T淋巴细胞提取.doc

淋巴细胞提取一 实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二 实验对象：BC 小鼠三 实验器材：1试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、 超净台四 实验步骤：1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200L的1640培养基。5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。五、注意事项：离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2l足矣。如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。 脾淋巴细胞的制备将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织（此步可省略）；将脾脏移入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS，并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心1020min；收集界面上的细胞（白色云雾层），放入89mL盛有Hanks溶液的离心管中，混匀后，以15002000rpm离心510min；吸去上清液，沉淀经反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-510*6个/mL；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100L/孔。 如何从小鼠的脾脏中提取T 淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响 摘要目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。 关键词枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞 Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng (Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First Peoples Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China) ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied. KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells 近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因1,2。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用3,4。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。 1材料与方法 1.1材料 昆明种小鼠，清洁级，68周龄，体质量（182）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度35%；型胶原酶和型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。 1.2实验动物及分组 昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献5结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 gkg1d1及1.25 gkg1d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。 1.3LBP体内抑瘤率的测定 每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死，解剖并观察肿瘤大小及重量，计算肿瘤生长抑制率：局部肿瘤的生长抑制率=（模型组平均瘤重LBP组平均瘤重）/模型组平均瘤重100%。所有动物均摘取胸腺称重，计算胸腺指数（胸腺指数小鼠胸腺质量/体质量）。 1.4肿瘤间质淋巴细胞的分离 肿瘤组织称重后，挑选瘤体质量2 g者置于含青霉素和链霉素各500 U/ml、甲硝唑5 g/ml的RPMI1640培养液中浸泡30 min后，将瘤体剪成1 mm3大小，置于含0.05% 型胶原酶、0.003% 型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培养液中，4 磁力搅拌过夜消化，200目消毒铜网过滤洗涤后，1 500 r/min离心15 min，分离获得肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL），用DHanks液洗涤2次，台盼蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度至1106/ml。 1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80流式细胞仪分析 每个样本分3管，每管中加入3105个细胞，PBS液调整总体积为100 l，其中第1管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD4、CD8a单克隆抗体0.5 l（0.25 g）、1.0 l（0.2 g），第2管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD11c、CD80单克隆抗体1.0 l（0.2 g）、1.0 l（0.5 g），第3管为空白对照管，室温避光孵育30 min，PBS液洗涤2次，每次实验取2管细胞分别加入FITC和PE单荧光素标记抗体，用流式细胞仪检测。 1.6统计学方法 所有实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，行单因素方差分析及组间比较最小显著差(least significant difference, LSD)法。 2结果 2.1LBP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺指数的影响 模型组平均瘤体质量（2.480.40）g，LBP低剂量组和高剂量组分别为（1.890.29）g和（1.460.26）g，其中，LBP高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05）。LBP低剂量组和高剂量组的肿瘤生长抑制率分别为23.79%和41.12%。模型组荷瘤小鼠的胸腺质量较正常组轻，LBP组荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数则有所恢复。见表1。 表1 LBP对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响（略） Tab 1 Effect of LBP on thymus index in H22bearing mice *P0.05, vs model control group 2.2LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群的影响 模型组肿瘤间质浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞的百分比分别为（12.891.05）%和（7.720.48）%。LBP组CD4+和CD8+细胞的百分比较模型组均有明显升高，其中LBP低剂量组CD8+与模型组比较差异有统计学意义（P0.05），LBP高剂量组CD4+、CD8+与模型组比较差异均有统计学意义（P0.05）。见表2。 2.3LBP对H22荷瘤小鼠TIL中DCs的影响 模型组TIL中CD11c+百分比为（23.072.36）%，CD80+为（15.151.47）%，双阳性细胞仅为（11.651.73）%；LBP组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比较模型组均略有升高，与CD4+、CD8+细胞百分比的升高变化有一定的平行关系，但模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组这三者之间的比较差异无统计学意义。