研究工作总结及技术总结.doc

研究工作总结一、任务来源本课题任务来源于2006年广西科学基金项目资助课题联合用药治疗外伤性增生性玻璃体视网膜病变的试验研究（项目批准号:桂科自0640191）。二、研究背景增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是指眼穿通伤、眼内出血、孔源性视网膜脱离及视网膜复位手术后，由于玻璃体内及视网膜表面的细胞增生和收缩，造成牵引性视网膜脱离的一种严重眼病。PVR 形成的条件是血-眼屏障破坏，导致视网膜色素上皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞等在细胞因子及细胞外基质的作用下，迁移至视网膜表面及玻璃体腔，增殖附着于一切可能界面，并发生收缩，最终造成牵引性视网膜脱离导致失明。目前治疗PVR主要通过手术，但由于手术自身的局限性，手术后仍然有相当比例的PVR再发生致使手术失败。通过药物阻止视网膜色素上皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞在玻璃体腔移行和增殖，从而达到控制PVR 的发生发展逐渐成为眼科学界的共识。为此，国内外眼科学者正致力寻找抑制PVR的药物。目前，利用药物抑制PVR发生、发展的研究已成为眼科学研究的一大热点。不过，由于目前治疗PVR的药物种类和疗效尚无明确的、达成一致的结果，仍需多中心、随机化、大样本的进一步研究。综观近年来治疗PVR的药物，主要集中在以下几类药物：（1）皮质类固醇。多个研究表明1- 4在玻璃体切割术中玻璃体腔内注射去炎舒松,长期随访发现眼内炎发生率和视网膜脱离复发率均降低。（2）抗代谢药物。Hueber A 5发现柔红霉素可诱导RPE细胞凋亡，从而降低PVR的发生发展。（3）维生素类及其衍生物。阎晓然6利用全反式维甲酸缓释系统植入兔眼玻璃体腔，结果发现含量为650ug和1070ug的全反式维甲酸可有效预防术后PVR发生。（4）钙通道拮抗剂和钙调蛋白拮抗剂。胡正等7研究发现维拉帕米具有明显的抑制RPE 的增殖作用，10mol/L浓度维拉帕米能使视网膜色素上皮细胞增殖率显著下降、以及延迟PVR发生。（5）抑制纤维素生成的药物。Lane等8发现在玻璃体切割术的灌注液中加入5 103 U /L低分子量肝素可明显抑制术后纤维蛋白的生成，对PVR 的防治有一定意义。（6）抑制细胞外基质合成的药物。Yasukawa T等9发现曲尼司特可抑制细胞外基质合成，抑制兔实验性PVR的形成。（7）细胞信号转导抑制剂。Zheng等10报道血小板源性的生长因子受体激酶抑制剂AG1295在体内可抑制实验性PVR的发生。随着对PVR认识的提高，眼科学者逐渐认识到由于PVR发生的多因素性，病理过程的多时相，单一用药效果必然有限。根据病理时相联合用药，更能提高药物治疗PVR的防治效果以及降低药物的毒副作用。目前玻璃体腔联合用药治疗PVR主要表现在（1）5-氟尿嘧啶（5-fu）与肝素的联合用药：Scheer S等11研究认为5-FU及肝素联合应用进行玻璃体内灌注治疗C1级以上PVR安全有效。我国张少冲等12在临床试验中，配置浓度为低分子肝素5IUm1+0.25mgm1的5-FU作为PVR手术灌注液来观察联合用药对防治玻切术后PVR的效果。研究结果显示，治疗组术后PVR明显低于对照组。（2）5-氟尿嘧啶（5-fu）与糖皮质激素类联合用药：Cardillo等13将5-FU与糖皮质激素类药物以共价键相连接,制成缓释制剂,并将其植入玻璃体内观察疗效。发现PVR严重程度和牵拉性视网膜脱离的发生率均显著低于对照组。（3）TPA、肝素和高三尖山酯碱的联合应用：梅妍等14在PVR术后将三种药物注入患者玻璃体腔内。结果显示可以有效地抑制术后PVR形成，降低视网膜脱离的发生率。（4）阿霉素与地塞米松联合用药：荣翱15使用阿霉素1.25ug+地塞米松50ug玻璃体腔内注射。结果发现，药物确实能有效地抑制玻璃体及视网膜表面的增生反应。不过，由于目前联合用药多集中在抗代谢药物与皮质类固醇、抗纤维化药物的联合用药上，而抗代谢药物有有一定的毒副作用，所以寻找安全、高效的抗PVR药物有重要的临床意义。我国生产的蛇毒降纤酶是一种从蛇毒液中分离、纯化的凝血酶样酶制剂。药理上它能激发血管内皮细胞释放组织型溶纤酶原激活物，既能使血浆中纤维蛋白原含量降低，又能降解纤维连接蛋白。由于玻璃体腔的纤维连接蛋白具有促使成纤维细胞、巨噬细胞以及其他增殖细胞向玻璃体腔迁移、增殖，导致PVR产生的作用。因此，理论上蛇毒降纤酶具有抑制PVR发展的作用。我国学者证实蛇毒制剂具有抗纤维化作用16。另外，在结构上, 蛇毒制剂含有大量的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)16以及含有赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)序列17。OSHIKAWA K等18 研究发现KGD序列有与RGD序列相似的去整合素作用, 能通过与细胞表面的整合素结合抑制了细胞与细胞外基质的粘附。