离子色谱测定积雪草中阴离子.doc

离子色谱测定积雪草中阴离子宋茜茜1，叶明德*，李瑞芬2(温州大学化学与材料工程学院，温州，325035)摘要：本文使用离子色谱对积雪草中7种阴离子(F-, Cl-, NO2-, Br-, NO3-, H2PO4-, SO42-)进行了测定。该离子色谱装有model IC SI-90 4E阴离子色谱柱和电导检测器。淋洗液为1.8mmol L-1 Na2CO3和1.7 mmol L-1 NaHCO3，流速为1.0 mL min -1。上述各离子峰面积和浓度做标准曲线，相关性可达到0.99930.9997。仪器对检出限分别为5.125, 4.865, 4.518, 4.906, 4.051, 3.848和5.139。该种方法测得的7中阴离子的RSD 2.39%（n=5），样品加标回收率达到96.8% -102.5%。关键词：离子色谱，积雪草，阴离子前言积雪草也叫雷公根、崩大碗，属于一种伞形花科草本植物，主要分布于泰国和一些亚洲国家1。它主要作为一种治疗伤寒、麻风、肺结核和狼疮的多功能中药已被人们广泛地使用了上百年2-5。同时它也具有提高记忆、抗炎，抗癌、抗氧化和抗焦虑等作用6-12。它含有积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸13-15。国内外对积雪草生物活性组成合药理活性研究已十分详细，但是几乎未出现对积雪草中无机阴离子进行分析的文章。据报道显示，痕量元素是中草药中重要的组成16-18。药物中同一种元素的药效不是根据其总量，而是有其形态决定的19。因此，痕量元素的形态分析是探索药物中药效物质和作用机理的关键因素20。而中草药中无机离子的研究对痕量元素形态分析起着重要作用，所以有无机离子的分析具有非常重要的现实意义。在本实验的研究中，一种快捷的方法用于定量测定积雪草粗提取物中的7中阴离子(F-, Cl-, NO2-, Br-, NO3-, H2PO4-, SO42-)。另外采用不同的萃取方法，并对样品的萃取条件进行了优化。实验仪器和设备NaF, NaCl, NaNO2,NaBr, NaNO3, KH2PO4, Na2SO4 从汕头西陇化学试剂厂（汕头，中国）购得，为分析纯。Na2CO3, NaHCO3从汕头西陇化学试剂厂（汕头，中国）为标准试剂。HNO3和HClO4从上海试剂厂购得 (上海, 中国)，为分析纯。 所用到的水经 Milli-Q 纯化系统处理的超纯水 (Milipore, Bedford, MA, USA)。使用IC 1010离子色谱(TECHCOMP, Shanghai, China)分析。该仪器装有Shodex IC SI-90 4E 阴离子反相柱(showa Denko K.K. Japan)，DZS-4抑制器，高压恒流泵和电导检测器。洗脱液为1.8 mmol L-1 Na2CO3和1.7 mmol L-1 NaHCO3混合溶液，即加入0.191g Na2CO3和0.143g NaHCO3用水稀释至1L容量瓶中制的。样品处理积雪草从温州当地市场上购得，并在室温中保存直至分析。首先用自来水充分洗净，除去杂物和破碎的部分，然后用超纯水洗3次。样品干燥至恒重，研磨后过55目筛。研磨后的粉末储存在室温下一干燥罐中，于阴暗处保存。萃取和消化超声萃取称取0.50g积雪草粉末样品,用水稀释至100mL容量瓶中，超声萃取1h。萃取液过滤，取上清液过0.45m针头过滤器用IC进行分析。沸水提取称取0.50g积雪草粉末样品于烧杯中，加入100mL超纯水，沸水浴1h, 萃取液过滤，取上清液过0.45m针头过滤器用IC进行分析。酸消化提取称取0.50g积雪草粉末样品于50mL烧杯中，加入10mL浓HNO3,4mL H2O2和2.5mL HClO4 ,用玻璃杯搅拌混匀，在电炉上直至溶液缓慢冒棕烟，提高电炉的温度，溶液冒白烟，蒸至近干后取下冷却。在烧杯中加入少量水，过滤，最终完全转移到100mL容量瓶中。将溶液过0.45m针头过滤器用IC进行分析。标准制备称取0.4421g NaF, 0.4944g NaCl, 0.7500g NaNO2, 1.2875g NaBr, 1.3710g NaNO3, 2.1474g KH2PO4, 2.2188g Na2SO4于1L容量瓶中配制成含7种阴离子的混合溶液。标准工作曲线，使用该储备液逐级稀释。结果和讨论色谱分析条件的选择将1.8 mmol L-1 Na2CO3 和 1.7 mmol L-1 NaHCO3混合溶液作为洗脱液，流速为1.0 mL min-1，进样量为50L。用离子色谱（IL）测得7种阴离子F-, Cl-, NO2-, Br-, NO3-, H2PO4-, SO42-结果图1。图中可得，该条件下，该7种阴离子能完全分离，且峰形较好，能用于定量分析。 Fig. 1. Chromatogram of mixed standard solution containing the 7 anions;Peaks: 1=F-, 2=Cl-, 3=NO2-, 4=Br-, 5=NO3-, 6=H2PO4-, 7=SO42-精密度，校准和线性本实验通过五次进混标的标准溶液来测定IC对每种离子的标准偏差。对5个不同浓度的混标和峰面积的关系作曲线来得到7种不同离子的标准曲线，各离子的相关性均优于0.9990。最低检出限（LOD）为3倍空白样品的标准偏差，空白样品重复进样5次。上述结果如表1所示。Table 1. Results of precision test, calibration test and linearity test (n=5)AnionsRSD(%)Regression equationR2LOD(g mL-1)F-2.39Y=3.2796*E-6X+0.02490.99930.0051Cl-1.82Y=5.2336*E-6X+0.03410.99970.0049NO2-2.19Y=8.3911*E-6X+0.05330.99930.0045Br-2.37Y=1.2142*E-5X+0.10340.99920.0049NO3-1.72Y=9.5178*E-6X+0.09690.99970.0040H2PO4-1.85Y=1.9535*E-5X+0.15380.99940.0039SO42-2.43Y=7.0636*E-6X+0.17040.99930.0051样品分析积雪草样品采用不同的萃取方法，即超声萃取、沸水提取、酸消化提取来提取样品中含有的7种阴离子。