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手霉素对白血病干细胞和骨髓干细胞的细胞毒作用 司一洲 (单位：山西大学工程学院。地址：太原市杏花岭区。邮编：030013)摘要：目的 探讨手霉素对白血病干细胞(LSC)的细胞毒作用。方法 采用MTT法检测手霉素对LSC的细胞增殖抑制作用，采用Annexin FITC法检测LSC细胞凋亡情况并采用流式细胞术分析细胞周期。结果 随着手霉素浓度的增高，LSC细胞增生抑制率明显增高，细胞凋亡率也逐渐增高，且阻滞于G2/M期的细胞比率明显增加。结论 手霉素通过阻滞LSC于G2/M期，促进凋亡而抑制其增长，而对正常造血干细胞(HSC)无细胞毒作用。 关键词：法尼基转移酶抑制剂;手霉素;白血病干细胞;细胞增生;细胞凋亡Abstract： Objective To probe into the cytotoxic effect of manumycin on leukemic stem cell (LSC).Methods MTT method was used to detect the inhibitory effect of manumycin on LSC proliferation.Annexin FITC method was adopted to determine LSC apoptosis to analyze cell cycle by flow cytometry.Results With the increase of manumycin concentrations，the inhibitory rate of LSC proliferation had obvious increase，the apoptosis rate also gradually increased，and the cell rate arrested in G2/M phase was significantly enhanced.Conclusions Manumycin could promote apoptosis and inhibit LSC prolieration by arresting LSC in G2/M phase，but has no cytotoxic effect on normal hemopoietic stem cell (HSC).Key words： Farnesyltransferase inhibitors;Manumycin;Leukemic stem cell (LSC);Cellular proliferation;Apoptosis原癌基因Ras家族编码是与细胞增殖和生长有关的一些重要细胞信号途径的上游产物，Ras基因突变导致Ras激活并具有致癌性，翻译后的Ras蛋白的关键环节是经法尼基转移酶的法尼基化1。此酶的抑制剂首先被用于抑制Ras突变肿瘤的治疗。手霉素作为法尼基焦膦酸脂(FPP)的模拟物，具有竞争性结合法尼基转移酶的作用，具有一定的抗肿瘤作用2。本研究拟观察手霉素对白血病干细胞(LSC)的细胞毒作用。1 资料与方法1.1 一般资料、药品与主要试剂 选择本院血液肿瘤科初诊、复发或难治急性髓系白血病(AML)患者10例，其中男6例，女4例;年龄2158(中位数39)岁。手霉素、MTT、碘化丙啶(PI)、AnnexinFITC凋亡试剂盒均购自Sigma公司。10%胎牛血清购于美国Gibco公司。1.2 LSC的分离及培养 所有患者签署知情同意书后，无菌抽取骨髓23 ml，常规方法分离单个核细胞，然后利用免疫磁珠法分离LSC细胞(CD34+CD38)。在37，5%CO2，饱和湿度的条件下，于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液中培养，23 d换液传代1次，实验用细胞处于对数生长期。1.3 MTT法检测细胞增生抑制率 取对数生长期LSC和造血干细胞(HSC)，制成2105/ml，悬浮于含2%胎牛血清的RPMI1640培养液，接种于96孔培养板，每孔200 l。LSC和HSC各孔分别加入不同浓度手霉素(0，0.5，1，2，4，8 mol/L)，对照组加入等体积溶剂二甲基亚砜(DMSO)，继续培养，分别于0，12，24，48，72 h检测。每组设置3个复孔。实验结束前4 h每孔加入5 mg/ml的MTT 20 l，温箱中继续孵育4 h后离心，去上清，每孔加入DMSO 150 l，振荡后用酶标仪进行检测，根据570 nm波长的吸光度(A值)，计算细胞增生抑制率。细胞增生抑制率(%)=(1实验组A值/对照组A值)100%。1.4 AnnexinFITC试剂盒检测细胞凋亡 取1106待测细胞用PBS液洗涤2次，用1倍Buffer重悬细胞，再将5 l的AnnexinFITC和10 l的碘化丙啶(PI)加入细胞悬液中。室温避光10 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.5 流式细胞术分析细胞周期 取1106待测细胞用PBS液洗涤2次，用70%冷乙醇固定，4冰箱过夜。用PBS洗涤过后，加入1 mg/ml RNA酶(美国Sigma公司)，37孵育10 min，再加含TritonX100(美国Santa Cruz公司)的PI(50 g/ml)染色液400 l，4避光30 min后，用流式细胞仪分析细胞周期。