钙传感蛋白互作激酶CIPK14参和拟南芥盐和ABA胁迫应答调节.docVIP

钙传感蛋白互作激酶CIPK14参和拟南芥盐和ABA胁迫应答调节 中国科学C辑:生命科学xx年第38卷第5期:446457.scichina. life.scichina.446中国科学杂志社SCIENCE INCHINA PRESS钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节秦玉芝,李旭,郭明,邓克勤,林建中,唐冬英,郭新红,刘选明*湖南大学生命科学与技术研究院生物能源与材料研究中心,长沙410082;吉首大学资源与环境科学学院,吉首416000*联系人,E-mail:sw_xmlhnu.:xx-01-07;接受日期:xx-01-24985工程创新平台、湖南省自然科学基金(批准号:05JJ30038)和国家自然科学基金(批准号:30600368)资助项目摘要钙和蛋白激酶在植物胁迫应答过程中起重要作用.本研究以拟南芥蛋白激酶CIPK14的T-DNA插入突变体为材料,系统研究了CIPK14基因在不同组织与生长发育期的表达情况,和CIPK14基因的钙调节属性及其在胁迫应答过程中的作用.研究发现CIPK14基因在拟南芥根、茎、叶、花各组织器官中都有所表达,其中花器官和根部表达量较为显著;不同阶段比较发现CIPK14在幼苗期具有较高的转录水平.研究同时发现,ABA和盐胁迫能激活CIPK14基因的转录;CIPK14T-DNA插入突变体中一系列胁迫应答基因的转录水平全都不同程度地降低或表达滞后,说明CIPK14基因在胁迫应答中起作用.另外,CIPK14突变体的种子萌发和根伸长对各种渗透胁迫敏感,并且ABA合成抑制剂哒草伏(Norflurazon)能部分恢复突变体对ABA,盐等的敏感表型.进一步证明CIPK14是胁迫应答相关基因.研究还发现,CIPK14的转录受到极端浓度下外源钙离子的激活,另外在一定胁迫条件下,突变体中RD29A基因的表达对外源钙离子浓度变化不敏感,说明CIPK14基因功能缺失降低了受钙调节的胁迫相关基因对外源钙的敏感性.相应的表型分析发现,突变体种子萌发和根伸长与野生型相比对外源钙敏感性下降,进一步证明CIPK14基因接受钙信号调节,并作用于拟南芥ABA和盐胁迫应答信号途径,激活胁迫相关转录因子.关键词钙CIPK14ABA盐胁迫应答种子萌发植物在生长过程中,往往通过调节一系列胁迫相关基因在不同时间和空间的表达,来实现其对盐、干旱、洪涝、温度和氧化应激等不同环境胁迫的应答.CIPK类激酶因与CBL蛋白相互作用而得名13.CIPK属于一类新的植物特异性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族,结构与酵母菌的SNF1激酶和动物的AMPK激酶极其相似4,5.由于这种结构的相似性,CIPKs也被纳入植物SNF激酶家族的SnRK3亚族6.拟南芥基因组中包含25个CIPK基因.CIPKs之间不仅蛋白序列存在差异,它们的功能部位和作用底物也不尽相同.但是在CIPKs蛋白的C末端与CBL互作的结构域却相当保守.CIPKs的这种底物特异性和附因子结合特异性预示着CBL-CIPK结合水平上的可调节性.许多钙依赖性信号途径的进程都取决于功能性CBL-CIPK复合体的形成79.研究发现,CBL1和CIPK1的相互作用依赖于微量Ca2+的存在.这种中国科学C辑:生命科学xx年第38卷第5期447CBLs和CIPKs Ca2+依赖性相互作用与动物中普遍存在的钙受体与特异目的蛋白互作模式相似1.据此推断Ca2+离子在植物胁迫应答过程中起作用.盐胁迫和冷胁迫都能导致细胞内Ca2+的积累,进而激活Ca2+传感器SOS3,SOS3可与SOS2/CIPK24互作6,10,11.CIPK3是CIPK15的类似物,它通过NAF结构域与CBL钙受体蛋白结合,并抑制受ABA诱导的基因表达12.由于CBL/CIPK互作和酶活性对钙的依赖性各不相同,因此植物体内CIPK激酶活性的钙依赖性研究得还不够详尽.