各种方法得到的阴离子色谱图分别如图2、图3、图4所示。经过该三种提取方法得到的阴离子含量如表格2所示。由色谱图中可见，积雪草中可能不含有NO2-, Br-和NO3-。表格2中可知H2PO4- 和SO42-的浓度通常比F-和Cl-的浓度高。对比不同的提取方法，酸消化所得的F-, Cl-和H2PO4-均低于其它2种方法，但SO42-浓度反而是最高的。这可能是由于在酸消化的过程中出现了许多化学反应，因此沸水提取为最佳的积雪草提取方法。Figs. 2. The inorganic anions in Centella asiatica after ultrasonic extraction;Peaks: 1=F-, 2=Cl-, 3= H2PO4-, 4=SO42-Figs. 3. The inorganic anions in Centella asiatica after boiling water extraction;Peaks: 1=F-, 2=Cl-, 3= H2PO4-, 4=SO42-Figs.4 The inorganic anions in Centella asiatica after acid digestion;Peaks: 1=F-, 2=Cl-, 3= H2PO4-, 4=SO42-Table 2. The contents of seven inorganic anions in Centella asiatica samplesAnionsThe sample byultrasonic extraction (mg g-1)The sample byboiling water Extraction (mg g-1)The sample byacid digestion(mg g-1)F-1.95961.97870.7140Cl-1.16190.96180.2176NO2-Br-NO3-H2PO4-3.70244.42741.3729SO42-3.21593.34487.4323回收率实验通过7种阴离子的加标实验来证实该方法的可行性。加入的标准为高、中、低三种不同的浓度，每个加标实验做三次。最终各离子的加标回收率达到96.8102.5%。结论本文使用带有model IC SI-90 4E阴离子色谱柱和电导检测器的离子色谱检测积雪草中F-, Cl-, NO2-, Br-, NO3-, H2PO4-, SO42-离子。该方法简便，准确，能用于各种草药中无机阴离子的测定。参考文献1Pronprapa W, Michael HG, Arunee A (2010) Food Chemistry 119:69-742Randriamampionona D, Diallo B, Rakotoniriana F, Rabemanantsoa C, Cheuk K, Corbisier AM, Mahillon J, Ratsimamanga S, Jaziri ME (2007) Fitoterapia 78:482-489 3Shukla A, Rasik AM, Jain GK, Shankar R, Kulshrestha DK, Dhawan BN (1999) Journal of Ethnopharmacology 65:1-114Liu M, Dai Y, Yao XJ, Li Y, Luo YB, Xia YF, Gong ZN (2008) International Immunopharmacology 8:1561-15665Cheng L, Guo JS, Luk J (2004) Life Sci 74:2237-22496Babu TD, Kuttan J, Padikkala J (1995) Journal of Ethnopharmacology 48:53-577Cheng CL, Koo MWL (2000) Life Sciences 67:2647-26538Qin LP, Zheng HC, Zhang L (1997) Phytomed 12:154-1579Zainol MK, ABD-Hamid A, Yusof S (2003) Food Chem 81:57558110Zhang T, Lee TZ, Qi SH, Xu YB, Xie JL(2005) Chin J Exp Surg 22:43-4511Chen SW, Wang WJ, Li WJ, Wang R, Li YL, Huang YN, Liang X (2006) Pharmacol Biochem Behav 85:339-34412Gnanapragasam A, Yogeeta S, Subhashini R, Ebenezar KK (2007) Mol Cell Biochem 294:55-63.13Inamdar PK, Yeole RD, Ghogare AB (1996) Chromatogr A 742:127-13014Pan J, Kai GQ, Yuan CX, Jin RS (2007) Chromatographia 66:121123.15Jia GT, Lu XY (2008) Chromatogr A 1193:136-14116Li SX, Deng NS (2003) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32:51-5717ozaka A, Sotyka K, Ostapczukc P, Fijaeka Z (2002)