1.6 统计学处理 数据以xs表示，使用SPSS13.0软件进行方差分析。2 结 果2.1 手霉素对LSC和HSC的细胞增生的影响 随手霉素浓度的增加，其对LSC的增生抑制作用逐渐增大，0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mol/L手霉素对LSC的增生抑制率分别是0，(10.212.48)%，(26.732.14)%，(55.943.18)%，(60.824.98)%，(75.233.69)%，各浓度间细胞增生抑制率均有显著差异(P0.05)。且随手霉素作用时间的延长，其对LSC的增生抑制作用也逐渐增大，表现为时间剂量依赖关系，2.0 mol/L手霉素分别作用0，12，24，48，72 h后，LSC的增生抑制率分别是0，(23.414.17)%，(50.143.98)%，(62.373.59)%，(70.334.42)%。各时间点之间细胞增生抑制率均有显著差异(P0.05)。而手霉素对HSC的增生没有明显的抑制作用。2.2 手霉素对LSC凋亡的影响 2.0 mol/L手霉素分别作用0，12，24，48，72 h后，LSC的凋亡指数分别为(10.322.46)%，(11.382.97)%，(15.732.56)%，(23.572.74)%，(33.433.63)%。作用时间12和0 h之间细胞凋亡指数无明显差异，但是24，48和72 h之间存在显著差异，且与0和12 h之间也存在显著差异(均P0.05)。2.3 手霉素对LSC细胞周期的影响 2.0 mol/L手霉素分别作用0，12，24，48，72 h后，处于G2/M期的LSC比例分别为(13.253.48)%，(20.973.21)%，(45.793.72)%，(50.733.64)%，(30.433.61)%。各时间点间差异显著(均P0.05)。3 讨 论AML是一种严重的致死性疾病，尽管新的化疗药物和治疗方法能改善缓解率和生存率，50%以上的患者仍然会复发，复发的根本原因是耐药LSC的存在。因此要治愈AML就必须清除LSC。新近发展的肿瘤机制方面的治疗学肿瘤的靶向治疗具有更特异、有效、毒性小等特点，象征着肿瘤治疗模式的一次改革。目前肿瘤特异性介入治疗的靶点包括受体酪氨酸激酶、非受体激酶、细胞周期及细胞周期素依赖性激酶(CDK)、MAP激酶、蛋白酶体、血管新生分子、涉及胞外基质降解的酶、负责蛋白膜定位的酶、癌基因和抑癌基因等方面35。Ras蛋白是法尼基转移酶的重要底物之一，为膜结合型GTP/GDP结合蛋白，定位于细胞膜内侧，具有GTP酶活性，是细胞生长信号传递(包括分裂及分化信号)途径中的重要环节之一6。Ras蛋白的生物活性与法尼基化修饰有密切关系，法尼基化的Ras蛋白疏水性增高，可为细胞膜上的“接受部位”识别，定位于细胞膜上，只有法尼基化的Ras蛋白才能在细胞生长信号途径中发挥作用。Ras信号途径过度激活对肿瘤细胞的增殖、存活非常关键，这使Ras过度激活成为恶性肿瘤的主要治疗靶点之一，法尼基转移酶抑制剂通过抑制法尼基转移酶对Ras蛋白翻译后的修饰阻止肿瘤细胞的生长7,8。手霉素及其相关化合物是从链丝菌发酵培养液中发现的，分子中含有共轭多烯链、酰胺基团和环戊醇酮等手霉素族抗生素共同的结构特征，手霉素的酰胺侧链与FPP的异戊二烯基团类似，与FPP竞争性结合法尼基转移酶，特异性强且毒性弱，对多种肿瘤细胞具有中度细胞毒性，可以抑制成神经管细胞瘤、胰腺癌细胞的生长，可剂量依赖性地抑制Ras通路、抑制基质金属蛋白酶(MMP)分泌，降低转化细胞的侵袭性9。本研究结果显示手霉素可以剂量依赖性地抑制LSC的生长，且随作用时间的延长，细胞毒作用也加大。另外，对细胞凋亡及细胞周期的检测发现，手霉素通过阻滞细胞于G2/M期而增加LSC凋亡。但是手霉素对正常的HSC未发现细胞毒作用。因此，通过本研究发现，手霉素通过阻滞于G2/M期，增加LSC的凋亡而对LSC发挥细胞毒作用。参考文献（1） Chiu VK，Bivona T，Hach A，et al.Ras signaling on the endoplasmic reticulum and the GolgiJ.Nat Cell Biol，2002;4(5):34350. (2）屈凌波，郭宗儒.法尼基转移酶抑制剂的研究进展J.中国药物化学杂志,1998;8(4):30510. (3) Rotea WJ，Saad ED.Targeted drugs in oncology:new names，new mechanism，new paradigmJ.Am J HealthSyst Pharm，2003;60(12):123345.(4) Beaupre DM，Cepero E，Obeng EA，et al.R115777 induces Ras dependent apoptosis of myeloma cells via multiple intrinsic pathwaysJ.Mol Cancer Ther，2004;3(2):17986.(5 )许 民，许莲蓉，乔振华.法尼基转移酶抑制剂的抗肿瘤作用机制及临床试验进展J.国外医学输血及血液学分册，2005;28(4)：35660.(6) Gotlib J.Farnesyltransferase inhibitor therapy in acute myelogenous leukemiaJ.Curr Hematol Rep，2005;4:7784.(7) Karp