本研究以拟南芥蛋白激酶CIPK14的T-DNA插入突变体为材料,系统研究了CIPK14在盐和ABA胁迫应答中的调节作用,及其在盐和ABA(abscisic acid)胁迫条件下CIPK14的钙调节属性.同时,为了解CIPKs根据环境变化和生长发育需要进行表达的特异性,对CIPK14基因的表达模式进行了系统分析研究.1材料与方法1.1材料、胁迫处理和种子萌发拟南芥种子用70%的乙醇表面灭菌1min,30%次氯酸钠灭菌10min,然后用无菌水冲洗5次,每次处理后播种约100粒种子.盐、ABA胁迫处理:光照培养3周后的野生型幼苗浸泡于浓度300mmol/L的NaCl或100mol/L的ABA中,分别于0,1,2,4,6h收取材料,材料随后液氮速冻,保存于?80冰箱中备用.不同胁迫下的种子萌发率检测:将经过灭菌的种子播种于含不同浓度试剂的MS培养基13中,4春化4天后于23全日照培养,统计萌发率,连续进行6天.哒草伏(Norflurazon)恢复表型实验:在加MS培养基之前,先将100mol/L哒草伏和一定浓度的渗透剂(0.35mol/L ABA,150mmol/L NaCl,6%葡萄糖和0.25mol/L甘露醇)加入培养皿中,然后倒入预冷的培养基摇匀,同时设置对照.4处理4天后转入连续光照下培养,连续统计6天.结果取3次独立实验的平均值标准误差.1.2CIPK14和胁迫相关基因的RT-PCR分析采用安比奥公司生产的RNA提取试剂盒,提取总RNA;RNase free的离心管中加约2g的总RNA和0.5g Olig(dT)15,混匀,4短暂离心,65水浴7min后,立即冰浴冷却.离心后,依次加入10Buffer2.5L,10mmol/L dNTPs1.25L,RNaseA抑制剂25U,M-MLV逆转录酶200U,加RNase free的水至25L,42反应60min后,70水浴10min使酶失活,即得cDNA第一链.之后分别进行PCR退火温度、引物浓度、镁离子浓度和模板浓度优化实验.根据优化的条件,进行95预变性5min;95变性30s,5560(因目的基因而异)退火30s,72延伸30s;循环数为2027个(因目的基因而异),最后72延伸5min,CIPK14(F:576599bp,R:10381017bp)和胁迫相关基因引物见表1.反应结束后,取16L PCR反应液,在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳.每个实验的RT-PCR反应至少重复3次,以持家基因Actin(ACT2)的PCR产物作为分子内标,用定量软件Image J(.nih/ij/)计算所检测基因的相对水平.1.3CIPK14T-DNA插入突变体的筛选和PCR分析本研究从美国Salk研究院遗传分析实验室(Salk InstituteGenomic AnalysisLabratory)购买了2组CIPK14T-DNA插入突变体SALK_009699和SALK_147899.根据ATIDB(The Arabidopsisthaliana Inte-grated Database)提供的信息,分别确定了每个突变系T-DNA插入的具体位置.并根据插入位点分别设计引物R,F(表2),结合ATIDB提供的T-DNA左边界筛选引物R0进行纯合子的筛选.筛选得到的各突变株系纯合子继续做表型分析及RNA表达分析.1.4下胚轴和根伸长分析拟南芥种子用70%的乙醇表面灭菌1min,30%次氯酸钠灭菌10min,然后用无菌水冲洗5次,播种于含0.8%琼脂的MS培养基中,4春化4天后置于23全日照培养.培养6天后统计幼苗的下胚轴和根的长度.ABA胁迫下根伸长的分析:将3天苗龄的突变体和野生型幼苗分别移栽到含0,20,30,40mol/L ABA的MS培养基上培养12天,然后比较两者的根长.