见表2。 表2 LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群及DCs的影响（略） Tab 2 Effect of LBP on Tlymphocyte subsets and phenotypes of dendritic cells in TIL *P0.05, vs model control group 3讨论 已有研究证实：LBP具有广泛的免疫调节作用，可以增强机体的抗肿瘤效应3,4。本实验发现：LBP能明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，与文献报道一致，LBP高剂量组肿瘤生长抑制率为41.12%，与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）；LBP还可提高荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数，对胸腺具有一定的保护作用。 机体的抗肿瘤免疫主要依靠T淋巴细胞介导的细胞免疫。成熟的T淋巴细胞分为CD4+和CD8+ T淋巴细胞两个亚群。一般认为：CD4+ T淋巴细胞产生大量的细胞因子，CD8+ T淋巴细胞在CD4+ T淋巴细胞的辅助及细胞因子的作用下可以杀伤肿瘤细胞，初次的抗肿瘤免疫反应主要依赖CD8+ T淋巴细胞和自然杀伤细胞的参与。肿瘤特异性的CD4+ T淋巴细胞对肿瘤细胞也具有直接的杀伤作用6。缺乏CD4+和CD8+ T淋巴细胞，以及CD4+/CD8+比值的降低是导致抗肿瘤免疫效应低下的原因之一。一些研究还发现：LBP是一种有效的免疫增强剂，对免疫系统具有正向的调节作用。刘彦平等7用BALB/c小鼠做体内研究发现：LBP能增加小鼠脾脏总的T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞（helper T cell, Th）及抑制性T淋巴细胞（suppressor T cell, Ts）的数量，使Th和Ts亚群的比例恢复正常。有研究报道：食管癌组织中的TIL经白细胞介素2、白细胞介素4联合中药黄芪、干地黄水提取物行体外诱导后，CD3+、CD4+细胞比例及CD4+/CD8+的比值均明显上升8。本实验通过流式细胞术检测发现：模型组TIL中的T淋巴细胞数量明显减少，表明肿瘤微环境中T淋巴细胞的抗肿瘤免疫活力低下，而LBP组的CD4+、CD8+ T淋巴细胞则恢复明显，CD4+在LBP高剂量组，CD8+在LBP低、高剂量组与模型组之间的比较差异均有统计学意义，说明LBP可促进TIL中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的增殖与活化，直接杀伤肿瘤细胞，或通过其分泌的细胞因子辅助杀伤肿瘤细胞，一定程度地解除荷瘤机体的免疫抑制状态，从而产生抗肿瘤的效应。 DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫应答中起着不可替代的作用，多数证据表明，荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，而是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。有多种原因可导致荷瘤机体DCs表型的改变，是引起抗肿瘤免疫功能减弱的直接原因。Chaux等9研究发现：癌旁组织浸润的炎性细胞中主要组织相容性复合体类抗原分子高表达，而其B71（CD80）和B72（CD86）等共刺激分子则无表达或低表达；丘少鹏等10对前列腺癌肿瘤微环境中DCs细胞与T淋巴细胞之间免疫关系的研究发现：肿瘤间质中DCs占（20.896.06）%，明显低于癌旁组织中的（43.116.13）%，且与T淋巴细胞的分布显著相关，故认为癌组织中DCs数量的减少可能与前列腺癌肿瘤微环境T淋巴细胞抗肿瘤的免疫功能低下有关。LBP在体内外可促进多种细胞因子的分泌11，如白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子等，这些因子均能刺激DCs增殖及表型成熟12。CD11c强烈表达于DCs，通常采用B71、B72分子及主要组织相容性复合体类抗原分子等单克隆抗体检测DCs细胞表型及成熟程度13,14。本实验发现：模型组肿瘤间质中浸润的单个核细胞CD11c+的百分比为（23.072.36）%、CD80+为（15.151.47）%，而双阳性细胞只占（11.651.73）%，说明成熟、有功能的DCs细胞数量较低；LBP低、高剂量组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比均有所上升，与T淋巴细胞亚群的变化有一定的平行关系，但各组间的比较无统计学意义。本实验还发现：LBP可以增加肿瘤间质中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量，LBP是否可通过使DCs前体细胞增殖并诱导分化为成熟的DCs而使其具有正常的抗原提呈能力，进而激活T淋巴细胞，从而发挥抗肿瘤的作用？上述问题值得进一步研究。 因流式细胞仪的检测有一定的细胞数量要求，细胞数低于105以下时数据的准确性下降，而肿瘤间质中淋巴细胞的分离操作步骤繁琐，又有多次的洗涤过程，因此可能造成较多细胞的损伤与丢失，当肿瘤组织块太小时，更容易导致检测失败，所以只将肿瘤重量2 g者纳入检测范围，但这样就造成肿瘤体积明显减少的一部分LBP组的样本未纳入检测范围，从而可能导致结果的偏差。而LBP的抗肿瘤作用是否与其增加DCs的数量及促进其成熟有关，尚待进一步的研究。T淋巴细胞尼龙毛柱分离法 在研究体内及体外的免疫系统时，分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对B细胞的特异性抗血清，所以分离淋巴细胞中的T细胞并不是十分方便。T细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对B细胞的亲和力，从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵，而且操作简便，所需要的条件也不高，是一种非常实用的方法。(在此我向各位解释一下，现在分离T细胞的方法主要是三种，流式，磁珠法，尼龙毛法。与前两种方法相比，尼龙毛法的优势在于无需特定的设备仪器，一般的实验室均有条件操作；价格相对低廉；可以进行大量样本操作。)首先要指出的是实验中所使用的是分离T细胞专用的尼龙毛(Nylon Fiber)，不是化工上的尼龙纤维，曾经有人问过我这种问题，如果你买错了，可是做不出来的！其次，现在市面上的尼龙毛也是良隽不齐，也有同仁反应买到的尼龙毛加入缓冲液以后成了一团糨糊，根本没法使用，这个问题就要靠各位的慧眼了。现在市面上有尼龙毛填料，也已经有了商品化的尼龙毛柱子，这两者的区别主要是以下两点：1.商品化的柱子的填料量是已经定好的，有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量，也就是可以控制上样量，这对于样本量非常少，或是样本量非常大的实验需求非常合适。2.商品化的柱子已经经过了无菌处理(一般是辐射灭菌)，而自己装柱当然就要自己灭菌了。3.商品化的柱子在实验的重复性上有着绝对的优势。自己装的柱子在填料的处理和装柱的松紧等方面不容易控制，差异性的控制就看你的实验技巧了。操作方法：1.秤取1.5g尼龙毛装入20-30ml玻璃或一次性注射器内(要可以灭菌的)，填料的体积控制在15毫升左右(注射器上有标记，所以还是比较好控制的)，因为尼龙毛的松紧关系到T细胞的回收率，所以要特别注意。注射器下端配接5厘米左右长的带有弹簧夹的橡皮管。2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用铝箔包裹，并置于适当的容器内，高压灭菌15分钟。（商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略，经过无菌PBS平衡后直接进行下列步骤。）3. 灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内，顶部以铝箔覆盖，避免污染。 4. 橡皮管，弹簧夹用无水酒精消毒后接注射器下端，打开弹簧夹调节流速在大约3-4ml