2002年，Smith JB19等从蛇毒液分离出来去整合素ocellatusin肽，研究发现ocellatusin肽是视网膜色素上皮细胞表面糖蛋白51很好的抑制剂。由此推测具有的去整合素肽的蛇毒制剂可能具有抑制PVR的发生、发展的作用。因此，本实验尝试采用具有去整合素和组织型纤溶酶原激活剂特点的蛇毒制剂联合皮质类固醇激素及抗代谢药物行兔玻璃体腔内用药，观察其对外伤性PVR的抑制效果、对视网膜的毒性作用及探索联合用药抑制PVR的机理，为临床玻璃体腔用药治疗PVR提供实验依据。与此同时，本实验还研究抗生素联合皮质类固醇激素治疗外伤性出血性眼球穿通伤后PVR、眼内炎症及感染等并发症的效果。文献报道：1 Sonoda KH, Enaida H, Ueno A, et al. Pars plana vitrectomy assisted by triamcinolne acetonide for refractory uveitis: a case series study J. Br J Ophthalmol, 2003, 87(8):10101014.2 Furino C, Micelli-Ferrari T, Boscia F, et al. Triamcinolone-assisted pars plana vitrectomy for proliferative vitreoretinopathy J. Retina,2003,23 (6):771776.3 Ueno A, Enaida H, Hata Y, et al. Long-term clinical outcomes and therapeutic benefits of triamcinolone-assisted pars plana vitrectomy for proliferative vitreoretinopathy: a case study J. Eur J Ophthalmol,2007,17(3):392398.4 Couch SM, Bakri SJ. Use of triamcinolone during vitrectomy surgery to visualize membranes and vitreous J. Clin Ophthalmol, 2008, 2 (4):891896.5.Hueber A, Kyje N, Esser PJ, et al. Effects of daunorubicin and CD95L on retinal function in superfused vertebrate retinaJ. J Ocul Pharmacol Ther, 2005,21(2):133138.6.阎晓然，董晓光，陈楠，等. 兔眼玻璃体腔植入维甲酸缓释系统防治增殖性玻璃体视网膜病变的药效学研究.中华眼科杂志,2003,39（1O）:621-625.7. 胡正，杨红，胡竹林，等. 维拉帕米抑制原代培养兔视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究. 同济医科大学学报,2001 30(4)：371-374.8.Lane RG, Jumper JM,NasirMA, et al. A p rospective, open-label, dose-escalating study of low molecular weight heparin during repeat vitrectomy for PVR and severe diabetic retinopathy J. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2005, 243 (7) 701 70. 9.Yasukawa T, Kimura H, Dong J, et al. Effect of tranilast on proliferation, collagen gel contraction, and transforming growth factor beta secretion of retinal pigment epithelial cells and fibroblasts J. Ophthalmic Res, 2002, 34 (4) 206 212. 10. Zheng Y, Ikuno Y,OhjM, et al. Platelet-derived growth factor receptor kinase inhibitor AG1295 and inhibition of experimental proliferative vitreoretinopathyJ. Jpn J Ophthalmo1, 2003, 47 (2) 158 165.11.Scheer S, Morel C, Poisson F, et al. Prevention of p roliferative vitreoretinopathy using 5-FU heparin: clinical tolerance and efficacy J.J FrOphthalmol, 2005,28(7):701706. 