结果取3次独立实验的平均值标准误差.1.5外源钙处理光照培养3周后的野生型(col-4)和CIPK14突变体(cipk14)植株,分别浸泡于含0.25mol/L ABA或125mmol/L NaCl的不同浓度(0,0.1,1,10,100mmol/L)秦玉芝等:钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节448表1RT-PCR中的引物基因引物序列a)Actin F:5-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3R:5-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3CIPK14F:5-CAAAGTCTCCAAGGGCAGGTTCT-3R:5-CGTCTGCGGATTCGTGTCTAAAA-3RD29A F:5-GCGGGAACTGTTGATGAG-3R:5-ACCAAACCAGCCAGATGA-3RD29B F:5-AAGGAGACGCAACAAGGG-3R:5-ACGGTGGTGCCAAGTGAT-3RD22F:5-TTCGGAAAAGCGGAGAT-3R:5-CTTTGAAGGCCAAGTGGT-3RAB18F:5-GAATGCTTCACCGCTCCG-3R:5-ACGACCGAATGCGACTGC-3KIN1F:5-CGCTGGCAAAGCTGAGGA-3R:5-TTCGGATCGACTTATGTATCGT-3KIN2F:5-CTGGCAAAGCTGAGGAGA-3R:5-CGTAGTACATCTAAAGGGAG-3DREB1A F:5-GGCGGGTCGTAAGAAGTT-3R:5-GATCCGTCGTCGCATCAC-3DREB2A F:5-CTGTTGAGACTCCTGGTT-3R:5-GAGGTATTCCGTAGTTGA-3SOS2F:5-CTACAAAAGCAGTGCAGTGT-3R:5-CTACCTTTTGTGAAGTCCTCC-3a)F(Forward primer):正向引物;R(Reverse primer):反向引物表2CIPK14T-DNA插入突变体筛选中的引物基因引物序列a)位点R05-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3SALK_009699F:5-CAAAGTCTCCAAGGGCAGGTTCT-3R:5-GTCTGCGGATTCGTGTCTAAAA-3176198bp390370bp SALK_147899F:5-AGGTCCTCGCCACCAAATCCAA-3R:5-CCGGCGTACCACAGAGTGTGTG-3509531bp805784bp a)F(Forward primer):正向引物;R(Reverse primer):反向引物CaCl2溶液中,30h后收材料,并立即进行液氮速冻,保存于?80冰箱备用.将约100粒野生型和突变体种子分区播入含0.45mol/L ABA或150mmol/L NaCl并同时含不同浓度(0,0.1,1,10,50mmol/L)钙离子的MS培养皿中,设置对照.4春化4天后置于23长日照培养,光照培养6天统计萌发率.胁迫条件下根伸长实验:种子消毒后播种在MS培养基上,4春化4天后光照培养,2天后移栽到含0.15mol/L ABA的MS培养基上,相同条件下培养1周后测量根的长度并照相.2结果2.1拟南芥CIPK14基因的时空表达特异性分析表达的组织特异性和时间性可以为研究基因的功能提供很好的线索.本实验首先对CIPK14在拟南芥不同部位和不同生长发育期的表达情况进行研究.通过收集拟南芥的种子、胚胎期、子叶期、2片真叶期、抽薹初期及开花期植株的材料和成熟植株各部位包括:根、茎、莲座叶、茎生叶、花和幼果荚提取总RNA进行RT-PCR分析.结果表明:拟南芥花器官中的CIPK14表达量最高,约为莲座叶的3倍左右,其次是根部;而果荚、茎和营养叶中表达量较低(图1(a).另外子叶期、2片真叶期直到抽薹初期一直是CIPK14表达的高峰时期,即CIPK14主要在拟南芥幼苗生长期表达(图1(a).