细菌标本的检查细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的方法有压滴法和悬滴法，以普通光学显微镜观察。如用暗视野显微镜或相差显微镜观察，则效果更好。细菌如有动力，可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移；细菌如无动力，受水分子撞击细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。检查厌氧菌的动力要用毛细管法进行检查。除细菌标本外，螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。三、细菌染色标本的检查细菌染色标本在普通光学显微镜下可以观察细菌的形态、大小、排列、染色性、特殊结构（芽胞、荚膜、鞭毛）、异染颗粒等。因为在接近中性的环境中细菌都带有负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故常用碱性苯胺染料如美蓝、结晶紫、碱性复红等染色细菌。（一）常用染料1.碱性染料：电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌的等电点在pH25之间，在碱性、中性、弱酸性的环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的染料有碱性复红、结晶紫、美蓝等。2.酸性染料：电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带有负电荷故不易着色。如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。酸性染料通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。3.复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。（二）常用的染色方法细菌染色的基本程序：涂片（干燥）固定染色（初染媒染脱色复染）。1.单染色法：用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色。细菌经单染色法处理后，可观察其形态、排列、大小及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。2.复染色法：用两种或两种以上的染料染色的方法，称为复染色法或鉴别染色法。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。（1）革兰染色：本法是细菌学中最经典、最常用的染色方法。除粪便、血液等极少数标本外，绝大多数标本在分离培养之前都要进行革兰染色、镜检。意义：鉴别细菌：通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。甚至有时结合细菌特殊形态结构及排列方式，对病原菌可进行初步鉴定。选择药物参考：G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性。与致病性有关： 大多G+菌的致病物质是外毒素，而G-菌大多能产生内毒素，两种致病作用不同。（2）抗酸染色：抗酸染色也可将细菌分为两大类：即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。因为临床上绝大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检查项目，只针对性用于结核病、麻风病等的细菌检查。疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后以油镜检查，即可作出初步鉴定。若查见红色抗酸杆菌，可报告为“找到抗酸分枝杆菌”。对临床疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。3.荧光染色：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。如痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺0法（也称金胺0-罗丹明B