12.张少冲，李松峰，冷云霞. 等氟尿嘧啶联合低分子肝素防治增殖性玻璃体视网膜病变的临床观察.中国实用眼科杂志,2005 23（4）347-351.13.Cardillo JA, Farah ME, Mitre J, et al. An intravitreal biodegradable sustained release nap roxen and 52fluorouracil system for the treatment of experimental posttraumatic proliferative vitreoretinopathy J. Br J Ophthalmol, 2004, 88 (9)：12011205.14 .梅妍, 袁天国,汪洁,等. 组织型纤溶酶原激活剂、肝素和高三尖杉酯碱对术后增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用.中华眼底病杂志,2001；17（1）:24-25.15.荣翱，李锦文. 阿霉素联合地塞米松玻璃体内注射的临床应用.中华医学杂志，2002 82（8）：546-548.16.刘金华，魏厚仁，吕源淑，等. 蛇毒制剂对体外培养的兔结膜下成纤维细胞的影响. 中华眼科杂志，2001，37（2）：136-139.17.樊晓晖. 桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析J. 蛇志, 1996, 2(5): 21-24.18.OSHIKAWA K, TE RADA S. Ussuristatin 2, a novel KGD bearing disintegrin from Agkist rodonus suriensis venomJ. J Biol chem(Tokyo),1999, 125(1):31-35.19.Smith JB, Theakston RDG, Coelho ALJ, et al. Characterization of a monomeric disintegrin, ocellatusin, present in the venom of the Nigerian carpet viper, Echis ocellatus. FEBS Lett. 2002，512 111115.三、研究工作总结本研究从2006年05月开始至2009年05月结束，整个课题分为三个阶段。第一阶段 查资料、提出和确定项目的总体方案大量资料表明，视网膜色素上皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞等在细胞因子及细胞外基质的作用下在玻璃体腔中的增殖是PVR发生发展的中心环节，其主要变化特征为细胞增殖附着于玻璃体腔一切可能界面，并发生收缩。Yasukawa T等研究证实，抑制细胞因子和细胞外基质在增殖细胞中的作用可以抑制PVR的发生发展。OSHIKAWA K等研究发现RGD与KGD序列有去整合素作用, 能通过与细胞表面的整合素结合抑制了细胞与细胞外基质的粘附，从而抑制细胞增殖。2002年， Smith JB等在抑制视网膜色素上皮细胞增殖上取得突破性进展。他们研究发现蛇毒液ocellatusin肽是视网膜色素上皮细胞表面糖蛋白51很好的抑制剂，可以通过抑制视网膜色素上皮细胞与细胞外基质的粘附达到抑制视网膜色素上皮细胞增殖的目的。不过，利用药物通过抑制细胞因子和细胞外基质达到抑制PVR的发生发展的文献报道还很少。Smith JB虽然证实了蛇毒液ocellatusin肽可以抑制视网膜色素上皮细胞的增殖，但未进行整体动物实验，未能在动物实验上证实蛇毒液ocellatusin肽的抗PVR作用。本课题的研究内容，目前国内外未见报道。国外仅少数几篇关于蛇毒制剂抑制细胞增殖的报道，未见蛇毒制剂抑制PVR整体动物实验。本课题利用蛇毒制剂对外伤性PVR动物模型进行干预性用药，结果发现蛇毒降纤酶具有抗PVR的作用；同时证实了其抗PVR的机理部分是通过降低玻璃体腔金属蛋白酶9浓度及减少型胶原实现的。从细胞分子水平及整体动物实验探讨蛇毒制剂蛇毒降纤酶对PVR的作用，为临床上寻找针对治疗的靶点提供实验依据。第二阶段 实验研究，分为两部分（一）建立外伤性PVR动物模型，观察蛇毒降纤酶、曲安奈德和阿霉素单独或联合用药治疗外伤性PVR的效果及探讨其作用机理 方法：建立兔外伤性PVR动物模型；蛇毒降纤酶、曲安奈德和阿霉素单独或联合玻璃体腔用药；眼底镜观察玻璃体出血指数、PVR程度；酶联免疫吸附法测定玻璃体腔白介素-1（IL-1）、基质金属蛋白9（MMP-9）、血小板源性生长因子、转化生长因子1（TGF-1）、表皮生长因子（EGF）以及型胶原等细胞因子浓度。结果表明：（1）玻璃体腔注射蛇毒降纤酶可以促进玻璃体腔出血的吸收，下调玻璃体腔MMP-9浓度及型胶原浓度，降低外伤性PVR程度。