研究同时发现,高浓度的盐和ABA能够诱导CIPK14基因的强烈表达,并且表达量随着处理时间的增加而显著提高(图1(b).2.2拟南芥CIPK14T-DNA插入突变体分子鉴定与纯合子筛选CIPK14基因(TAIR:At5g01820,GI:831765)全长1.8kb,仅由1个外显子构成.为了进一步研究CIPK14基因的功能,本研究从美国Salk研究院遗传中国科学C辑:生命科学xx年第38卷第5期449分析实验室购2组CIPK14T-DNA插入突变体SALK_009699和SALK_147899.根据ATIDB(The Arabidopsisthaliana IntegratedDatabase)提供的信息,分别确定了每个突变系T-DNA插入的具体位置(图2(a).并根据插入位点分别设计引物R,F,结合ATIDB提供的T-DNA左边界筛选引物R0进行纯合子的筛选.购买来的种子经消毒后播种于含卡那霉素40g/mL MS固体培养基上,待成活的幼苗长出46片真叶时,提取DNA进行T-DNA插入位置的PCR鉴定.筛选出SALK_009699的6个纯合子1个杂合子,SALK_147899的3个杂合子(图2(b).接着提取经过鉴定的株系的总RNA进行RT-PCR分析,结果表明突变体中CIPK14基因的表达受到抑制(图2(c).最图1CIPK14基因的表达模式(a)收集拟南芥的种子、胚胎期、子叶期、2片真叶期、抽薹初期及开花期植株的材料,以及成熟植株各部位(根、茎、莲座叶、茎生叶、花和幼果荚)提取总RNA进行RT-PCR分析.RT-PCR分别使用CIPK14和Actin特异引物,电泳图的上方是相应的柱状图,RNA的表达量为CIPK14/Actin的相对强度.R示根;ST示茎;RL示莲座叶;CL示茎生叶;F示花;SI示果;S示种子;E示胚胎期;C示子叶期;TL示两片真叶期;BF示花前期;FS示开花期.(b)将3周苗龄的野生型植株分别用100mol/L ABA和300mmol/L NaCl处理,按处理时间的长短不同收取材料,提取总RNA,RT-PCR分析植株CIPK14基因的表达情况.图中数字表示处理时间,电泳图的下方是相应的曲线图,RNA的表达量为CIPK14/Actin的相对强度秦玉芝等:钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节450图2CIPK14插入突变体的分离与鉴定(a)拟南芥CIPK14基因的示意图.黑色方框表示外显子.三角形指示T-DNA插入位点,数字表示核苷酸数.LB:左边界;RB:右边界;(b)cipk14突变体纯合子鉴定,提取基因组DNA,用位于插入位点两侧的引物(RF,每组左侧加样孔样品)和ATIDB提供的T-DNA左边界筛选引物(FR0,每组右侧加样孔样品)进行PCR,其中SALK_009699的1,4,5,6,7,8号鉴定为纯合子,2号鉴定为杂合子,3号鉴定为野生型;SALK_147899的2,3,4号鉴定为杂合子,1号鉴定为野生型.(c)提取总RNA,用CIPK14(上)和Actin2(下)特异的引物进行RT-PCR鉴定cipk14突变体纯合子.(d)正常白光下生长15天苗期长势.(e)50molm?2s?1连续白光下培养6天的拟南芥野生型和cipk14突变体下胚轴长度和根长度的比较后收集各突变株系纯合子种子用于做表型分析及后续研究.研究中2组突变体都用于每种处理的预实验,详尽的研究和最终数据采用SALK_009699(在下文统一命名为cipk14突变体)株系得到.在本研究中,正常栽培条件下cipk14突变体苗期的长势稍差于野生型(图2(d),主要表现为下胚轴和根的长度比野生型短(图2(e),这一结果刚好与CIPK14主要在苗期表达的特征相符合.成熟期CIPK14的T-DNA插入突变体在外部表型上与野生型没有明显的差别.2.3CIPK14调节拟南芥胁迫应答基因的表达由于正常条件下cipk14突变体除了苗期的长势稍差于野生型外(图2(d),成熟期在外部形态上与野生型没有明显的差别.而前面的实验证实了CIPK14能被ABA和盐胁迫强烈诱导,预示着CIPK14可能在拟南芥ABA和胁迫应答中起作用.为了从分子水平上研究CIPK14突变是否引起拟南芥特定胁迫应答信号途径的变化,本实验运用RT-PCR的方法比较了胁迫条件下野生型和cipk14突变体中一系列受到盐、ABA、冷和干旱强烈诱导的胁迫应答基因,包括:RD29A,RD29B,KIN1/2,AB18和DREB等表达的变化情况.和之前的报道一样1417,野生型内所有被检测的标记基因都显著地受ABA,NaCl诱导表达,并且野生型col-4和cipk14突变体之间存在明显差异(图3).ABA处理后?野生型和cipk14突变体中的RD29B在诱导的前4h都处于较低的转录水平,在处理的第6h升高到最大值,此时野生型中RD29B表达量的增加幅度显著高于突变体.ABA作用6h后野生型中RAB18表达量是cipk14突变中国科学C辑:生命科学xx年第38卷第5期451体中的2倍.与野生型相比,相同条件下KIN在cipk14突变体中的转录水平下降了40%(图3(b).RD29B在盐胁迫下的表达趋势与ABA胁迫下基本相同,只是盐胁迫下的第6h野生型与突变体中RD29B的表达量差距达到5倍(图3(d).另外突变体中KIN1/KIN2的诱导峰值比野生型推迟2h出现.转录因子CBFs/DREBs通过识别结合RD29A和KIN1/KIN2基因启动子部位cis-因子(CRE/DRE)调节RD29A和KIN1/KIN2基因的表达17,18.编码CBFs/DREBs转录因子的基因本身就是胁迫相关基因,同样受到盐和ABA的诱导.本研究也证实了这一点.ABA诱导仅1h突变体和野生型中DREB1A/DREB2A的表达量就达到了峰值,虽然突变体中DREB1A/DREB2A的整体转录水平不到野生型的45%,ABA诱导2h后转录呈下降趋势(图3(b).这一发现再一次说明DREB类蛋白是RD/KIN基因的转录激活因子.图3ABA和盐胁胁迫下野生型col-4与cipk14突变体植株中胁迫应答基因的表达(a)将15天苗龄的野生型col-4与cipk14突变体植株分别用100mol/L ABA处理,按处理时间的长短不同收取材料,提取总RNA,RT-PCR分析植株胁迫应答基因的表达情况.(b)相应的柱状图,RNA的表达量为CIPK14/Actin的相对强度.(c)将15天苗龄的野生型col-4与cipk14突变体植株分别用300mmol/L NaCl处理,按处理时间的长短不同收取材料,提取总RNA,RT-PCR分析植株胁迫应答基因的表达情况.(d)相应的柱状图,RNA的表达量为CIPK14/Actin的相对强度.结果取3次独立实验的平均值标准误差秦玉芝等:钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节452不同的是,盐胁迫下突变体中DREB1A/DREB2A的诱导峰值比野生型延迟4h出现(图3(d).有趣的是在ABA和盐诱导下,cipk14突变体中SOS2/SOS3的表达量与野生型相比也显著降低(平均减少量达到60%)(图3),这一结果预示着CIPK14可能参与拟南芥SOS2/SOS3相关胁迫信号途径的调节作用.2.4拟南芥cipk14突变体对胁迫的敏感性分析为了进一步证实CIPK14基因在拟南芥胁迫/ABA信号传导途径中的作用,从表型上分析了cipk14突变体对胁迫的敏感性.将cipk14突变体和野生型col-4的种子同时播种在含不同浓度梯度ABA,盐(NaCl),葡萄糖(Glucose)和甘露醇(Mannitol)的同一MS培养基上进行全日照培养,连续6天统计萌发率和观察幼苗生长情况.结果表明,cipk14突变体对所有测试胁迫条件敏感,胁迫作用下突变体的萌发要比野生型延迟23天(图4(b).在含0.35mol/L ABA的培养基中,突变体的萌发严重受阻,光照培养的第6天,野生型的萌发率为93%,而突变体只有45%.150mmol/L NaCl培养基条件下,光照培养的第2天野生型的萌发率就达到35%,而突变体延迟4天才接近这个萌发率(图4(b);第6天野生型的萌发率达到89%.