蛇毒降纤酶组玻璃体出血指数为6.50.7、玻璃体腔MMP-9浓度237.4329.46 pg/ml、型胶原浓度347.5045.25 pg/ml；生理盐水组玻璃体出血指数为9.50.6、玻璃体腔MMP-9浓度为323.7147.09 pg/ml、型胶原浓度434.1745.32 pg/ml；两组比较均P0.01；蛇毒降纤酶组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.05。（2）玻璃体腔注射曲安奈德可下调玻璃体腔IL-1、TGF-1、EGF浓度，降低外伤性PVR程度。曲安奈德组玻璃体腔IL-1浓度421.53116.79pg/ml、EGF浓度17.580.39pg/ml、TGF-1浓度为48.498.17pg/ml；生理盐水组玻璃体腔IL-1浓度773.82120.67pg/ml、EGF浓度42.3513.69pg/ml、TGF-1浓度为109.7854.44pg/ml；两组比较均为P0.01。曲安奈德组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.05。（3）玻璃体腔注射阿霉素可以下调玻璃体腔IL-1、TGF-1浓度，降低外伤性PVR程度。阿霉素组玻璃体腔IL-1浓度698.6319.31pg/ml、TGF-1浓度71.356.69pg/ml；生理盐水组玻璃体腔IL-1浓度985.46101.33pg/ml、TGF-1浓度123.045.83pg/ml，两组比较均为P0.01。阿霉素组PVR程度低于生理盐水组，P0.05。 （4）玻璃体腔注射蛇毒降纤酶和曲安奈德可以促进玻璃体腔出血的吸收，下调玻璃体腔玻璃体液IL-1、MMP-9、TGF-1、型胶原浓度，降低外伤性PVR程度。蛇毒降纤酶和曲安奈德组玻璃体出血指数为6.80.4，玻璃体腔IL-1浓度636.1759.45 pg/ml，MMP-9浓度251.7921.07 pg/ml，TGF-1浓度65.539.23 pg/ml，型胶原浓度255.1752.87 pg/ml；生理盐水组玻璃体出血指数为9.50.6，玻璃体腔IL-1浓度为1059.33131.73，MMP-9浓度384.6433.22，TGF-1浓度123.1834.34 pg/ml，型胶原浓度437.4671.36 pg/ml；两组比较均为P0.01；蛇毒降纤酶和曲安奈德组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.05。（5）玻璃体腔注射蛇毒降纤酶和阿霉素组可以促进玻璃体腔出血的吸收，下调玻璃体腔玻璃体液MMP-9、TGF-1浓度，降低外伤性PVR程度。蛇毒降纤酶和阿霉素组玻璃体出血指数6.30.6，玻璃体腔MMP-9浓度293.9015.82 pg/ml，TGF-1浓度85.2411.63 pg/ml；生理盐水组玻璃体出血指数为9.50.6，玻璃体腔MMP-9浓度403.2030.64 pg/ml，TGF-1浓度111.2419.89 pg/ml，两组比较均为P0.01。蛇毒降纤酶和阿霉素组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.01。（6）玻璃体腔注射曲安奈德和阿霉素可以降低玻璃体腔EGF、MMP-9、IL-1、TGF-1浓度，降低外伤性PVR程度。曲安奈德和阿霉素组玻璃体腔EGF浓度16.8410.55 pg/ml、MMP-9浓度269.4615.17 pg/ml、IL-1浓度686.17109.45 pg/ml、TGF-1浓度42.56.95 pg/ml；生理盐水组玻璃体腔EGF浓度45.5815.74 pg/ml、MMP-9浓度384.6433.22 pg/ml、IL-1浓度959.33141.73 pg/ml、TGF-1浓度112.5834.43 pg/ml。两组比较均为P0.01。曲安奈德和阿霉素组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.01。曲安奈德和阿霉素组40%发生视网膜脱离，低于曲安奈德组（50%发生视网膜脱离）和阿霉素组（70%发生视网膜脱离）。本实验证实：（1）在外伤性PVR动物模型中，蛇毒降纤酶单独应用或联合曲安奈德、阿霉素应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过抑制与炎症、视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子和抑制细胞外基质的产生实现的。但联合用药与单一蛇毒降纤酶应用相比未能进一步降低PVR程度。（2）在外伤性PVR动物模型中，曲安奈德、阿霉素单独应用或联合应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过降低玻璃体腔内与视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子浓度实现的；联合用药比单独用药更能降低视网膜脱离率的发生。