另外,突变体对6%葡萄糖的反应与野生型相似,而0.25mol/L甘露醇几乎完全抑制cipk14的萌发(相同条件下野生型的萌发率为25%)(图4).为了分析盐、葡萄糖和甘露醇胁迫下cipk14突变体萌发受阻是否与植株体内ABA代谢发生变化有关.将ABA合成抑制剂哒草伏12,19加入含各种渗透剂的MS培养基中,在普通MS培养基中加入哒草伏后突变体与野生型的萌发率都没有受到影响.然而,在含盐的培养基中加入ABA合成抑制剂则部分恢复了突变体的表型(与盐胁迫对照相比突变体的萌发率提高了4倍).相反在6%葡萄糖和0.25mol/L甘露醇中加入哒草伏没有恢复突变体的表型(图4(c),预示着CIPK14同时还可能参与除ABA相关信号途径以外的其他胁迫信号途径.鉴于cipk14突变体的种子萌发对ABA,NaCl,葡萄糖和甘露醇敏感,我们接着检测突变体根系伸长对ABA的敏感性.将2天苗龄的突变体和野生型幼苗分别移栽到含0,20,30,40mol/L ABA的MS培养基上培养2周,然后比较两者的根长.结果表明,突变体的根系伸长对外源ABA较敏感(图4(d).2.5外源钙对CIPK14基因转录水平的影响Ca2+作为胞内信号分子在许多植物激素信号传导途径中起作用.越来越多的证据说明Ca2+是胁迫和ABA信号传导途径中的第二信使.保卫细胞内的Ca2+在ABA应答过程中出现增高和降低的反复波动,出现所谓的Ca2+钟摆效应调节作用20.不同个体CBLs的钙亲和力有较大差异,CBL/CIPK互作和酶活性对钙的依赖性也各不相同.钙依赖的CBL/CIPK互作研究得还不够详尽.为了分析CIPK14在胁迫应答过程中的钙依赖性,将15天苗龄的野生型和突变体植株处于不同外源钙条件下的ABA(0.25mol/L)和盐胁迫(125mmol/L NaCl)中,分析2种株系中CIPK14的表达情况.结果发现,非胁迫条件下外源钙浓度低于0.1mmol/L或者达到100mmol/L时CIPK14都能被强烈诱导表达,说明CIPK14的功能是钙依赖性的(图5(a).有趣的是,较高的Ca2+浓度都能加强ABA胁迫信号,相反极端浓度,尤其是低浓度Ca2+条件下CIPK14对盐胁迫更敏感.说明CIPK14在ABA和盐胁迫应答中是钙依赖性的(图5(b).ABA和盐胁迫下给予不同浓度的外源钙处理,分析cipk14突变体中胁迫应答基因的表达情况,有助于进一步阐明CIPK14在胁迫信号传导中的钙调节属性.研究发现,野生型中RD29A的表达情况与CIPK14相似,而突变体中RD29A的转录都维持在较低水平.同时由于CIPK14功能缺失导致ABA胁迫下RD29A对钙的敏感性降低;盐胁迫下RD29A对低浓度和高浓度的钙离子都很敏感.这一结果进一步支持了CIPK14在ABA和盐胁迫应答中是钙依赖性的推断(图5(a).2.6ABA和盐胁迫下拟南芥cipk14突变体种子萌发和根伸长对外源钙的敏感性分析为了进一步了解CIPK14基因缺失是否影响拟南芥钙依赖性胁迫应答反应,继续对在ABA和盐胁迫条件下,拟南芥cipk14突变体种子萌发和根伸长对外源钙离子的敏感性进行了分析.研究发现,非胁迫条中国科学C辑:生命科学xx年第38卷第5期453图4cipk14突变体对ABA和渗透胁迫敏感(a)col-4和cipk14突变体在分别含0.35mol/L ABA,6%葡萄糖,150mmol/L NaCl?0.25mol/L甘露醇的MS培养基中的萌发情况,23连续光照培养6天时的照片.(b)不同胁迫条件下转入光照培养后连续6天的萌发率统计图.(c)ABA合成抑制剂百草伏恢复突变体对胁迫的敏感表型.图为处理6天后的统计结果.NFZ:百草伏.(d)将光照培养2天的突变体和野生型幼苗分别移栽到含0,20,30,40mol/L ABA的MS培养基上继续培养2周后测量根长并进行分析统计.结果取3次独立实验的平均值标准误差秦玉芝等:钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节454件下cipk14突变体种子的萌发受到外源钙离子浓度的影响不大(图6(a),光照培养6天以后,cipk14突变体种子在各种钙离子浓度下的萌发率相当.野生型种子在钙离子浓度低于1mmol/L(0.1,0mmol/L)或高于10mmol/L(50mmol/L)的条件下光照培养23天后才开始萌动.有趣的是,当不同的钙离子浓度条件下加上0.45mol/L ABA后,在含1,10和50mmol/L Ca2+的培养基中,野生型光照培养6天以后的萌发率分别为图5ABA和盐胁迫条件下CIPK14和胁迫应答基因的表达受外源钙的影响(a)RT-PCR分析0.25mol/L ABA和125mmol/L NaCl胁迫条件下不同外源钙(0,0.1,1,10,100mmol/L)对CIPK14基因表达的影响.(b)比较分析野生型和突变体经0.25mol/L ABA和125mmol/L NaCl胁迫条件下不同外源钙(0,0.1,1,10,100mmol/L)处理30h后,RT-PCR分析RD29A的表达情况.Actin作为分子内标图6ABA和盐胁迫下拟南芥cipk14突变体种子萌发和根伸长对外源钙的敏感性分析(a)将野生型和突变体的种子播种在含不同钙离子浓度并分别含0.45mol/L ABA和150mmol/L NaCl的MS培养基中同时设置对照,光照培养6天统计萌发率.(b)将野生型和突变体的种子播种在含0.15mol/L ABA和不同钙离子浓度的MS培养基中光照培养6天统计主根长度.结果取3次独立实验的平均值标准误差中国科学C辑:生命科学xx年第38卷第5期45562%,45%和24%;含0和0.1mmol/L Ca2+培养基中的萌发率为32.3%和54%(图6(a).这一结果正好与同一条件下CIPK14基因的表达变化趋势相似,说明较高或较低的钙离子浓度下拟南芥对ABA胁迫信号的敏感性增加.不同的是cipk14突变体的萌发率都维持在45%55%之间.这一现象可能是由于Ca2+的钟摆效应影响到拟南芥苗期CIPK14对ABA胁迫应答的结果.在150mmol/L NaCl处理下当Ca2+浓度低于1mmol/L时,野生型种子几乎不萌发(图6(a),少数萌发的突变体和野生型种子都不能最后成苗.这与之前的报道21,22和本研究结果极其一致:增加外源Ca2+能减低NaCl的毒性.我们同时比较了含0.15mol/L ABA和不同钙离子浓度的MS培养基中野生型和突变体根伸长情况.图6(b)结果支持CIPK14在ABA和盐胁迫应答中是钙依赖性的结论,与cipk14突变体相比,野生型根系伸长对外源低浓度钙离子更敏感.3讨论许多细胞外信号包括光、生物因子、非生物胁迫因子等都能引起植物内源Ca2+离子浓度的变化2325.分子生物学研究发现,ABA依赖的信号途径和不依赖ABA的信号途径之间往往可以通过一些特定的信号分子相互联系在一起26,27.钙离子是目前已经被广泛认可的能介导这种互作的信号分子.人们在分析特定的胁迫信号时,经常会去关注这个信号是否能引起胞内Ca2+浓度变化?还是会受到Ca2+信号的调控.处于Ca2+信号下游的因子往往能影响到胞内Ca2+的释放.如保卫细胞在进行ABA应答时胞内会发生Ca2+浓度升高与下降频繁交替出现的特异现象,也就是所谓的Ca2+钟摆效应-信号输出的主要调节方式20,28.通过对拟南芥不同组织器官以及不同生长发育期CIPK14基因表达特异性分析,发现CIPK14基因在花器中的转录水平最高,根部次之.生长过程中苗期检测到高通量CIPK14基因的表达,结合cipk14突变体幼苗生长滞后的外部表型,推测CIPK14可能与拟南芥早期发育及根伸长有关.CIPK14是否与开花相关联还有待进一步研究.通过分析ABA(100mol/L)和盐(300mmol/L)胁迫条件下拟南芥野生型中CIPK14基因的表达情况,发现CIPK14的转录水平在胁迫处理后2h便迅速增加,并随处理时间延长不断提高.