（二）建立外伤性出血性眼球穿通伤动物模型，观察曲安奈德和万古霉素玻璃体腔用药对眼内炎症、感染及外伤性PVR的治疗效果方法：建立兔外伤性出血性眼球穿通伤动物模型；随机分为生理盐水组、曲安奈德组、万古霉素组、联合用药（万古霉素+曲安奈德）组四组。观察眼前节炎症情况，眼前节炎症2级以上且持续超过1周以上者行玻璃体腔微生物学培养；眼底镜观察外伤性PVR情况；酶联免疫吸附法测定玻璃体腔细胞因子浓度。结果显示：（1）玻璃体腔注射万古霉素和曲安奈德可以降低眼前节炎症程度及眼内感染、外伤性PVR程度。万古霉素和曲安奈德组眼前节炎症程度为0.63 0.52，生理盐水组眼前节炎症程度为1.500.77；万古霉素和曲安奈德组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.01。万古霉素和曲安奈德组未发生细菌性眼内炎，生理盐水组20%发生细菌性眼内炎。（2）外伤早期玻璃体液IL-1浓度与PVR相关性分析结果显示呈正相关性，r=0.791，p=0.0050.01。本实验证实：（1）在外伤性出血性眼球穿通伤动物模型中，玻璃体腔注射曲安奈德和万古霉素能降低PVR程度和减低眼内炎症、感染发生。（2）外伤早期玻璃体腔炎性因子IL-1浓度测定可能可以预测PVR程度。第三阶段 整理资料，撰写论文通过对实验资料及数据整理，得出本课题研究结论：1、在外伤性PVR动物模型中，蛇毒降纤酶单独应用或联合曲安奈德、阿霉素应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过抑制与炎症、视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子和抑制细胞外基质的产生实现的。但联合用药与单一蛇毒降纤酶应用相比未能进一步降低PVR程度。2、在外伤性PVR动物模型中，曲安奈德、阿霉素单独应用或联合应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过降低玻璃体腔内与视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子浓度实现的；联合用药比单独用药更能降低视网膜脱离率的发生。3、在外伤性出血性眼球穿通伤动物模型中，玻璃体腔注射曲安奈德和万古霉素能降低PVR程度和减低眼内炎症、感染发生。4、在外伤性出血性眼球穿通伤动物模型中，外伤早期玻璃体腔炎性因子IL-1浓度测定可能可以预测PVR程度。本研究目前已在国内外发表论文11篇，论文均发表在国家级核心期刊，是国内外最先系统研究药物治疗外伤性PVR的单位。四、性能指标1、合同书要求的性能指标：完成2篇以上省级以上的论文。2、实际达到的性能指标：本研究的各项性能指标均超过任务合同书要求的指标，并达到预期目标。(详见技术工作总结)五、与国内外同类技术比较文献查新表明，国内荣翱使用阿霉素联合地塞米松玻璃体腔内注射治疗PVR的研究，结果发现联合药物能有效地抑制PVR的发生发展。张少冲等在临床试验中，使用肝素联合5-FU作为PVR手术灌注液来观察联合用药对防治玻切术后PVR的效果。研究结果显示治疗组术后PVR明显低于对照组。不过，国内的这些研究仅限于抗代谢药物与皮质类固醇及抗纤维化药物等传统抗PVR药物的联合应用上，未能开发出新的抗PVR的药物，亦未能就药物抗PVR的作用做机理方面的研究。研究较局限及较粗糙。国外虽然有报道利用抑制细胞外基质合成的药物抑制实验性PVR的形成以及利用细胞信号转导抑制剂抑制实验性PVR的发生，但没有做联合用药方面的研究。而联合用药抗PVR的报道均集中在抗代谢药物与皮质类固醇及抗纤维化等传统药物上。国内外均未见蛇毒制剂抗PVR的研究报道；也未见抗生素联合皮质类固醇药物治疗外伤性出血性眼球穿通伤所致PVR方面的研究。本课题组是国内外最先系统研究联合用药治疗外伤性PVR的单位。本课题立题新颖，科学性强，设计合理，技术手段先进，系统探讨蛇毒降纤酶单独或联合皮质类固醇、抗代谢药物玻璃体腔应用治疗外伤性PVR的研究以及探讨药物治疗污染伤口眼球穿通伤所致PVR效果的研究。六、新发现、新理论、新观点本研究目前已在国内外发表论文11篇，论文均发表在国家级核心期刊，是国内外最先系统研究联合用药治疗外伤性PVR的单位。本课题将PVR的临床观察方法与分子生物学技术结合，在生理学检查、病理学检查、分子生物学检查及整体水平对蛇毒降纤酶或联合抗代谢药物和皮质类固醇药物抗PVR作用及其作用机理进行研究，课题立题新颖，科学性强，设计合理，技术手段先进，实验难度大，结论可信。本研究成果表明：（1）在外伤性PVR动物模型中，蛇毒降纤酶单独应用或联合曲安奈德、阿霉素应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过抑制与炎症、视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子和抑制细胞外基质的产生实现的。但联合用药与单一蛇毒降纤酶应用相比未能进一步降低PVR程度；研究结果在国内外未见密切相关报道；（2）在外伤性PVR动物模型中，曲安奈德、阿霉素单独应用或联合应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过降低玻璃体腔内与视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子浓度实现的；联合用药比单独用药更能降低视网膜脱离率的发生。在曲安奈德和阿霉素联合用药作用机理方面在国内外未见密切相关报道；（3）在外伤性出血性眼球穿通伤动物模型中，曲安奈德和万古霉素联合用药能降低PVR程度和减低眼内炎症、感染发生，在国内外未见相关的研究报道；（4）在外伤性出血性眼球穿通伤动物模型中，外伤早期玻璃体腔炎性因子IL-1浓度测定可能可以预测PVR程度。在国内外未见相关的研究报道。本研究内容和结果大部分达到国际先进水平并处于国内领先水平。本项目的创新点如下：1、本研究在国内外首次应用蛇毒制剂对外伤性PVR进行干预性用药，结果发现蛇毒降纤酶具有抗PVR的作用；同时证实了其抗PVR的机理部分是通过降低玻璃体腔MMP-9浓度及减少型胶原实现的；2、本研究在国内外首次证实在外伤性出血性眼球穿通伤模型中，玻璃体腔注射万古霉素和曲安奈德能降低PVR程度和减低眼内炎症、感染发生； 3、本研究国内外首次证实曲安奈德联合阿霉素降低外伤性PVR程度的作用机理部分是通过降低玻璃体腔细胞因子IL-1、TGF-1、MMP-9、EGF浓度实现的；4、本研究国内外首次提出外伤早期玻璃体腔炎性因子IL-1浓度测定可能可以预测PVR程度。七、研究成果的科学水平，科学价值及发展前景本研究内容和结果达到国际先进水平（或国内领先水平）。随着2002年，Yasukawa T等发现抑制细胞外基质合成的药物曲尼司特可抑制实验性PVR的形成，抑制细胞因子和细胞外基质在增殖细胞中的作用等研究已成为PVR发病机制研究的前沿及热点。同年，Smith JB等发现从蛇毒液分离出来的去整合素ocellatusin肽可以显著地抑制视网膜色素上皮细胞表面糖蛋白51，推测ocellatusin肽可能可以通过抑制视网膜色素上皮细胞增殖达到抑制PVR的效果。而我国眼科学者刘金华则证实蛇毒制剂具有抗细胞增殖及抗纤维化作用。本课题的完成证实了蛇毒制剂蛇毒降纤酶具有抗PVR的作用，同时阐明蛇毒降纤酶抗PVR的机理部分是通过降低玻璃体腔MMP-9浓度及减少型胶原实现的。说明降低玻璃体腔MMP-9浓度和型胶原的药物可以治疗PVR。这为PVR治疗提供针对性治疗的新靶点。蛇毒降纤酶是我国从蛇毒液中分离生产的凝血酶样酶制剂。它的开发及利用将促进我国国产药物在治疗PVR方面的研究；蛇毒降纤酶抗PVR的显著效果将确保其在PVR药物治疗中占重要地位，极具临床治疗前景。（2）本研究证实曲安奈德和万古霉素联合应用能降低外伤性出血性眼球穿通伤后PVR程度和减低眼内炎症、感染发生，这是国内外首次提出抗生物联合皮质类固醇能治疗眼球穿通伤所致的PVR、炎症、感染的观点，具有重要的临床参考意义及临床应用前景。本项目的完成，有助于尽早开发、研究、应用蛇毒降纤酶在临床上治疗PVR，作为一种合理有效、价格适度的抗PVR的药物，蛇毒降纤酶可望发展为畅销的抗PVR药物，在全社会推广应用，具有广阔的市场前景。本项目的完成还为外伤性出血性眼球穿通伤的药物治疗提供用药参考及依据，并将指导临床用药，具有重要的社会效益。八、论文公开发表情况及被正面引用情况（一）研究成果（公开发表科研论文11篇）：1、玻璃体腔注射曲安奈德和万古霉素防治眼球穿通伤并发症的实验研究. 中国实用眼科杂志,2009，27（1）：44-47. 中文核心杂志2、蛇毒降纤酶联合曲安奈德治疗实验性外伤性玻璃体出血. 眼外伤职业眼病杂志,2009，31（3）：161-164. 科技核心杂志3、玻璃体腔联合用药治疗眼球穿通伤并发症的实验研究. 中国现代医学杂志. 2009，19（5）：650-653. 中文核心杂志4、蛇毒降纤酶联合阿霉素治疗实验性外伤性玻璃体视网膜病变. 中国现代医学杂志, 2009，19（7）：1007-1010. 中文核心杂志5、玻璃体腔联合用药治疗实验性外伤性玻璃体出血. 中国现代医学杂志, 2010，20（4）：519-522. 中文核心杂志6、联合用药治疗实验性外伤性增生性玻璃体视网膜病变. 实用医学杂志. 2009 ，25（20）：3397-3399. 中文核心杂志7、玻璃体腔注射曲安奈德和阿霉素防治外伤性增生性玻璃体视网膜病变的实验研究. 实用医学杂志, 2010 ，26 （4）：578-580. 中文核心杂志8、联合用药治疗实验性外伤性玻璃体出血. 时珍国医国药, 2010,21(6)：1470-1471. 中文核心杂志9、蛇毒降纤酶治疗外伤性玻璃体积血的实验研究. 珍国医国药, 2011,22 (7):1590-1592. 中文核心杂志10、曲安奈德治疗实验性外伤性玻璃体出血. 江苏医药, 2010,36（9）:1062-1064. 中文核心杂志11、阿霉素治疗实验性外伤性玻璃体出血. 