说明CIPK14基因的转录受到环境胁迫的诱导;DREB1A/DREB2A作为COR/RD/KIN类基因的转录激活因子本身也是胁迫应答基因,有趣的是,ABA胁迫下它们的转录水平也因为CIPK14基因的功能缺失而降低.RA29A,RD29B和RAB18的启动子部位都含有ABRE调节元件2931,能被ABA诱导表达.研究中比较CIPK14T-DNA插入突变体和野生型经ABA和盐处理后RA29A,RD29B,RAB18的表达情况发现,这些基因的转录水平全都不同程度地降低或表达滞后.另外,RD22受到MYC/MYB类转录因子调控32,33,同样盐胁迫下突变体中RD22的表达也受到影响.以上结果显示CIPK14可能位于胁迫相关基因转录调节因子的上游,与特异性转录调节因子的活化有关.之后通过比较在各种不同浓度渗透剂(NaCl,ABA,蔗糖,葡萄糖,果糖,甘露醇)处理下突变体和野生型的种子萌发和根伸长情况发现,CIPK14突变体的种子萌发和根伸长对各种渗透胁迫敏感,并且ABA合成抑制剂白草伏(Norflurazon)能部分恢复突变体的对ABA、盐等的敏感表型.进一步证实CIPK14是胁迫应答相关基因.为了确定CIPK14激酶活性是否受到胞内钙离子浓度的影响,通过考察外源钙对CIPK14基因表达的影响发现,CIPK14的转录受到极端浓度下外源钙的激活,说明外源钙调节CIPK14基因的表达;进一步比较CIPK14T-DNA插入突变体和野生型在0.25mol/L ABA或125mmol/L盐胁迫条件下,处于不同浓度的外源钙离子处理30h,之后分析胁迫应答基因RD24A的表达情况发现,突变体中RD29A基因的表达量受钙影响程度明显低于野生型,说明CIPK14基因功能缺失使得受钙调节的胁迫相关基因对钙的敏感性降低.同时突变体种子萌发和根伸长与野生型相比对外源钙离子的敏感性也相应降低,胁迫条件下施与不同浓度的外源钙离子处理后,突变体种子的萌发率维持在45%55%之间的范围内,相反,NaCl处理下Ca2+浓度低于1mmol/L时野生型种子几乎不萌发.进一步说明CIPK14基因接受钙信号调节,激活胁迫相关转录因子,作用于拟南芥胁迫应答信号途径.秦玉芝等:钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节456致谢感谢林辰涛教授(University ofCalifornia,Los Angeles,USA)对该研究工作的全力支持与悉心指导?感谢何跃辉博士(National Universityof Singapore,Singapore)和邓子牛博士(湖南农业大学)在英文撰写方面的热情帮助!参考文献1Shi JR,Kim KN,Ritz O,et al.Novel proteinkinases associatedwith calcineurin B-like calcium sensors in Arabidopsis.Plant Cell,1999,11:239324052Harmon AC,Gribskov M,Harper JF.CDPKs:A kinasefor everyCa2+signal?Trends PlantSci,2000,5:1541593Zielinski RE.Calmodulin andcalmodulin-binding proteinsin plants.Annu RevPlant Physiol Plant MolBiol,1998,49:6977254Albrecht V,Ritz O,Linder S,et al.The NAFdomain definesa novelprotein-protein interactionmodule conservedin Ca2+-regulated kinases.EMBO J,xx,20:105110635Luan S,Kudla 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