江苏医药, 2010,36（15）:1796-1798. 中文核心杂志（二）公开发表科研论文被正面引用情况经CBM、CMCI、中文科技期刊数据库引文版和中国引文数据库等检索工具联合检索，委托项目相关论文在国内共计被引用2次，具体情况见检索报告。- 28 -技术研究总结本课题将PVR的临床观察方法与分子生物学技术结合，在生理学检查、病理学检查、分子生物学检查及整体水平对蛇毒降纤酶单独或联合皮质类固醇和抗代谢药物在PVR发生发展中的抑制作用及其作用机理进行研究，本课题为临床上治疗PVR寻找特异地针对治疗靶点、开发针对性地抑制PVR的药物提供实验依据，具有引人注目的临床价值。同时也为临床上PVR的防治提供新的理论基础。本项目分两部分完成：一. 建立外伤性PVR动物模型，观察蛇毒降纤酶、曲安奈德和阿霉素单独或联合用药治疗外伤性PVR的效果及探讨其作用机理1、建立兔外伤性PVR动物模型术前三天点用洛美沙星眼液，复方托品酰胺散瞳，兔肌肉内注射氯胺酮35mg/kg+氯丙嗪5/kg，分离上方93点的球结膜，在角膜缘后2mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部，勿伤及晶状体及周边视网膜，用剪刀向两侧扩大切口，切口与角膜缘平行，达8mm，轻压眼球,将脱出的玻璃体剪除，用8-0尼龙线间断缝合切口。以2ml注射器抽取兔耳动脉血1ml，玻璃体腔注入0.3ml全血。用1ml注射器按实验各组要求把药物注入玻璃体。2、实验观察内容（1）玻璃体出血指数观察根据眼底四个象限可见程度分03级，各象限级别相加，总和即为指数。0级：积血完全吸收，眼底清晰。1级：玻璃体轻度积血，眼底轻度模糊，但尚能看清。2级：玻璃体中度积血，眼底很难看清，仅可见模糊结构。3级：玻璃体重度积血，眼底窥不进。手术后每两天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录玻璃体出血指数。（2）PVR分级观察采用Fastenberg分级方法。手术后每两天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录PVR程度。 （3）玻璃体液细胞因子和胶原浓度检测手术后7、14、21、28天实验眼抽取0.1ml玻璃体液，ELISA检测细胞因子和胶原浓度。 （4）视网膜毒性评价手术后28天取离视盘下方2mm处视网膜行常规HE染色、醋酸双氧铀与枸橼酸铅双重染色后行光学和电子显微镜检查。 （5）采用SPSS10.0统计软件对数据进行处理。P0.05表示差异有统计学意义。数据分析采用t-test、ANOVA及非参数检验Mann-Whitney Test法。（3） 实验结果1、玻璃体腔注射蛇毒降纤酶可以促进玻璃体腔出血的吸收，下调玻璃体腔MMP-9浓度及型胶原浓度，降低外伤性PVR程度。蛇毒降纤酶组玻璃体出血指数为6.50.7、玻璃体腔MMP-9浓度237.4329.46 pg/ml、型胶原浓度347.5045.25 pg/ml；生理盐水组玻璃体出血指数为9.50.6、玻璃体腔MMP-9浓度为323.7147.09 pg/ml、型胶原浓度434.1745.32 pg/ml；两组比较均P0.01；蛇毒降纤酶组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.05。2、玻璃体腔注射曲安奈德可下调玻璃体腔IL-1、TGF-1、EGF浓度，降低外伤性PVR程度。曲安奈德组玻璃体腔IL-1浓度421.53116.79pg/ml、EGF浓度17.580.39pg/ml、TGF-1浓度为48.498.17pg/ml；生理盐水组玻璃体腔IL-1浓度773.82120.67pg/ml、EGF浓度42.3513.69pg/ml、TGF-1浓度为109.7854.44pg/ml；两组比较均为P0.01。曲安奈德组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.05。3、玻璃体腔注射阿霉素可以下调玻璃体腔IL-1、TGF-1浓度，降低外伤性PVR程度。阿霉素组玻璃体腔IL-1浓度698.6319.31pg/ml、TGF-1浓度71.356.69pg/ml；生理盐水组玻璃体腔IL-1浓度985.46101.33pg/ml、TGF-1浓度123.045.83pg/ml，两组比较均为P0.01。阿霉素组PVR程度低于生理盐水组，P0.05。 4、玻璃体腔注射蛇毒降纤酶和曲安奈德可以促进玻璃体腔出血的吸收，下调玻璃体腔玻璃体液IL-1、MMP-9、TGF-1、型胶原浓度，降低外伤性PVR程度。蛇毒降纤酶和曲安奈德组玻璃体出血指数为6.80.4，玻璃体腔IL-1浓度636.1759.45 pg/ml，MMP-9浓度251.7921.07 pg/ml，TGF-1浓度65.539.23 pg/ml，型胶原浓度255.1752.87 pg/ml；生理盐水组玻璃体出血指数为9.50.6，玻璃体腔IL-1浓度为1059.33131.73，MMP-9浓度384.6433.22，TGF-1浓度123.1834.34 pg/ml，型胶原浓度437.4671.36 pg/ml；两组比较均为P0.01；蛇毒降纤酶和曲安奈德组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.05。5、玻璃体腔注射蛇毒降纤酶和阿霉素组可以促进玻璃体腔出血的吸收，下调玻璃体腔玻璃体液MMP-9、TGF-1浓度，降低外伤性PVR程度。蛇毒降纤酶和阿霉素组玻璃体出血指数6.30.6，玻璃体腔MMP-9浓度293.9015.82 pg/ml，TGF-1浓度85.2411.63 pg/ml；生理盐水组玻璃体出血指数为9.50.6，玻璃体腔MMP-9浓度403.2030.64 pg/ml，TGF-1浓度111.2419.89 pg/ml，两组比较均为P0.01。蛇毒降纤酶和阿霉素组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.01。6、玻璃体腔注射曲安奈德和阿霉素可以降低玻璃体腔EGF、MMP-9、IL-1、TGF-1浓度，降低外伤性PVR程度。曲安奈德和阿霉素组玻璃体腔EGF浓度16.8410.55 pg/ml、MMP-9浓度269.4615.17 pg/ml、IL-1浓度686.17109.45 pg/ml、TGF-1浓度42.56.95 pg/ml；生理盐水组玻璃体腔EGF浓度45.5815.74 pg/ml、MMP-9浓度384.6433.22 pg/ml、IL-1浓度959.33141.73 pg/ml、TGF-1浓度112.5834.43 pg/ml。两组比较均为P0.01。曲安奈德和阿霉素组PVR程度低于生理盐水组，两组比较P0.01。曲安奈德和阿霉素组40%发生视网膜脱离，低于曲安奈德组（50%发生视网膜脱离）和阿霉素组（70%发生视网膜脱离）。本实验证实：（1）在外伤性PVR动物模型中，蛇毒降纤酶单独应用或联合曲安奈德、阿霉素应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过抑制与炎症、视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子和抑制细胞外基质的产生实现的。但联合用药与单一蛇毒降纤酶应用相比未能进一步降低PVR程度。（2）在外伤性PVR动物模型中，曲安奈德、阿霉素单独应用或联合应用均可以降低外伤性PVR程度，其作用机理部分是通过降低玻璃体腔与视网膜色素细胞增殖相关的细胞因子浓度实现的；联合用药比单独用药更能降低视网膜脱离率的发生。二. 建立外伤性出血性眼球穿通伤动物模型，观察曲安奈德和万古霉素玻璃体腔用药对眼内炎症、感染及外伤性PVR的治疗效果 （1）创立一个外伤性出血性眼球穿通伤动物模型 兔子臀部肌肉注射氯胺酮35mg/kg+氯丙嗪5/kg，1%爱尔卡因点眼，开睑器开睑，分离9:003:00点球结膜，在12:00角膜缘后2mm处用未消毒的巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部，向两侧扩大切口达6mm，将大约0.3-0.5ml脱出的玻璃体剪除,用8-0尼龙线间断缝合切口。检查眼底,排除眼内出血及视网膜脱离。以2ml注射器抽取兔耳动脉血1ml，玻璃体腔注入0.3ml全血。按实验各组要求玻璃体腔内注射药物。（2）动物分组新西兰白兔40只，重2.5-3kg，右眼为实验眼，左眼为空白对照眼。实验眼随机分为生理盐水组10眼；曲安奈德组10眼；万古霉素组10眼；联合用药（万古霉素+曲安奈德）组10眼。按实验各组要求玻璃体腔内注射药物。生理盐水组：注射生理盐水0.1ml；曲安奈德组：注射曲安奈德1.0mg（0.1ml）；万古霉素组：注射万古霉素1.0 mg （0.1 ml）；联合用药组：分别注射曲安奈德1.0mg（0.1ml）及万古霉素1.0 mg （0.1 ml）。（3）实验观察内容1、眼前节炎症：手术后1、7、14、21天使用裂隙灯显微镜观察眼前节炎症情况进行炎症分级。2、玻璃体腔中细胞因子检测手术后7、14、21、28天实验眼抽取0.1ml玻璃体液，ELISA检测其IL-1浓度。3、PVR分级：PVR分级采用Fastenberg分级方法。手术后每两天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录PVR程度。4、微生物学分析：眼前节炎症2级以上且持续超过1周以上者抽取0.1ml玻璃体液行微生物学培养。5、视网膜毒性评价：手术后28天取离视盘下方2mm处视网膜行常规HE染色、醋酸双氧铀与枸橼酸铅双重染色后行光学和电子显微镜检查。6、统计学分析：采用SPSS10.0统计软件对数据进行处理。P0.05表示差异有统计学意义。实验四组间眼前节炎症的比较、IL-1浓度的比较采用单因素方差分析，每两组间比较采用T检验，实验各组间PVR分级比较采用秩和检验。IL-1浓度与PVR相关性分析采用秩相关检验。结果表明：（1）玻璃体腔注射万古霉素和曲安奈德可以降低眼前节炎症程度、外伤性PVR程度。万古霉素和曲安奈德